Tema 19. Anticuerpos Monoclonales y Policlonales. Producción y Purificación. Aplicaciones. Concepto de suero policlonal y monoclonal

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1 Tema 19. Anticuerpos Monoclonales y Policlonales. Producción y Purificación. Aplicaciones Concepto de suero policlonal y monoclonal Cuando se inocula un antígeno (o penetra un patógeno) se produce una respuesta de anticuerpos frente a cada uno de los determinantes antigénicos (epitopos) del antígeno. Todos los anticuerpos se producen de forma simultánea, todos reaccionan con el antígeno, pero solo con un determinante concreto. Esto es lo que se produce en la respuesta inmune normal, y a esta mezcla de anticuerpos es a la que se denomina suero Policlonal, porque procede de varios linfocitos B que se expandieron (tras reconocer al antígeno) produciendo cada uno un clon celular. En cambio si la inoculación o inmunización la realizásemos con un antígeno que contuviese un único epitopo, solo se activaría un clon celular y se produciría un único anticuerpo. A un suero que tuviese estas características se le denomina suero monoclonal. Esta situación, no se produce en condiciones normales, pero en determinadas condiciones patológicas aparecen neoplasias de células B y de los plasmocitos derivados de ellas (Mieloma múltiple). Como son células productoras de anticuerpos, estos se acumulan en la sangre en grandes cantidades. Como ocurre en todos los procesos tumorales el origen está en una célula que se maligniza y se multiplica de forma autónoma e independiente de los sistemas de regulación del organismo, lo que es lo mismo que decir que todas las células del mieloma proceden de una misma célula y, por tanto, producen el mismo anticuerpo. Aunque existen mielomas de cada una de las cinco clases de inmunoglobulinas los más frecuentes producen los isotipos IgA e IgG. Producción de anticuerpos A partir de un suero policlonal se puede obtener un suero especifico para el antígeno mediante aislamiento y purificación. Si bien los anticuerpos obtenidos, todos ellos especificos para el antígeno, variaran en su afinidad para el mismo al proceder de distintos clones. Este seria un suero, por tanto, policlonal. La Técnica básicamente consiste en efectuar una cromatografía de afinidad en columna. En esta técnica se une el mismo antígeno que se utilizó para la inoculación a unas bolitas especialmente preparadas para que lo capturen. Una vez recubiertas por el antígeno se empaquetan las bolitas en un tubo fino (se le llama columna ) y se hace pasar por el al suero que se desea purificar. Los anticuerpos específicos para el antígeno retenido sobre las bolitas se unen a el y el resto de los anticuerpos y proteínas del suero sale por la parte inferior. El paso final es la ruptura de las uniones entre antígeno y anticuerpos (cosa que se hace añadiendo a la columna una solución hipertónica u otra con ph ácido, con lo que los anticuerpos específicos se eluyen (salen) por la parte inferior. Obtención de anticuerpos monoclonales En 1975 Kohler y Milstein desarrollaron la técnica de los hibridomas, mediante la que pueden producirse en el laboratorio anticuerpos monoclonales específicos para un antígeno

2 (determinante antigénico) concreto. La técnica se desarrolló inicialmente utilizando células de ratón, pero en la actualidad se producen hibridomas a partir de células de varias especies, incluyendo la humana. Fusión. La técnica consiste básicamente en fusionar células linfoides (productoras de anticuerpos) con células de mieloma (tumorales) en presencia de poli-etilen-glicol (PEG), que provoca la fusión de las membranas y la formación de híbridos celulares. Las células productoras del anticuerpo se obtienen a partir de los órganos linfoides periféricos (bazo y/o ganglios linfáticos) de animales hiper-inmunizados con un antígeno o patógeno concreto. Las células de mieloma a utilizar deben reunir, al menos, las siguientes características: Ser histocompatibles con las células productoras de anticuerpos No secretar inmunoglobulinas No tener la enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferasa (HGPRT) Los híbridos resultantes pueden ser de cualquier tipo: Linfocito-Linfocito, Linfocito-Mieloma o Mieloma-Mieloma. Los que conocemos como Hibridomas son los híbridos Linfocito- Mieloma. Selección Los hibridomas se recuperan cultivando la mezcla celular anterior en un medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina. La aminopterina es un inhibidor del ácido fólico, sustancia que interviene en la síntesis de los nucleósidos y nucleótidos necesarios para la replicación del DNA. En este medio (y en cualquiera que se use) los híbridos LB-LB y los LB no fusionados mueren, ya que tienen una vida media limitada. Los híbridos M-M y las células de mieloma no fusionadas mueren por carecer de la enzima HGPRT. La células que sobreviven son los hibridomas LB-M, que heredan la capacidad de vivir indefinidamente y la alta capacidad biosintética propias de la célula tumoral y la capacidad de producir anticuerpos y sintetizar guanina vía HGPRT de los linfocitos B. HGPRT participa en la llamada vía de salvamento, mediante la cual una célula puede usar la hipoxantina como precursor de otras bases nitrogenadas aun en presencia de aminopterina. Como en la fusión se usan células linfoides procedentes de un animal hiper-inmunizado, una parte de los hibridomas obtenidos son productores de anticuerpos y cada hibridoma produce un solo anticuerpo (monoclonal). Tras la selección en medio HAT las células supervivientes se reparten en los pocillos de placas de cultivo (rico en nutrientes e idóneo para la proliferación celular) y se incuban para que se produzca su crecimiento. En aquellos pocillos que presentan un crecimiento adecuado se recogen muestras del sobrenadante y se analizan en ELISA para ver si contienen anticuerpos específicos para el antígeno inicial (con el que se hiper-inmunizó inicialmente al animal utilizado). La células de los pocillos positivos se recuperan y, mediante un proceso de dilución límite o clonación, se reaparten en los pocillos de nuevas placas a 1 célula por pocillo. Los pocillos que producen buenos clones se muestrean en busca de los anticuerpos y, los positivos, se vuelven a cionar. Mantenimiento Los hibridomas productores de anticuerpos se expanden en recipientes de cultivo de mayor capacidad y se recogen las células por centrifugación, se suspenden en medio de cultivo

