EXTRACCIÓN Y DETERMINACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS DE LA LEVADURA

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1 EXTRACCIÓN Y DETERMINACIÓN DE ÁCIDS NUCLEICS DE LA LEVADURA bjetivos: Al finalizar el trabajo práctico los cursantes estarán en capacidad de: - Extraer ARN a partir de células de levadura. - Realizar la hidrólisis ácida de los ácidos nucleicos. - Determinar cuantitativamente y de manera indirecta el ARN presente en la levadura por el método de Bial. - Relacionar el contenido de Ribosa con la presencia del ARN en el material biológico analizado. Introducción: Los ácidos nucleicos son las biomoléculas responsables del almacenamiento y transmisión de la información genética del individuo. Son un grupo de compuestos que poseen en su estructura bases nitrogenadas: adenina, citosina, timina, guanina y uracilo; pentosas: ribosa y 2-desoxirribosa, y grupos fosfato. El tipo de bases nitrogenadas y pentosa presente dependerán del tipo de ácido nucleico. El ADN y el ARN difieren en el tipo de base y la pentosa que forman parte de su estructura. Los ácidos nucleicos se encuentran normalmente unidos a proteínas sencillas del tipo histonas y protaminas, denominándosele a esta combinación nucleoproteínas, que no son más que uno de los tipos de proteínas conjugadas que existen en las células. Existen las desoxi-nucleoproteínas y las ribo-nucleoproteínas, aunque éstas se encuentran en todos los tipos de células, no se encuentran en ellas en las mismas proporciones, por ejemplo, las células de levadura son ricas en ribo-nucleoproteínas, mientras que las células del timo del ternero son ricas en desoxi-nucleoproteínas. Su extracción a partir de las diferentes células, puede hacerse con soluciones alcalinas diluidas, soluciones buffer (p 4-11) y soluciones de cloruro de sodio. 1

2 El material genético de organismos unicelulares como la levadura (Saccharomyces cerevisiae) puede ser extraído con relativa facilidad. La ruptura de las membranas se puede realizar con un álcali diluido y calentamiento. Una vez liberados los ácidos nucleicos, estos son precipitados en medio ácido y etanol (alcohol acidulado), hidrolizados con 2 S 4 y calentamiento, y finalmente aislados por centrifugación. Detección de ARN Los nucleótidos de ARN pueden ser identificados de manera indirecta utilizando la prueba de Bial ya que esta reacción detecta la presencia del furfural producido en medio ácido por la ribosa. El reactivo de Bial contiene orcinol disuelto en Cl concentrado. El ácido provoca la formación del furfural y el orcinol se condensa con este último para producir cromógenos de color verde-azul. C 2 Ribosa + furfural C + C 3 Reactivo de Bial + FeCl 3 Compuestos de color verde-azul Figura 1. Reacción de Bial con el furfural formado a partir de ribosa. Detección de ADN La presencia de ADN se puede verificar mediante la reacción del Dische o difenilamina, en la cual la 2-desoxirribosa del DNA reacciona con ácido sulfúrico para producir aldehído hidroxilevulínico o 4-hidroxipentanal. Este compuesto reacciona con la difenilamina originando como producto un compuesto químico de color azul (figura 2). Esta reacción es específica ya que sólo la 2-desoxirribosa produce el 4- hidroxipentanal en medio fuertemente ácido. 2

3 C 2 2-Desoxirribosa + C C 2 C 2 C C 3 4-hidroxipentanal C C 2 C 2 C C 3 + N difenilamina + Compuestos de color azul 4-hidroxipentanal Figura 2 Reacciones de la prueba de Dische o difenilamina MATERIALES Y REACTIVS - Levadura fresca o liofilizada. - Na 1% - Ácido acético glacial. - Etanol acidulado: 200 ml de etanol + 1 ml de ácido clorhídrico concentrado. - 2S4 concentrado. - Estándar de ribosa 1 mg% - Reactivo de Bial: disolver 3 g de orcinol en 100 ml de Cl concentrado y agregar 0,3 ml de FeCl 3 al 10 %. Preparar a diario. - Reactivo de Dische: disolver 1 g de difenilamina en 100 ml de ácido acético glacial y añadir 5 ml de ácido sulfúrico concentrado. - Baño de agua hirviente. - Centrífuga - Tubos de ensayo. - Cilindro graduado 25 ml. - Pipetas graduadas 10, 5, 2, y 1 ml. - Beakers 100 ml. - Tubos de Centrífuga. - Varilla de vidrio. - Fiola de 50 ml. 3

4 PARTE EXPERIMENTAL: Extracción de las nucleoproteínas. Diluir 5 ml. de Na (1%) en 25 ml de agua destilada. Añada 10 g de levadura (si es fresca, 5 g si es liofilizada) cortada en pequeños pedazos. Resuspender la pasta de levadura en el Na. Calentar en baño María a 90ºC por 30 minutos y agitar ocasionalmente, para facilitar la extracción de las nucleoproteínas. Centrifugar el líquido resultante por 10 minutos a 3500 rpm. Reservar el sobrenadante (contiene ribonucleoproteínas) y añadir a 2 ó 3 gotas de ácido acético hasta neutralizar el medio. Compruebe la neutralización con papel tornasol. Si aparece precipitado, vuelva a centrifugar por 10 minutos a 3500 rpm. Evaporar el sobrenadante en una plancha de calentamiento hasta que quede un volumen de aproximadamente 10 ml. Dejar enfriar. Agregarlo en un Beaker que contenga 20 ml de alcohol acidulado, agitar vigorosamente para precipitar las ribonucleoproteínas. Centrifugar de nuevo y deseche el sobrenadante. Resuspender el residuo de ribonucleoproteínas con 5 ml de etanol al 95% para lavar y eliminar impurezas y centrifugue por 5 minutos a 3500 rpm. Resuspender el precipitado en 5 ó 10 ml de agua destilada en un tubo de ensayo. idrólisis de las nucleoproteínas. Verter la suspensión de ribonucleoproteínas en un beaker y añada 1 ml de ácido sulfúrico y caliente en baño María a 100ºC durante 20 minutos. Determinación cualitativa de ARN y ADN. 1. Coloque en dos tubos de ensayo rotulados B (Bial) y D (Dische) 1 ml del hidrolizado de nucleoproteínas. 2. Agrague al tubo B 2 ml de reactivo de Bial y al tubo D 2 ml de reactivo de difenilamina. 3. Caliente los tubos por 10 minutos a 100ºC en un baño de agua hirviendo. 4. Retire los tubos del baño de maría y observe la coloración de cada uno. 4

5 5. Elabore una conclusión basada en los resultados obtenidos. AUTEVALUACIÓN 1 Porqué la determinación de ribosa y 2-desoxirribosa representa una forma indirecta de reconocer la presencia y cantidad de ácidos nucleicos? 2. Mencione otras muestras biológicas a partir de las cuales podamos cuantificar ácidos nucleicos. 3. Mencione otros componentes químicos que podamos cuantificar para medir indirectamente la concentración de ADN y ARN. Bibliografía A.V. Chechetkin, V.I. Voroniaski, G.G. Pokusay. Prácticas de Bioquímica del ganado y aves de corral. Alemany, M; Font, S. Práctica de Bioquímica. Edit Alhambra. España Plummer, David. Bioquímica práctica. Mc Graw ill Robyt, John; White Bernard. Bioquemical Techniques. Waveland Press

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