ENZIMOLOGÍA Y CINÉTICA ENZIMÁTICA. Definiciones útiles

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1 CÁTEDRA: BIOQUÍMICA Carreras: Farmacia Profesorado en Química Licenciatura en Química Licenciatura en Alimentos ENZIMOLOGÍA Y CINÉTICA ENZIMÁTICA Definiciones útiles Unidad de enzima (U): cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 mol de sustrato en producto(s) en 1 minuto de reacción bajo condiciones determinadas. Katal: cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 mol de sustrato en producto(s) en 1 segundo de reacción bajo condiciones determinadas. Actividad enzimática: generalmente el término actividad enzimática se refiere a la concentración de enzima y se expresa como U ml -1 o katal ml -1.Cuando la actividad enzimática se refiere a la cantidad de proteína se habla de actividad específica (U mg -1 de proteína o katal kg -1 de proteína). También se puede referir a la actividad total de enzima presente y en ese caso las unidades son U o katal. Índice o número de recambio (s -1 ): número de moles de sustrato transformados por segundo por mol de sitio activo. Ciclo catalítico (s): tiempo en el que transcurre un ciclo catalítico. Para resolución de tablas de purificación: Actividad total: Actividad enzimática x volumen total. Proteínas totales: Concentración de proteínas x volumen total. Rendimiento parcial (%): (Actividad total etapa / Actividad total etapa anterior) x 100. Rendimiento total (%): (Actividad total etapa / Actividad total primera etapa) x 100. Purificación parcial: Actividad específica etapa / Actividad específica etapa anterior. Purificación total: Actividad específica etapa / Actividad específica primera etapa.

2 2 ENZIMOLOGÍA PROBLEMAS 1- Sea la reacción A+B AB. Concentraciones iniciales de A y de B de 1 mm y 2 mm respectivamente llegan al equilibrio después de 45 horas de incubación. Las concentraciones en el equilibrio son [A]= 0,5mM, [B]=1,5 mm y [AB]=0,5 mm. En presencia de una enzima adecuada el equilibrio se alcanza en un minuto. Cuales serán las concentraciones alcanzadas en este caso? Cuál es el valor de la Keq en ambos casos? 2- Un extracto libre de células de Escherichia coli contiene 24 mg de proteína por mililitro. Veinte microlitros de este extracto en un volumen de incubación patrón de 0,2 ml catalizaron una reacción enzimática con una velocidad de 1,6 nmoles min -1. Calcular la actividad expresada (U ml -1 ) y la actividad específica (U mg -1 ) en la muestra. 3- Un extracto crudo libre de células contiene 20 mg de proteína por mililitro. Diez microlitros de este extracto en un volumen de reacción total de 0,5 ml catalizaron la formación de 30 nmoles de producto en un minuto en condiciones de ensayo óptimas (ph y fuerza iónica, concentraciones saturantes de todos los sustratos, coenzimas, y otros). (a) Expresar la velocidad inicial v i en mm -1 min -1. (b) Cuál será la v i si los mismos 10 µl del extracto se ensayaran en un volumen total de 1,0 ml? (c) Cuál es la actividad de la enzima en el extracto (en U ml -1 )? (d) Cuál es la actividad específica de la preparación? 4- Quince microlitros de una preparación de una enzima en un volumen de incubación de 0,2 ml catalizaron la incorporación de 0,52 µmoles de glucosa-c 14 al glucógeno en un minuto en condiciones óptimas en un ensayo patrón (a) Cuánto producto se producirá en un minuto por 150 microlitros de la preparación en las mismas condiciones de reacción? (b) Cuánto tiempo necesitarán los 150 microlitros de la preparación para producir 0,52 micromoles de producto en las mismas condiciones de ensayo? 5- Una disolución al 1% de almidón se digiere a ph 6,7 mediante 15 µg de amilasa (PM = ). La velocidad inicial máxima de liberación de maltosa es de 8,5 mg min -1. Calcular el número de recambio de dicha enzima. 6- Una enzima pura tiene una actividad específica de 120 U por mg de proteína. (a) Calcular el índice de recambio si el PM= (b) Calcular el tiempo requerido para un ciclo catalítico. 7- Un microgramo de una enzima pura (PM= 92000) catalizó una reacción a la velocidad de 0,5 µmol min -1 en condiciones óptimas. Calcular (a) la actividad específica de la enzima expresada en U mg -1 de proteína y en U mol -1, (b) el índice de recambio y (c) cuánto tiempo dura un ciclo catalítico? 8- Una preparación comercial de enzima tiene una actividad específica de 42 U por mg de proteína y contiene 12 mg de proteína por mililitro. Para corroborar

3 3 estos datos un operador ensaya una medida de actividad de la enzima en un medio de reacción de 1 ml. El método utiliza una concentración de sustrato en el medio de 30 mm y un tiempo mínimo de lectura de 1 min. El volumen mínimo de la preparación enzimática que se puede utilizar es de 5 l. (a) Puede el operador hacer el ensayo o debe diluír previamente la preparación? (b) En caso de que deba diluír y suponiendo que la enzima se descompone si lo hace, qué actitud debería tomar el operador? 9- Las -lactamasas son enzimas capaces de hidrolizar la penicilina según la reacción: penicilina + H 2 O ácido peniciloico Esta reacción puede estudiarse monitoreando el descenso de absorbancia a 230 nm (coeficiente de absorción = 1,09 mm -1 cm -1 ). Se determina la actividad de -lactamasa en una muestra cuya concentración de proteína es de 20 g ml 1 empleando penicilina a concentración saturante (1mM) en amortiguador de ph 7 y t =30C, observándose una diferencia en la absorbancia de 0,3 para un tiempo de 100 segundos. El volumen final en la cubeta de reacción es 2 ml, el camino óptico 1 cm y el volumen de muestra empleado es 15 l. Cuáles son la actividad en U ml -1 y la actividad específica de la muestra? 10- La actividad de una muestra de láctico deshidrogenasa (LDH) pura con una concentración de proteína de 2 mg ml 1 se ensayó por un método discontínuo (aparición de piruvato). Diez microlitros de la muestra se incubaron con concentraciones saturantes de lactato y NAD + en un volumen final de 3 ml. Luego de 3 minutos la reacción se detuvo por la adición de 0,5 ml de DNFH (reactivo de color). Después de 10 minutos se agregaron 1,5 ml de NaOH 0,4 N y se midió la absorbancia de la hidrazona formada a 505 nm. Se obtuvo una variación de absorbancia de 0,6. Para realizar la curva de calibración de la reacción del piruvato con la DNFH se trabajó en idénticas condiciones utilizando una solución de ácido pirúvico (PM= 88) conteniendo 4,4 mg ml -1. Los valores obtenidos se muestran en la tabla. Calcule el número de recambio de la LDH considerando que el PM de la enzima es y que posee dos sitios activos por molécula. ml de testigo 0,00 0,05 0,10 0,20 0,30 0,40 absorbancia 0,05 0,15 0,25 0,44 0,66 0, Cincuenta mililitros de un extracto libre de células que contenían 24 mg de proteína por ml del mismo y cuya actividad era de 0,08 U ml -1 se fraccionaron por precipitación con sulfato amónico. La fracción que precipitaba entre el 30% y 50% de saturación se redisolvió en un volumen total de 10 ml y se dializó. La disolución después de la diálisis ocupaba 12 ml y contenía 30 mg de proteína por ml. Veinte microlitros de la fracción purificada catalizaron la reacción de la fosforilasa con una velocidad de 5,9 nmoles min -1 en condiciones de un ensayo patrón. Calcular (a) la recuperación de la enzima y (b) el grado de purificación obtenido mediante la etapa del sulfato amónico. 12- Un extracto crudo libre de células de músculo esquelético contiene 32 mg de proteína por ml. Diez microlitros del extracto catalizaron una reacción con