3 suplementado con suero fetal de ternera y dimetil-sulfóxido (DMSO) para congelarlas, primero a -70ºC y luego en nitrógeno líquido. La producción del anticuerpo monoclonal se hace a partir del sobrenadante de cultivos en masa o tras la inoculación intraperitoneal del hibridoma en animales histocompatibles. En este último caso se produce un tumor que produce anticuerpos en esa localización acompañado de ascitis (acumulación de líquido en el peritoneo) y en el liquido ascítico (que se recupera por punción) hay una gran concentración de anticuerpos. En ambos casos los anticuerpos monoclonales se separan y purifican por los métodos convencionales. Aunque son susceptibles de mutar, los hibridomas mantienen sus características durante muchas generaciones. Aplicaciones. Estos anticuerpos monoclonales (mab) han permitido identificar y purificar gran número de marcadores celulares tales como los CD, receptores de citoquinas, etc. También se usan en investigación como herramientas para identificar y aislar moléculas, en las pruebas inmunológicas de diagnóstico en el laboratorio clínico, como vehículos para el transporte de drogas y radio-isótopos, etc. Pero quizás su aplicación mas prometedora es en el campo de la terapeútica. Así ya se han desarrollado algunos contra enfermedades como el cancer de colon, de mama, contra el linfoma no Hodgkin y otras leucemias y enfermedades como artritis, enfermedad de Crohn, asma..etc En este último apartado, Cuando se comenzaron a dar los primeros pasos en este campo cundió un optimismo ilimitado, ya que se pensaba que podrían utilizarse, por ejemplo para el cancer a modo de misiles teledirigidos, portadores de tóxicos o isótopos radiactivos que podrían orientarse contra las células tumorales y depositar su carga letal, eliminando las células cancerosas y dejando intactas las normales. Así hay en el mercado una decena de anticuerpos monoclonales. Cubren desde la prevención del rechazo de un órgano trasplantado hasta la oncoterapia. Pero la realidad mostro que las cosas son más difíciles. Los anticuerpos monoclonales son proteínas del sistema inmunitario muy puras que atacan dianas moleculares específicas. Para su infortunio, los individuos que recibieron la primera hornada de anticuerpos monoclonales con fines terapéuticos tendían a desarrollar sus propios anticuerpos contra los anticuerpos inyectados. Eso hizo que, por causas que no acabamos de conocer, progresaran aún más en su patología. El hígado secuestraba tales anticuerpos monoclonales y los eliminaba antes de que pudieran alcanzar sus objetivos. Este fracaso hizo pasar del optimismo al desanimo a las empresas y laboratorios que apostaron por este método. Esto era debido fundamentalmente a que tales anticuerpos eran de origen murino y eran reconocidos como extraños por el sistema inmunitario humano, produciendose, por tanto la respuesta frente a ellos. No obstante mas adelante se descubrieron vías para corregir las deficiencias de los primeros fármacos surgiendo los anticuerpos quiméricos y humanizados. Anticuerpos quiméricos

