Prueba de Antiglobulina Indirecta

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1 Procedimiento 1 Prueba de Antiglobulina Indirecta Principio La técnica de inmunoglobulina indirecta fue descrita por primera vez en 1945 por Coombs y colaboradores y permite observar aglutinaciones de anticuerpos que normalmente no serían evidenciables en condiciones estándar de laboratorio. Esta técnica de antiglobulina indirecta es muchas veces necesaria en el fenotipaje de grupos sanguíneos en los que los antígenos se encuentran en baja densidad antigénica, ya que se propicia la adsorción de los anticuerpos gracias a la fase de incubación. Igualmente es aplicable en aquellos casos en los que se buscan anticuerpos en el suero de una persona, ya que estos pueden estar en bajo título y no ser detectados tras incubaciones cortas. En esta prueba se utiliza el suero de Coombs, o reactivo de inmunoglobulina humana, el cual consiste, en su forma más simple, en una inmunoglobulina dirigida contra la porción Fc (cadenas pesadas) de los anticuerpos de tipo IgG. Existen igualmente reactivos que están conformados no solamente por inmunoglobulinas anti- IgG sino también por inmunoglobulinas dirigidas contra la molécula C3 del complemento, lo que permite reconocer la presencia de anticuerpos fijadores de complemento. Se han desarrollado asimismo reactivos dirigidos contra fracciones específicas de complemento, como C3b, C3d, C4b y C4d. La prueba de Antiglobulina Indirecta cuenta con varias fases, siendo la primera una fase de centrifugación, en la cual se detectan anticuerpos de tipo IgM como los del sistema ABO, auto-anti-i, anti-m, anti-n, anti-lewis, etc. Luego de esta fase se permite, por un tiempo prolongado y a una temperatura de 37ºC la reacción entre antígenos y anticuerpos (de estar estos presentes). Dependiendo de las normativas establecidas por el Banco de Sangre, es posible que se utilicen otros medios potenciadores de la aglutinación, como albúmina, LISS, polietilenglicol o enzimas. En caso de que alguno de estos reactivos sea utilizado, es necesario apegarse a las instrucciones aportadas por el fabricante. Se espera que, de haber reconocimiento, al finalizar esta fase haya una sensibilización de los glóbulos rojos. Una vez terminada esta incubación, se pasa a realizar lavados con el fin de remover inmunoglobulinas u otro tipo de proteínas que puedan interferir con la reacción. La fase de los lavados es crítica, ya que la presencia de anti-anticuerpos u otros interferentes en el suero podrían llevar a la neutralización del reactivo. Asimismo,

2 es sumamente importante eliminar el exceso de solución salina al finalizar estos lavados, ya que de lo contrario, el reactivo de antiglobulina es diluido, lo cual puede afectar la sensibilidad de la prueba. Posterior a los lavados se añade el reactivo de antiglobulina, se centrifuga y se lee la prueba. De haberse dado sensibilización, los anticuerpos adheridos a la superficie eritrocitaria serán reconocidos por el reactivo de Coombs y se podrá observar una reacción de aglutinación. Muestras y reactivos Solución salina Muestras de sangre total anticoagulada con EDTA u obtenida en tubo sin anticoagulante Baño maría a 37ºC. Juego de células rastreadoras 3%. Reactivo de Antiglobulina Humana (Suero de Coombs) Albúmina bovina 22%. Células de control de antiglobulina humana. Método 1. Rotular tubos para las Células I, Células II y Células III. 2. Mezclar y homogenizar con suavidad el juego de reactivo de células rastreadoras. 3. Añadir al tubo rotulado como células I, 50 ul del pool I. Debe tenerse especial cuidado en no intercambiar las tapas de los goteros y en minimizar la posibilidad de contaminación de los mismos. 4. Añadir al tubo rotulado como células II, 50 ul del pool II. 5. Añadir al tubo rotulado como células III, 50 ul del pool III. 6. Añadir 100 ul del suero en análisis a cada uno de los tubos. 7. A partir de este momento se inician las tres fases de una prueba de antiglobulina: i. Fase i, centrifugación inmediata o prueba rápida: 1. Centrifugar los tubos 15 segundos a 3000 rpm. 2. Resuspender con suavidad, leer y anotar resultados. ii. Fase ii, incubación a 37ºC: 1. Después de la lectura anterior, colocar los tubos a 37ºC por 30 minutos. 2. Centrifugar los tubos 10 segundos a 3000 rpm. Leer y anotar resultados. 3. Realizar tres lavados con solución salina fisiológica. iii. Fase III, antiglobulina: 1. Añadir 100ul del reactivo de antiglobulina humana poliespecífico (suero de Coombs). 2. Mezclar y centrifugar 10 segundos a 3000 rpm.

3 3. A las pruebas que dieron negativo, se les realiza el control con Células Control, agregando 50ul de las células reactivo de Control de Antiglobulina Humana. 4. Mezclar y centrifugar 10 segundos a 3000 rpm, leer y anotar resultados.