4 4 una velocidad de 0,14 moles min -1 en condiciones óptimas en un ensayo patrón. Cincuenta ml del extracto se fraccionaron por precipitación con sulfato amónico. La fracción que precipitó entre el 20% y 40% de saturación se redisolvió en 10 ml. Esta solución contenía 50 mg de proteína por ml. Diez microlitros de esta fracción purificada catalizaron la reacción con una velocidad de 0,65 moles min -1. Calcular (a) el porcentaje de recuperación de enzima en la fracción purificada, y (b) el grado de purificación obtenido por el fraccionamiento. 13- Se purificó una enzima obteniéndose los datos que se indican a continuación: FRACCIÓN VOLUMEN (ml) ACTIVIDAD (U ml -1 ) PROTEÍNA (mg ml -1 ) I 1800,0 0,23 12,5 II 75,0 3,00 14,0 III 20,0 5,00 1,0 IV 1,5 40,00 0,5 Construya una tabla de purificación. 14- Con los siguientes datos confeccione una tabla de purificación para una deshidrogenasa indicando luego: (a) Cuál es la purificación total alcanzada?; (b) Cuál es la etapa individual que dio mayor purificación? (c) Cuál es el rendimiento total? (d) Analice la tabla obtenida y señale si todas las etapas empleadas están justificadas. Fundamente su respuesta. FRACCIÓN VOLUMEN (ml) A min -1 PROTEÍNA (mg ml -1 ) Extracto crudo 1000, Sulfato de amonio 20, CM-celulosa 100, Sephadex-G25 100, Coeficiente de absorción a 340 nm = 6,2 mm -1 cm La enzima gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (NADP + dependiente) cataliza la siguiente reacción: 1,3-bisfosfo-glicerato + NADPH + H + gliceraldehido-3-fosfato + NADP + + Pi Al purificar esta deshidrogenasa de A. nidulans, se obtuvieron por sonicación de células enteras 120 ml de un extracto crudo conteniendo 25 mg ml -1 de proteína y 20 U ml -1 de actividad enzimática. Posteriormente se realizó un fraccionamiento salino. La actividad enzimática se recuperó en la fracción % de saturación con sulfato de amonio, esta fracción se redisolvió en 40 ml dando una concentración de proteína de 20 mg ml -1 y una actividad de 40 U ml -1. Luego se realizó una cromatografía de afinidad con Rojo Proción (análogo de NADP + ) donde la deshidrogenasa quedó unida pudiendo ser eluída con 0,7 M NaCl, recuperándose así 5 ml con una actividad de 240 U ml -1 y una concentración de proteína 0,4 mg ml -1. Finalmente se realizó una cromatografía de

5 5 exclusión molecular en Sephacryl-S300 donde se recuperaron 6 ml y 0,2 mg ml -1 de proteína. La actividad de la enzima fue medida como consumo de NADPH, cuyo coeficiente de extinción a 340 nm es 6200 M -1 cm -1 en un volumen de reacción de 3 ml y una cubeta de 1 cm de paso de luz. El agregado de 2 L de esta última fracción produjo una disminución de absorbancia de 0,992 al cabo de 2 minutos. Construya la tabla de purificación. Indique cuál es el rendimiento y la purificación total alcanzados. Indique cuál es la etapa de mayor purificación y cuál la de mayor rendimiento. Indique si todos los pasos se justifican fundamentando su respuesta. 16- La enzima malato deshidrogenasa NADP + dependiente cataliza la reacción malato + NADP + oxalacetato + NADPH + H + A partir de 500 g de hojas de espinaca se obtuvieron 1500 ml de un extracto crudo con una concentración de proteína de 20 mg ml -1. La actividad se determinó con una alícuota de 30 microlitros midiéndose por un método continuo la aparición de NADPH a 340 nm (coeficiente de absorción del NADPH= 6200 M -1 cm -1 ) en una cubeta de 3 ml y 1 cm de camino óptico obteniéndose una variación de absorbancia para 10 minutos de 1,24. Se realizó luego una cromatorafía en DEAE celulosa recogiéndose 180 ml que contenían 10 U ml -1 de actividad enzimática y 12,5 mg ml -1 de proteína. El paso posterior fue una columna de hidroxilapatita recogiéndose 10 tubos de 4 ml c/u con actividad de deshidrogenasa. La concentración de proteína en el conjunto fue de 0,94 mg ml -1 con una actividad de 22,5 U ml -1. Como último paso se realizó una cromatografía en columna de Sepharosa 6B y se recuperó un volumen de 15 ml con una actividad de 50 U ml -1 y una concentración de proteína de 2,1 mg ml -1. En base a estos datos construya la tabla de purificación indicando además (a) cuál es la purificación y el rendimiento total alcanzados, (b) cuál es la etapa individual de mayor purificación y cuál la de mayor rendimiento, (c) señale si todas las etapas empleadas se justifican; fundamente su respuesta. 17- A partir de un extracto libre de células se intenta purificar una enzima que cataliza la reacción: M + N R + S La actividad enzimática se determina espectrofotométricamente aprovechando la propiedad del sustrato M de poseer un pico de absorbancia a 550 nm (coeficiente de extinción = 10 mm -1 cm -1 ). Esta se realiza en cubetas de 1 cm de paso de luz, en un volumen de 2 ml. En una primera etapa se realizó un fraccionamiento con sulfato de amonio. La enzima precipitó entre el 40 y el 60 % de saturación. El precipitado obtenido fue resuspendido en un buffer de fosfato de potasio 100 mm y dializado contra el mismo. En el dializado se determinó actividad enzimática obteniéndose una variación de absorbancia (A min -1 ) de 0,15. La concentración de proteína fue de 3 mg ml -1. El volumen total dializado (100 ml) fue dividido en dos volúmenes iguales. Una de las fracciones fue sometida a filtración molecular por Sephadex G-100 mientras que la otra fue sometida a una cromatografía de intercambio iónico en DEAE celulosa. Las fracciones activas provenientes de la filtración molecular rindieron una preparación de 200 ml conteniendo 0,04 mg ml -1 de proteína. Del ensayo de actividad se obtuvo un A/min= 0,03. En cambio, las fracciones activas provenientes de la cromatografía de intercambio iónico rindieron una preparación de 50 ml conteniendo 0,02 mg ml -1 de proteína y el ensayo de