4 Estos Ac son moléculas artificiales en la cual, las porciones constantes de las cadenas pesada y liviana provienen de una Ig humana y las regiones variables VE y VE son obtenidas de un AcMo murino. El objetivo perseguido con la construcción de un AcQ es reducir la inmunogenicidad para el humano de los AcMo de ratón o rata, pero sin afectar la especificidad del Ac. Estos anticuerpos presentaban un 70% de componente humano y un 30% era de origen murino, por lo que a pesar de ser menos inmunogénicos que los denominados anticuerpos monoclonales de primera generación seguían presentando problemas de inmunogeneicidad. Por ello se recurrio a los denominados: Anticuerpos humanizados Estos solo tienen de ratón los genes que entran en contacto con el antígeno. El 90 por ciento del anticuerpo es así de origen humano, por lo que al ser inyectado en los pacientes no se produce respuesta del S.I. En teoría solo llevan del ratón el paratopo de unión al antígeno. El argumento que la soporta se basa en el supuesto de que el sitio de combinación al antígeno, el paratopo, se forma a partir de la combinación espacial de las asas hipervariables y que el resto de la región variable (regían denominada M) sólo funcionan como un andamio cuya única función es servir de soporte estructural al paratopo. De esta manera en estos los epitopos asociados a las regiones M múridas, los cuales están presentes en los AcQ no se encuentran en los AcH. Para producir un AcH es necesario, por tanto conocer la secuencia entera de los dominios V múridos y la localización de las secuencias de ADN correspondientes a las 3 RDC Hay dos aspectos que pudieran considerarse desventajosos en la producción de un AcH. En primer lugar, la manipulación de las RDC y su posterior inserción en el contexto de regiones M humanas, por lo general, conlleva a una disminución de la afinidad del Ac. Ello se debe a que las regiones M no son sólo andamios; ellas juegan un rol determinante en el arreglo tridimensional de las RDC El otro aspecto tiene que ver con la complejidad de la técnica. Mientras que producir un AcQ es un procedimiento relativamente expedito, la creación de un AcH es, comparativamente, más laborioso, consume un tiempo considerable. En todo caso, el objetivo fundamental perseguido por la producción de un AcH (eliminar la inmunogenicidad del Ac múrido) no siempre es alcanzado. Se ha reportado cierta inmunogenicidad "residual" en moléculas de Ac completamente humanizadas, ello debido, aparentemente, a epitopos asociados con el idiotipo del Ac Anticuerpos bifuncionales. Ahora es posible construir anticuerpos con sitios de combinación diferentes que pueden, por tanto, reconocer simultáneamente a dos antígenos. Son producidos artificialmente al cruzar dos anticuerpos, uno dirigido contra el antígeno de superficie de la célula tumoral y el otro contra una molécula estimuladora de la célula efectora (complejo célula T receptora). Fármacos desarrollados

5 Al mercado han llegado ya una decena de anticuerpos monoclonales. Tres más esperan una pronta aprobación por la norteamericana Oficina de Alimentación y Farmacia (FDA). Dos estarán equipados para llevar una dosis de radiactividad. Hay un centenar largo en fase de ensayo en humanos, superadas con éxito las pruebas en animales. Siendo en la actualidad un campo en expansión. En este sentido la empresa Genentech esta desarrollando, hasta ahora con éxito, aunque aún no esta en el mercado unos anticuerpos monoclonales contra el asma (Xolair). Estos eliminan los anticuerpos que desempeñan una función clave en el asma y las alergias. Así las cosas, y tomados en su conjunto, los nuevos tipos de anticuerpos monoclonales ofrecen óptimas perspectivas ante una serie de enfermedades Elección entre anticuerpos monoclonales y policlonales Paradójicamente, los anticuerpos policlonales a veces proporcionan mayor especificidad que los monoclonales frente al mismo antígeno. Ésto es porque las reacciones cruzadas no deseadas se pueden eliminar de un suero policlonal mediante absorción con el antígeno causante de la interferencia, mientras que las reacciones cruzadas no buscadas no se pueden eliminar de un anticuerpo monoclonal porque tiene una única especificidad. La especificidad de los anticuerpos policlonales se pueden mejorar también mediante cromatografía de afinidad utilizando antígenos purificados. Fragmentos de anticuerpos A veces se desea evitar las funciones efectoras de los anticuerpos mediadas por Fc, tales como uniones a receptores Fc cuando se pretende detectar antígenos de superficie. Esto se puede evitar digiriendo el anticuerpo con enzimas proteolíticas. El tratamiento con pepsina produce fragmentos F(ab')2 que se pueden separar de los Fc y del anticuerpo no digerido usando cromatografía con proteína A- o proteína G-Sepharose. Alternativamente, la digestión con papaína genera fragmentos Fab monovalentes. Equilibrio antígeno-anticuerpo Aunque la unión del anticuerpo al antígeno se puede detectar en segundos, el equilibrio normalmente no se alcanza hasta que no pasan varias horas de la adición del anticuerpo al antígeno. Para muchos ensayos, las incubaciones de 1-2 horas producen la máxima unión. El rendimiento se ve afectado por la temperatura y por eso se pueden hacer incubaciones más cortas a 37ºC mientras que las incubaciones largas (por ejemplo toda la noche) se harán a 4ºC. El término temperatura ambiente que se emplea en muchas técnicas se refiere a una temperatura de aproximadamente 20ºC. Titulación de anticuerpos El título de un anticuerpo se refiere a la mínima concentración (mayor dilución) de anticuerpo que resulta todavía eficaz en un ensayo, por ejemplo la aglutinación. Los anticuerpos deben titularse antes de utilizarlos en un inmunoensayo porque usar una concentración muy grande es un desperdicio, puede dar señales inespecíficas y puede ser

6 poco sensible en ensayos de inhibición. Por otro lado, una concentración demasiado baja obviamente produce una pérdida de sensibilidad. Si se dispone de más de un anticuerpo monoclonal frente a un antígeno de interés, es conveniente determinar si todos reconocen el mismo o diferentes epitopos del antígeno.