6 6 actividad dió un A/min= 0,02. En todos los casos se emplearon 0,01 ml de las preparaciones correspondientes para el ensayo de actividad. (a) Calcule el rendimiento y la purificación para cada uno de los procedimientos alternativos empleados. (b) Cuál de los dos procedimientos (Sephadex o DEAE celulosa) elegiría para purificar esta enzima? Fundamente. 18- Una enzima bacteriana que metaboliza la destrucción de un antibiótico ha sido estudiada en vías de obtener un método de purificación de la misma. La enzima cataliza la destrucción del antibiótico según una reacción que puede seguirse espectrofotométricamente a 540 nm con un coeficiente de extinción de 10 mm -1 cm -1. La actividad del extracto crudo se determinó empleando una alícuota de 10 microlitros que produjo la aparición de 0,02 micromoles de producto en 5 minutos. Luego se intentaron dos protocolos de purificación a partir de un extracto crudo que tenía una concentración de proteína de 2 mg ml -1 en un volumen de 5 litros. La primera etapa, común a los dos protocolos, fue una precipitación con sulfato de amonio, etapa en la que se obtuvo un 60% de rendimiento y una purificación de 5 veces. El precipitado se redisolvió en 100 ml y con la mitad del material se realizó una cromatografía de afinidad seguida de una filtración por gel recogiéndose en esta última 25 ml con una actividad de 10 U ml -1 y una concentración de proteína de 2 mg ml -1 (método A). La otra mitad se sometió a una cromatografía de adsorción seguida de una de intercambio iónico obteniéndose un volumen de 5 ml con una actividad de 20 U ml -1 y una concentración de proteína de 1 mg ml -1 (método B). Calcule la actividad inicial del extracto crudo y las actividades finales obtenidas con cada método de purificación. Indique cuál método (A o B) emplearía para purificar la proteína y por qué. Qué actividad recuperaría a partir del volumen total inicial? 19- Un grupo de investigadores que está estudiando la enzima L-glutamato deshidrogenasa de una bacteria decide realizar la purificación de la misma. Luego de varios intentos diseña un método de purificación. En la tabla que sigue se detallan los resultados obtenidos. FRACCIÓN VOLUMEN (ml) ACTIVIDAD (U ml -1 ) PROTEÍNA (mg ml -1 ) Extracto crudo ,0 21,0 DEAE-celulosa ,0 16,0 Sulfato de amonio ,5 10,5 Sephadex-G ,0 2,5 Crom. de afinidad ,8 1,6 (a) Complete la tabla. (b) Se decide omitir uno de los pasos de purificación a partir de los datos obtenidos, cuál debería ser ese paso y por qué? Cuál fue el paso que produjo la mayor purificación y cuál el de mejor rendimiento? (c) Dicha enzima reduce -oxoglutarato a glutamato asociado a la oxidación de NADH a NAD +, lo que fue utilizado para seguir espectrofotométricamente la actividad de la enzima. En una preparación anterior 0,01 ml de enzima con una concentración de 10 mg ml -1 de proteína produjeron una variación de absorbancia de 0,125 por minuto en condiciones óptimas. Qué actividad específica tenía esa preparación? Volumen del ensayo: 1 ml; 340 NADH: 6,22 mm -1 cm -1.

7 7 20- La asparaginasa cataliza la reacción: asparagina + H 2 O aspartato + NH 3 Esta enzima es usada con fines terapéuticos en caso de leucemia. Las células tumorales en rápida división necesitan cantidades mayores de asparagina que las normales. La administración de asparaginasa reduce los niveles de asparagina disponible en los individuos enfermos, lo que reprime la viabilidad del tumor. Un laboratorio farmacéutico que desea comercializar asparaginasa le encarga que realice la purificación de la enzima del hongo Boticamyces pharmaceae. A tal fin, parte de 200 ml de un extracto crudo libre de células conteniendo 20 mg ml -1 de proteína. Para medir actividad enzimática incuba una alícuota de 10 l del extracto con el sustrato a 37C en 0,2 ml de medio de reacción, finalizándose ésta a los 5 min directamente por el agregado de 1 ml de reactivo de color para H 3 N. La lectura de absorbancia a 540 nm (descontando el blanco) en una cubeta de 1 cm de camino óptico fue de 0,44 ( para la reacción de color = 2200 M -1 cm -1 ). Luego realiza un fraccionamiento salino, recuperando la asparaginasa en la fracción % de sulfato de amonio. Al redisolver esta fracción en 20 ml del buffer de purificación Ud. recupera el 95% de actividad enzimática y 3800 mg de proteína. Luego realiza una cromatografía en columna de DEAE-celulosa y recupera 80 ml que contenían 600 U de asparaginasa (U es la cantidad de enzima que produce 1 mol de H 3 N por minuto en las condiciones de ensayo) purificada 20 veces respecto al extracto crudo. Como último paso realiza una cromatografía en columna de hidroxi-apatita de la que recupera 20 ml conteniendo 0,12 mg ml -1 de proteína y 17 U ml -1 de actividad enzimática. a- Construya la tabla de purificación y analícela, indicando la purificación y el rendimiento total alcanzados. Señale la etapa de mayor purificación y la de mayor rendimiento. b- Aconseja iniciar la preparación de la asparaginasa en gran escala usando los mismos pasos de purificación o sugiere alguna modificación? Justifique su respuesta. 21- Se purificó prácticamente a homoqeneidad la dutpasa (deoxiuridinatrifosfatasa) de Escherichia coli. Esta enzima hidroliza el dutp a dump y PPi jugando un importante rol en la biosíntesis del dttp para la replicación de DNA, ya que provee el sustrato para Ia timidilato sintetasa. Las etapas del procedimiento de purificación se indican en la siguiente tabla. Complete la tabla de purificación. FRACCIÓN VOLUMEN (ml) ACTIVIDAD (U ml -1 ) PROTEÍNA (mg/ml) I 1690,0 0, ,0 II 340,0 0, ,0 III 440,0 0, ,0 IV 196,0 0,224 4,0 V 19,0 2,420 10,5 I = sobrenadante del lisado celular, II = fraccionamiento con sulfato de amonio, III = cromatografía en DEAE celulosa, IV = cromatografía en fosfocelulosa y V= filtración en Biogel P Se realizó la purificación de la enzima glucosa-6-fosfatasa que cataliza la siguiente reacción:

8 8 glucosa-6-fosfato + H 2 0 glucosa + fosfato Se partió de 200 g de hígado bovino obteniéndose un extracto inicial de 1200 ml que tenía una concentración de proteína de 10 mg ml -1. Para medir actividad enzimática se incubó una alícuota de 50 microlitros con el sustrato a 30C en 1 ml de medio de reacción, cortándose ésta a los 10 min directamente por agregado de 2 ml de reactivo de color para fosfato. La lectura de Abs a 740 nm en una cubeta de 1 cm de camino óptico fue de 0,49 con un blanco de medida de 0,12 (el coeficiente de extinción para la reacción de color es de 3700 M - 1 cm -1 ). Se realiza luego un corte con sulfato de amonio al 50 % rescatándose la fosfatasa en el precipitado. Este precipitado fue redisuelto en un volumen de 80 ml, siendo la concentración de proteína de 21 mg ml -1 y la actividad 6,3 U ml -1. Posteriormente se realizó una cromatografía en Sephadex G-200 recogiéndose 10 tubos de 12 ml c/u con actividad enzimática. La concentración de proteína en el conjunto fue de 10,8 mg ml -1 y la actividad de 3,36 U ml -1. Como último paso se realizó una cromatografía de afinidad y se obtuvieron 20 ml de preparación con una actividad de 7,2 U ml -1 y una concentración de proteína de 0,5 mg ml -1. En base a estos datos construya la tabla de purificación e indique: a- Cuál es la purificación y el rendimiento alcanzado? b- Cuál es la etapa individual que proporcionó mayor rendimiento y cuál la de mayor purificación? c- Señale si todas las etapas empleadas se justifican. Fundamente su respuesta. 23- La piruvato carboxilasa (PCasa) es una enzima que usa biotina como cofactor catalizando la reacción: piruvato + ATP + HC0 3 oxaloacetato + ADP + Pi A fin de realizar la purificación de la PCasa de Eschericia coli Ud. parte de 300 ml de un extracto crudo libre de células conteniendo 1500 mg proteína. La actividad enzimática se midió por un método continuo determinando la producción de oxaloacetato a 272 nm ( 272 = 920 M -1 cm -1 ) a 30 C y en un volumen final de 3 ml. Utilizando 10 l del extracto crudo para medir la actividad Ud. obtiene un A = 0,46 luego de 5 min de reacción (medido en cubeta de 1 cm de camino óptico). Luego realiza un fraccionamiento salino, recuperando la PCasa en la fracción 30-50% de sulfato de amonio. Esta fracción se redisolvió en 5 ml del buffer de purificación que contenían 30 mg/ml de proteína y el 90 % de la actividad enzimática. A continuación realiza una cromatografía en columna de Sephadex G-200, recuperando 30 ml que contenían 150 mg de proteína y 270 U ml -1 (U está expresada en mol min -1 ) de actividad enzimática. Como último paso realiza una cromatografía en columna de CM-celulosa de la que recupera 45 ml conteniendo 6750 U de PCasa purificada 900 veces respecto del extracto crudo. En base a estos datos a- Construya la tabla de purificación. b- Analice la tabla indicando purificación y rendimiento total alcanzados, así como el paso de mayor purificación y el de mayor rendimiento. c- Indique si todos los pasos se justifican, explicando su respuesta

9 9 24- La enzima ureasa cataliza la siguiente reacción: urea + H 2 O 2 NH CO 2 Durante su purificación se obtuvieron 900 ml de extracto crudo con una concentración de proteína de 4 mg/ml. Un corte con sulfato de amonio dio lugar a un precipitado que se redisolvió en 150 ml de buffer obteniendo una solución con 1,6 mg ml -1 de proteína. Esta fracción se cromatografió en una columna de Sephadex G25 recolectándose 80 ml de eluato con 0,04 mg ml -1. La actividad correspondiente a las dos primeras etapas se determinó midiendo la disminución de absorbancia a 340 nm utilizando la reacción acoplada: NH cetoglutarato + NADH + H + glutamato + NAD + El agregado de 20 l de extracto crudo a 1 ml de la mezcla de reacción produjo una A = -0,800 en 4 minutos en una cubeta de 1 cm de paso óptico ( NADH = 6200 M -1 cm -1 ). Para la determinación de la actividad de la fracción de sulfato de amonio se debió emplear una dilución 1/10 de la muestra y se obtuvo un A=-0,400. La actividad de la enzima purificada se determinó por el metodo discontínuo NH fenol + hipoclorito azul de indofenol cuya curva de calibración de NH 4 + presentó una pendiente de 0,68 UA/mol NH 4 +. Se emplearon 50 l de muestra y se obtuvo una absorbancia (descontando el blanco) de 0,34 siendo el tiempo de reacción enzimática de 1 minuto. Las condiciones de la colorimetría fueron las mismas para la curva y la muestra a) Calcule las actividades (U ml -1 ) de cada etapa. b) Por qué supone que se debió diluir la muestra de la segunda etapa para la determinación de actividad? c) Realice la tabla de purificación. 25- Su profesor de Bioquímica le ha asignado como trabajo práctico para aprobar la materia que determine la masa molecular de la -lactamasa de Azospirillum lipoferum RG20. Como material de partida le provee 25 ml de un extracto crudo obtenido por sonicación de un cultivo del microorganismo en fase logarítmica de crecimiento. Mediante una búsqueda bibliográfica Ud halla la siguiente tabla de purificación: TABLA 1: Purificación de la -lactamasa de Azospirillum lipoferum RG20. ETAPA Actividad específica (U mg -1 ) Actividad total (U) Purificación (veces) Rendimiento (%) Extracto crudo 4 3, Ppción con sulfato de amonio 8 3, CM-Sephadex , Chromatografía de afinidad , La determinación de la actividad enzimática del extracto crudo empleando nitrocefina como sustrato (= M -1 cm -1 ) resultó en una variación de absorbancia de

10 10 0,32 en dos minutos cuando emplea 20 l de muestra (volumen de cubeta= 1mL, camino óptico= 1cm). Para determinar la masa molecular de la enzima realiza una electroforesis en condiciones desnaturalizantes y obtiene los resultados que se muestran. La calle A corresponde a la enzima purificada y la B a los marcadores de masa molecular: albúmina bovina sérica (67 kda), ovalbúmina (43 kda), anhidrasa carbónica (30 kda), inhibidor de tripsina (20,1 kda) y -lactalbúmina (14,4 kda). a- Cual es la actividad del extracto crudo? b- Cuántas unidades de enzima espera obtener luego de realizar la purificación? Qué actividad específica espera obtener? c- Qué masa molecular informará?. Qué otro método podría haber usado para realizar esta determinación? A B 26- Se desea purificar una deshidrogenasa de planta (Punto Isoeléctrico 3,1) a partir de 5 litros de extracto crudo. Con el propósito de poner a punto el método de purificación se ensaya un protocolo que consta de tres etapas: fraccionamiento salino (etapa 1), cromatografía de intercambio iónico (etapa 2) y cromatografía de afinidad (etapa 3). Se midió espectrofotométricamente la actividad de muestras provenientes de cada etapa empleando 5 l de muestra, en un volumen de reacción de 1 ml, durante 3 minutos a 25 ºC ( 340 = 6000 M -1.cm -1 ). Los valores de variación de absorbancia obtenidos, la concentración de proteína y los volúmenes totales se muestran en la tabla. Etapa Volumen (ml) Proteína (mg ml -1 ) A (340nm) Extracto crudo , , ,5 0, ,05 0,675 a-complete la tabla de purificación. b-indique cuál será la cantidad de enzima (U totales) y la actividad específica obtenida si purifica la enzima a partir del resto de extracto crudo.

11 11 c-explique brevemente el fundamento de la cromatografía de intercambio iónico e indique qué tipo (aniónico o catiónico) emplearía para purificar la deshidrogenasa del enunciado y a qué ph lo haría. 27- Su profesor de Bioquímica le ha asignado como trabajo práctico que purifique la -lactamasa de Azospirillum lipoferum RG20 y determine su masa molecular. Como material de partida le provee 25 ml de un extracto crudo obtenido por sonicación de un cultivo del microorganismo en fase logaritmica de crecimiento con una actividad de 8 U ml -1 y una concentración de proteína de 2 mg ml -1. Mediante una búsqueda bibliográfica Ud halla un método de purificación que arroja los datos de la siguiente tabla. ETAPA Actividad específica (U mg -1 ) Actividad total (U) Purificación (veces) Rendimiento (%) Extracto crudo 4 3, Ppción con sulfato de amonio 8 3, CM-Sephadex , Chromatografía de afinidad , Ud realiza todos los pasos de purificación y obtiene 8 ml de enzima purificada. La determinación de la actividad enzimática de la proteína purificada empleando nitrocefina como sustrato (= M -1 cm -1 ) resultó en una variación de absorbancia de 0,48 en dos minutos cuando emplea 3 l de muestra (volumen de cubeta= 1 ml, camino óptico= 1 cm) siendo la concentración de proteína 0,002 mg ml -1. La determinación de masa molecular la realiza mediante una cromatografía de filtración molecular empleando una columna previamente calibrada según se indica en la siguiente tabla: Proteína marcadora Volumen de elución (ml) Masa molecular (kda) Ribonucleasa ,7 Quimotripsinógeno ,0 Ovoalbúmina ,0 Albúmina ,0 Aldolasa ,2 Catalasa ,9 El volumen de elución de la proteína en estudio fue de 220 ml, el volumen total de la columna fue de 260 ml y el volumen de exclusión de 100 ml. a- Cual es la actividad específica de la enzima por Ud. purificada? b- Cual es el rendimiento y la purificación obtenidas por Ud. con respecto a los publicados? c- Qué masa molecular informará? (determinación por método gráfico) Cómo determinaría si se trata de una enzima monomérica o no?

12 12 RESPUESTAS 1- las mismas. K eq = [AB]/ [A] [B] = 0,67 mm muestra: 8 x 10-2 U.mL -1 ; 3,3 x 10-3 U.mg a) 6 x 10-2 mm.min -1 b) 30 nmol min -1 ml -1 c) 3 U.mL -1 d) 0,15 U.mg a) 5,2 moles (se deben verificar condiciones de linealidad) b) 6 s s a) 720 s -1 b) 0,0014 s 7- a) 500 U.mg -1 ; 4,6 x U.mol -1 b) 767 s -1 c) 1,3 x 10-3 s 8- a) debe diluir b) agregar glicerol, gelatina, albúmina bovina sérica, etc. Otra forma es aumentar la concentración de sustrato en el medio de reacción U ml -1 ;1100 U mg s a) R= 88,5 % b) P= 2, a) R= 93% b) P= R t = 14% P t = a) P= 20 b) II c) R= 40 % d) No. Se puede eliminar la etapa III 15- R t = 30 %; P t = 750; etapa de mayor purificación= III; etapa de mayor rendimiento= III; se eliminaría la etapa IV

13 a) P t = 240; R t = 25 % b) la de mayor purificación es la etapa III, la de mayor rendimiento la IV c) No. Se podría eliminar la etapa IV 17- a) Filtración molecular: R= 80 %, P= 15 Intercambio iónico: R= 13 %, P= Actividad extracto crudo= 0,4 U.mL -1 Actividades finales: Método A= 10 U.mL -1 Método B= 20 U.mL -1 Emplearía B Actividad recuperada= 200 U 19- b) el paso omitido debería ser III y IV mayor purificación= paso V mayor rendimiento= paso IV c) 0,2 U/mg 20- a) P t = 592; R t =35 % mayor purificación= IV mayor rendimiento= II b) se eliminaría la etapa II 21- P t = 4044; R t =20 % 22- a) P t = 240; R t =20 % b) mayor rendimiento= paso III mayor purificación= paso IV c) No. Se eliminaría la etapa III (podría dejarse para desalar la muestra) 23- b) P t =900; R t =75 % mayor rendimiento= paso II mayor purificación= paso IV 24- a) 0,8 U ml -1, 4 U ml -1, 5 U ml -1 b) P t =625, R t =55 % 25 a) 0,5 U.mL -1 b) 5,125 U 2155 U.mg -1 c) filtración molecular U totales; 150 U.mg a) 2500 U.mg -1 b) menor rendimiento 20 %; mayor purificación 625 c) 31000

14 14 CINÉTICA ENZIMÁTICA PROBLEMAS: 1- Utilizando la ecuación de Michaelis-Menten demuestre que v = V máx /2 cuando [S]= K m. 2- Estudiando el efecto del ph sobre la actividad de una enzima se trabajó de acuerdo a dos protocolos diferentes. En uno de ellos (A) se determinó la actividad de la enzima a distintos phs. En el otro caso (B) se preincubó la enzima a distintos phs y luego se midió la actividad de la misma a ph 6,5. Los resultados obtenidos se muestran a continuación. ACTIVIDAD ph Protocolo A Protocolo B 4.0 1,0 7, ,9 8, ,2 8, ,9 8, ,3 7, ,0 8, ,0 8, ,3 8, ,5 4, ,0 2, ,0 0,2 Explique el comportamiento enzimático en cada caso. 3-Una enzima posee la curva de actividad versus ph que aparece en la figura: Actividad (%) (a) Explique este comportamiento (b) Como probaría su hipótesis? (c) Suponga que se informó que un residuo de Asp es el responsable de una parte de esta curva de ph, cómo explicaría este comportamiento? p H

15 15 4- En la figura se muestra el comportamiento de la actividad de una enzima en función del ph. Qué aminoácidos del sitio activo serían los responsables del comportamiento observado? No tenga en cuenta el efecto de la falta de ionización causada por el medio hidrofóbico Actividad (%) p H 5- La actividad de una enzima se determinó a diferentes temperaturas obteniéndose los valores que se indican a continuación. Temperatura (ºC) Actividad (U.mL -1 ) Cuando la enzima se preincubó a cada una de las temperaturas anteriores y su actividad se ensayó a la temperatura óptima se obtuvieron los mismos valores de velocidad, excepto para las alícuotas de enzima provenientes de la incubación a 30C y 40C, las que fueron significativamente menores. Con los datos anteriores, indique: a) Cuál es la temperatura óptima de reacción? b) Por qué la actividad enzimática cuando se ensayó a la temperatura óptima no fue constante para todas las muestras previamente incubadas a distintas temperaturas? 6- La K m para el etanol de la alcohol deshidrogenasa de levadura es de 1, M. Si la concentración de alcohol en el medio de reacción es de 59,2 µg.ml -1 qué proporción de enzima estará libre y que proporción estará combinada con el sustrato?, Cuando la velocidad de reacción sea igual a V max, qué valores tomarán estas proporciones? 7- Calcular qué velocidad se obtendrá en una reacción enzimática si la velocidad máxima es igual a 100 mol.min -1 y la concentración de sustrato es a) 10 K m y b) K m /3. 8- Calcular qué concentración de sustrato expresada en función de la K m nos dará una velocidad de reacción enzimática igual al 60 % de la V max. 9- Una enzima tiene un peso molecular de y 6 sitios activos por mólecula. La velocidad inicial de la reacción que cataliza, a concentración saturante de sustrato, es 12 µmoles de sustrato cada 12 min en presencia de 18 µg de enzima. Calcule el índice de recambio de la enzima. 10- Los datos de velocidad y concentración que se muestran en la tabla se obtuvieron para una enzima que cataliza una reacción S P. a- Calcular K m y V máx. b- Comprobar que la enzima sigue una cinética de saturación hiperbólica

16 16 c- Cuáles son los intervalos de concentraciones de sustrato más útiles para estas determinaciones? [Sustrato] M velocidad nmol.l -1.min -1 2, , , , , , , , , , Una enzima con un K m de 2, M se ensayó con las siguientes concentraciones de sustrato: (a) 2, M, (b) 6, M, (c) 1, M, (d) 2, M y (e) 5, M. La velocidad observada a 5, M fue de 128 nmol l -1 min -1. Calcular las velocidades iniciales con las otras concentraciones de sustrato. 12- Si la concentración de enzima del problema anterior se aumentara 5 veces, cuál sería la velocidad inicial a cada una de las concentraciones dadas? y si se aumentara la concentración de sustrato cinco veces? 13- Dos estudiantes A y B aislaron independientemente la enzima lactato deshidrogenasa de músculo de caballo que cataliza la reducción de piruvato siguiendo los mismos pasos de purificación. Una vez obtenida una solución concentrada de enzima midieron actividad en función de la concentración de sustrato obteniendo los siguientes datos: Sustrato] (M) 2, , , , , , , V A mol.min.mg V B mol.min.mg a- Sin graficar haga una estimación aproximada de K m y V máx observando los datos de A y B. Justifique. b- Intente una explicación para la discrepancia observada entre los parámetros cinéticos de A y B. c- Qué variables graficaría para obtener K m y V máx. Justifique. 14- A partir de un experimento de inhibición se obtuvieron los datos de la tabla. Mediante una gráfica de Lineweaver-Burk determine si el compuesto en estudio es un inhibidor competitivo o no competitivo. Determine Ki (la concentración del inhibidor es 1 M)

17 17 [ Sustrato ] (moles.l -1 ) v sin inhibidor (mol.min -1 ) v con inhibidor (mol.min -1 ) 0, ,42 0,17 0, ,50 0,20 1, ,60 0,24 1, ,66 0,27 2, ,80 0,32 5, ,88 0, Calcule el K m y la V máx de la enzima E y de la enzima E en presencia del compuesto I a partir de los datos que se indican en la siguiente tabla: [S] (mm) 0,100 0,125 0,250 0,500 0,750 1,000 v control (U.mg -1 ) 0,154 0,185 0,250 0,345 0,370 0,400 v con inhibidor (U.mg -1 ) 0,065 0,081 0,133 0,217 0,263 0,294 Indique qué tipo de inhibidor es el compuesto agregado. 16- Sobre una enzima que cataliza la reacción S P se prueba el efecto de dos inhibidores X e Y obteniéndose los datos de velocidad que se muestran en la tabla. Determinar qué tipo de inhibidor es cada uno de ellos. Calcule K m y V máx. [S] (mm) sin agregado [X]=12M [Y]=60M 2,00 66,67 40,00 22,22 2,50 71,40 45,45 23,81 3,33 76,92 52,63 25,64 4,00 80,00 57,14 26,67 5,00 83,33 62,50 27,77 Los datos de velocidad están expresados en U ml El salicilato inhibe la acción catalítica de la glutamato deshidrogenasa. a) Determine el tipo de inhibición mediante el análisis gráfico de los datos de la tabla. b) Calcule la K m para el sustrato. [Sustrato] (mm) V (mg de producto por min) sin salicilato con salicilato 40 mm 1,5 0,21 0,08 2,0 0,25 0,10 3,0 0,28 0,12 4,0 0,33 0,13 8,0 0,44 0,16 16,0 0,45 0, A partir de los siguientes datos obtenidos al estudiar el efecto de un inhibidor sobre una reacción enzimática, determine el tipo de inhibición y la K m para el sustrato.

18 18 [Sustrato] (mm) V (g de producto por min) [inhibidor] = 0mM [inhibidor]=6mm 2, , , , , Se determinaron los parámetros cinéticos de una enzima en ausencia y en presencia de una serie de compuestos, algunos de los cuales se supone podrían ser inhibidores de la misma. Los resultados obtenidos con la enzima sin agregados se detallan en la tabla 1. En la tabla 2 se presentan los valores de V máx y de K m obtenidos en presencia de los compuestos en estudio. a- Calcule los valores de V máx y de K m a partir de los datos de la tabla 1. b- Indique qué tipo de inhibidor es cada uno de los compuestos agregados. TABLA 1 [S] (M) Act. (mol -1 min -1 mg -1 ) 2, , , , , , , TABLA 2 V max (mol -1 min -1 mg -1 ) Compuesto K m (M) 0,033 A 2,5 0,065 B 5,0 0,064 C 2,4 0,033 D 1,3 20- Al estudiar el efecto de una serie de compuestos sobre la enzima hexoquinasa (Glc + ATP Glc-6-P + ADP) se observó que es inhibida por piruvato. La tabla muestra los valores de actividad en mol min -1 obtenidos cuando se varía la concentración de sustrato y/o de piruvato. [I] (mm) [S]=1,00 mm [S]=1,82 mm [S]=2,50 mm [S]=10,00 mm 0,0 1,25 2,00 2,50 5,00 0,2 0,83 1,33 1,67 3,33 0,4 0,63 1,00 1,25 2,50 0,6 0,50 0,80 1,00 2,00 0,8 0,42 0,67 0,83 1,67 1,0 0,36 0,57 0,71 1,43 En base a estos datos indique: a- qué tipo de inhibidor es piruvato. b- el valor de K m.

19 19 c- el valor de V máx. d- el valor de K i. 21- Para estudiar el efecto de una serie de compuestos sobre la actividad de una enzima se incuba la misma con los mismos durante 5 min. Luego se agrega el sustrato en la misma cubeta y se determina la velocidad inicial de la reacción. Se obtienen los siguientes resultados: Preincubación V con i (M min -1 ) - 10,10 A 12,50 B 9,80 C 5,30 D 0,50 Qué efecto ejerce c/u de los compuestos sobre la enzima? Cómo puede determinar si la interacción en cuestión es reversible o irreversible? 22- La acción terapéutica de la mayoría de las drogas actualmente utilizadas está basada en la inhibición que estas causan sobre determinadas enzimas. La quimioterapia moderna tuvo sus comienzos con el uso de las sulfas, compuestos que han sido ampliamente usados para tratar infecciones bacterianas. Las bacterias no pueden absorber ácido fólico (AF) del medio y deben sintetizarlo ya que este compuesto es escencial para el crecimiento celular porque es una coenzima de diversas vías metabólicas. La síntesis de AF involucra una serie de reacciones, entre ellas la catalizada por la enzima dihidropteroato sintetasa (DHPT STasa). La acción de las sulfas se basa en que inhiben la DHPT STasa y la bacteria queda privada de AF no pudiendo crecer y dividirse. Ya que las células del individuo infectado obtienen AF de la dieta (el AF es vitamina para el hombre) la sulfa no es tóxica en las dosis usadas. Al estudiar el efecto de la dimetilsulfanilamida (DMSF) sobre la actividad de la DHPT STasa se obtuvieron los siguientes resultados: i- La incubación de la enzima con DMSF, seguida de diálisis por 6 horas no afectó la actividad enzimática. ii- El ensayo de actividad usando concentraciones variables de PABA (el otro sustrato se mantiene fijo y saturante) y diferentes concentraciones de DMSF resultaron los valores de velocidad que muestran en la tabla. [PABA] (mm) [DMSF] = 0 Velocidad (U mg -1 ) [DMSF] = 16 M [DMSF]= 50 M 0,10 1,67 1,00 0,60 0,15 2,00 1,25 0,70 0,20 2,50 1,67 1,00 0,40 3,33 2,50 1,67 0,80 4,00 3,33 2,50 En base a estos datos: a- Determine qué tipo de inhibidor es DMSF y postule el modelo de inhibición correspondiente. b- Determine el K m para PABA, la V max de la DHPT STasa y el K i para DMSF.

20 20 c- Indique si los niveles de PABA en la célula bacteriana afectan la efectividad de DMSF como medicamento. Justifique la respuesta. 23- Una de las enzimas más importantes de la vía de biosíntesis de ácido fólico (coenzima indispensable en la síntesis de purinas y pirimidinas) es la dihidrofolato reductasa. Se purificó esta enzima a partir de leucocitos humanos obteniéndose un extracto altamente purificado (concentración de proteína: 0,1 mg/ml ) al que se le midió la actividad espectrofotométricamente (Coeficiente de extinción: 6220 M -1 cm -1 ) empleando distintos volúmenes del mismo (1 µl, 2 µl y 3 µl) en una cubeta de reacción de 1 ml y 1 cm de camino óptico. Se obtuvieron las variaciones de absorbancia en el tiempo que se muestran a continuación: Explique las formas de las curvas observadas en los distintos ensayos. Cuál elige para calcular la actividad de la enzima y por qué? Calcule la actividad específica de la enzima purificada. El metotrexato se emplea en el tratamiento de niños con leucemia, ya que se trata de un potente inhibidor de la enzima mencionada. Con el objeto de conocer cuál es el mecanismo de inhibición se ha determinado la velocidad de reacción de la enzima a distintas concentraciones de sustrato en presencia de distintas concentraciones del inhibidor obteniéndose los resultados que se indican en la tabla. Variacion de absorbancia Tiempo (s) [S] mm v (nm min -1 ) [I]=0 v (nm min -1 ) [I]=0,2 nm v (nm min -1 ) [I]=0,4nM v (nm min -1 ) [I]=0,6nM 0,1 1,25 0,83 0,58 0,50 0,2 2,00 1,42 1,04 0,91 0,4 2,86 2,22 1,72 1,54 0,8 3,63 3,07 2,56 2,35 1,2 4,00 3,53 3,05 2,85 1,6 4,21 3,81 3,38 3,20 2,0 4,35 4,00 3,62 3,44 2,4 4,44 4,14 3,79 3,63 Indique cuál es el mecanismo de inhibición, calcule el K i para el metotrexato. Considera que el nivel de dihidrofolato en la célula es capaz de alterar el efecto del metotrexato? 24. La regulación metabólica encuentra su máxima expresión en las enzimas que muestran cooperativismo. El cooperativismo brinda a las enzimas (u otras proteínas) que lo poseen la capacidad de responder con mayor amplitud a determinados estímulos. Un ejemplo claro es la fosforilación de la glucosa en el hepatocito. Esta reacción permite fosforilar a la glucosa generando un metabolito, la Glc-6-P, que da inicio a las transformaciones metabólicas subsiguientes de este hidrato de carbono. La función del hígado en este sentido es mantener la concentración de glucosa en sangre en niveles suficientemente elevados para permitir su uso por todos los órganos, especialmente el cerebro, pero suficientemente bajo como para que no cause problemas

21 21 como una elevada osmolaridad. En los hepatocitos existen 2 enzimas capaces de realzar tal función: la hexokinasa (EC ) y la glucokinasa (EC ). En condiciones normales, la glucemia se encuentra en valores de alrededor de 5 mm, mientras que luego de una ingesta de alimentos con alto tenor de hidratos de carbono fácilmente puede duplicar o triplicar ese valor. En estas condiciones, los hepatocitos deberían responder captando rápidamente el exceso de glucosa para almacenarla como glucógeno o usarla en glucólisis, para lo cual es necesario fosforilar esa glucosa rápidamente ni bien entra a la célula. Teniendo en cuenta este dato, calcule cuanto variará la velocidad de captación de glucosa si el valor de glucemia pasa de 5 a 10 mm, suponiendo que ambas enzimas se encuentran niveles similares en la célula, y que poseen los siguientes parámetros cinéticos: Enzima K m o S 0,5 (mm) V max (µm min -1 ) Hexoquinasa Glucoquinasa 8 5 Para hacerlo tenga en cuenta que la HK es una enzima no cooperativa cuya velocidad se puede calcular mediante la ecuación de Michaelis Menten, mientras que la GK es una enzima cooperativa cuya velocidad puede ser descrita por la ecuación de Hill. v n S S * V max n 0, 5 S n Realice el cálculo considerando un n H de 2. Vuelque sus resultados en la tabla siguiente y realice un análisis del significado de los datos teniendo en cuenta la implicancia fisiológica según se describe más arriba. Realice un gráfico de v vs. [Glucosa] incluyendo al 0 como punto. [Glucosa] mm Hexoquinasa Glucoquinasa 0,10 0,25 0,50 1,00 2,50 5,00 10,0 15,0 25- Ud. está caracterizando el efecto de un fármaco X sobre una enzima clave de un camino metabólico. En la tabla se muestra el efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad en presencia y en ausencia del fármaco X. Sabiendo que la concentración intracelular de sustrato de la enzima es 0,5 mm, describa el efecto del fármaco y calcule los parámetros cinéticos de la enzima en presencia y en ausencia de X.

22 22 Sustrato (mm) Control (U mg -1 ) Fármaco X (U mg -1 ) 0,0 0,0 0,0 0,1 2,85 0,05 0,2 4,90 0,23 0,4 7,60 1,02 0,8 10,50 4,00 1,0 11,40 5,70 2,0 13,70 12,00 4,0 15,20 15, Se estudió el efecto de un principio activo de una planta medicinal sobre la actividad de una enzima oligomérica. Para este estudio se midió actividad de la enzima frente a este reactivo, obteniéndose los siguientes resultados: Concentración de sustrato (µm) Velocidad control (U.ml -1 ) 0,6 2,0 0,02 0,9 2,9 0,08 1,2 3,8 0,30 2,4 7,4 3,90 3,0 9,1 9,10 15,0 33,0 98,00 30,0 50,0 99,00 Velocidad en presencia de ppio. activo 1 mm (U.ml -1 ) Grafique los datos y explique como actúa este medicamento y que efecto produce sobre la actividad de la enzima. La expresión disminuida de esta enzima por factores genéticos es causa de anemias crónicas, dado que los productos de la actividad enzimática son precursores necesarios para la síntesis de factores hematopoyéticos. Sería útil la administración de este principio activo a pacientes con esta anemia? Se sabe que la concentración intracelular de sustrato es aproximadamente 10 µm. 27- Los siguientes datos se obtuvieron para una reacción catalizada enzimáticamente. Calcule las constantes cinéticas ([S] 0,5, n h y V max ) Concentración inicial de sustrato (M 10-4 ) Velocidad inicial ( mol L -1 min -1 ) 6,25 1,54 12,5 5,88 25,0 20,00 50,0 50,00 100,0 80,00 200,0 94,12 400,0 98,46 800,0 99,61

23 23 RESPUESTAS: 1- consultar clases de teoría 2- ver curvas de actividad y de estabilidad enzimáticas 3- a) Un residuo de His no protonado (pk a = 6) y un grupo amino terminal protonado (pk a alrededor de 8) o un grupo sulfidrilo (pk a = 8,1), necesarios para la actividad enzimática, serían los responsables, respectivamente, de las partes ascendentes y descendentes de la curva. b) Cristalografía de rayos X c) Un medio no polar suprime la ionización de los grupos cargados. Tal efecto podria elevar el pka del grupo carboxilo del Asp a ph 6 4- ver aminoácidos cuyos pka de grupo R estén entre 6 y ídem respuesta preg % combinada, 91 % libre; 100 % combinada 7- a) 91 mol min -1 b) 25 mol min [S]= 1,5 Km 9-9 s Km = 1,0 x 10-5 M; Vmáx= 120 nmol l -1 min a) 0,1 nmol l -1 min -1 b) 27 nmol l -1 min -1 c) 38 nmol l -1 min -1 d) 114 nmol l -1 min nmol l -1 min -1, 73 nmol l -1 min -1, 86 nmol l -1 min -1, 125 nmol l -1 min -1, aumentaría 5 veces la V consultar teoría 14- Km= 0,67 x 10-4 moles l -1 ; Vmáx= 0,99 mol min -1 ; Km i = 0,68 x 10-4 moles l -1 ; Vmáx i = 0,40 mol min -1 ; Inhibidor no competitivo 15- Km= 0,21 mm; Vmáx= 0,48 U mg -1 ; Km I = 0,63 mm; Vmáx I =0,48 U mg -1 ; Competi tivo. 16- Km=1 mm; Vmáx= 100 U ml -1 ; Km x = 3 mm; Vmáx x =100 U ml -1 ; Km Y = 1 mm; Vmáx Y = 33 U ml -1 ; x competitivo; y no competitivo. 17- a) Inhibidor no competitivo b) Km= 2,4 mm 18- Inhibidor competitivo Km= 5,2 mm

24 24 19 a) K m = 2,55 M; V máx = 0,065 mol min -1 mg -1 b) A: no competitivo B: competitivo C: no tiene efecto D: acompetitivo 20- a) no competitivo b) K m = 5 mm c) V máx = 7,5 mol min -1 d) K i = 0,385 mm 21- ver clases de teoría 22- a) competitivo b) K m = 0,21 mm; V máx = 5,26 U mg -1 ; K i = 16,5 M c) Afecta 23- Competitivo, K i = 0,25 nm, afecta. 24 [Glucosa]mM V HK (µm min -1 ) V GK (µm min -1 ) 0,10 0,50 0,01 0,25 0,71 0,04 0,50 0,83 0,15 1,00 0,91 0,56 2,50 0,96 2,19 5,00 0,98 3,79 10,00 0,99 4,63 15,00 0,99 4,83 20,00 1,00 4,90 La velocidad variará de 3,69 a 4, 63 µm min El fármaco produce un cambio en la cinética de la enzima, convirtiéndola de hiperbólica en sigmoidea. Sin fármaco: V max = 17 U/mg; K m = 0,5 mm. Con fármaco: n ap = 2 ; [S] 0,5 = 1,32 mm 26 El medicamento produce un cambio en la cinética de la enzima, convirtiéndola de hiperbólica en sigmoidea. Sí, se podría utilizar ya que a la concentración intracelular de sustrato la velocidad de formación de precursores necesarios para la síntesis de factores hematopoyéticos es mayor con el principio activo que sin él. 27 Vmáx= 100 µmol L -1 min -1, [S] 0,5 = 5 mm; n = 2

25 25 MATERIAL COMPLEMENTARIO Gráficas de Lineaweaver Burk Inhibidor reversible competitivo Inhibidor reversible no competitivo Inhibidor reversible acompetitivo

26 26 Gráficas de Dixon Gráficas de Cornish-Bowden

27 Inhibición irreversible 27