4 2. Procedimiento 2 Prueba de Antiglobulina Directa Principio La prueba de Coombs directo se utiliza primordialmente para determinar si los eritrocitos del paciente en análisis están recubiertos por inmunoglobulinas o fracciones de complemento. Esto puede llegar a presentarse en diferentes condiciones, como por ejemplo, la presencia de alo o autoanticuerpos dirigidos contra antígenos de propios de la superficie eritrocitaria, de anticuerpos dirigidos contra drogas que se adsorben a la membrana del glóbulo rojo o por la activación de complemento en esta superficie. Por estas razones, la prueba de antiglobulina directa son útiles en el estudio de anemias hemolíticas, ya sean autoinmunes o inducidas por drogas, de la Enfermedad Hemolítica del Recién Nacido o en reacciones aloinmunes a eritrocitos recientemente transfundidos. Normalmente, esta prueba se realiza con el reactivo de Antiglobulina Humana, que tal como se explicó en el procedimiento anterior, usualmente es poliespecífico e incluye anticuerpos dirigidos tanto contra las IgG humanas como contra fracciones del complemento. En caso de obtener una reacción positiva utilizando este reactivo, se procede a utilizar reactivos monoespecíficos con el fin de identificar la especificidad de los anticuerpos involucrados en la reacción. Dado que es posible que exista fijación de complemento in vitro en muestras no anticoaguladas, se prefiere realizar esta prueba en muestras que hayan sido anticoaguladas con EDTA. De lo contrario, si se obtiene un resultado positivo debido a la fracción de complemento, este debe ser corroborado utilizando una nueva muestra. También se recomienda utilizar eritrocitos lavados para realizar la prueba, ya que podrán existir proteínas o sustancias inespecíficas que interferirían con la reacción. Muestras y Reactivos Solución salina Muestras de sangre total anticoagulada con EDTA u obtenida en tubo sin anticoagulante Baño maría a 37ºC.

5 Reactivo de Antiglobulina Humana (Suero de Coombs) Albúmina bovina 22%. Células de control de antiglobulina humana. Método 1. Rotular tres tubos con el número de muestra por analizar. 2. Tomar una alícuota de la muestra y transferir al tubo correspondiente. 3. Realizar tres lavados con solución salina fisiológica. 4. En el segundo tubo hacer una suspensión de trabajo al 3-5% a partir de la muestra de eritrocitos lavada. 5. Añadir al tercer tubo 50 ul de la suspensión de trabajo realizada. 6. Añadir 100 ul del reactivo de antiglobulina humana. 7. Mezclar y centrifugar por 10 segundos a 3000 rpm 8. Resuspender levemente, leer por aglutinación y hacer las anotaciones respectivas. 9. En caso de obtener un resultado negativo, corroborar el mismo utilizando las Células Control de Coombs.

6 Procedimiento 3 Estudio de Anticuerpos Irregulares utilizando Células Rastreadoras Principio Como se mencionó anteriormente, la prueba de Antiglobulina Indirecta puede ser utilizada para la detección de la presencia de anticuerpos dirigidos hacia antígenos de la superficie eritrocitaria, sobre todo, cuando estos se encuentran en bajo título. En medicina transfusional es de suma importancia la detección de la presencia de estos anticuerpos ya que si están presentes en el suero de un paciente, por una reacción de aloinmunización previa, van a condicionar el tipo de eritrocitos que le pueden ser transfundidos en adelante. Por esta razón, el rastreo de anticuerpos se realiza de rutina a todos los receptores de hemocomponentes como parte de los estudios pretransfusionales. Su presencia puede correlacionar con reacciones transfusionales o hemolíticas graves, así como producir un acortamiento de la sobrevida de las células transfundidas. Los anticuerpos irregulares son por lo general del tipo IgG, reactivos a 37ºC y/o en la prueba de antiglobulina. Son ejemplos de este tipo de anticuerpos los dirigidos contra los antígenos de los grupos sanguíneos Rh, Kell, Duffy, Kidd y SsU. Se ha estimado que la incidencia de anticuerpos no-abo en diferentes poblaciones oscila entre el 0,78% y el 1,64%. En poblaciones hospitalarias especiales, que por su condición de fondo reciben transfusiones de hemocomponentes con frecuencia, esta incidencia puede ser mucho mayor. Los métodos empleados en la detección de anticuerpos irregulares pueden incluir 2 a 3 células pantalla o rastreadoras. Estas células deben de contar con la mayoría de los antígenos de significancia clínica y se trabajan, al igual que las suspensiones de trabajo eritrocitarias, a una concentración de 3 %. Una cantidad adecuada de cada una de estas células se incuba con la proporción indicada de suero del paciente en análisis y se realiza una prueba de antiglobulina indirecta, siguiendo el medio de reacción que el Banco de Sangre tenga establecido, sea el salino, con albúmina, con enzimas o con medio de baja fuerza iónica y finalizados con la prueba de antiglobulina humana de tipo IgG o anti IgG + C3d. De preferencia cuando la determinación se realiza en tubo se debe utilizar el reactivo poliespecífico (anti IgG+C3d) debido a que con él se pueden detectar algunos anticuerpos poco

7 frecuentes demostrados sólo por la actividad del complemento, como ocurre con los anticuerpos dirigidos contra el sistema de grupo sanguíneo Kidd. Cuando un anticuerpo irregular es detectado, la especificidad debe de ser definida mediante la confrontación del suero/plasma del paciente con las células del panel de identificación de anticuerpos. Una vez identificada la especificidad del anticuerpo, se debe de buscar un hemocomponente que no posea dicho antígeno, realizarle la prueba cruzada y solo una vez obtenido un resultado negativo se procede a transfundir al paciente. Muestras y reactivos Solución salina Muestras de sangre total anticoagulada con EDTA u obtenida en tubo sin anticoagulante Baño maría a 37ºC. Juego de células rastreadoras 3%. Reactivo de Antiglobulina Humana (Suero de Coombs) Albúmina bovina 22%. Células de control de antiglobulina humana. Método 1. Rotular tubos para las Células I, Células II y Células III. 2. Mezclar y homogenizar con suavidad el juego de reactivo de células rastreadoras. 3. Añadir al tubo rotulado como células I, 50 ul del pool I. Debe tenerse especial cuidado en no intercambiar las tapas de los goteros y en minimizar la posibilidad de contaminación de los mismos. 4. Añadir al tubo rotulado como células II, 50 ul del pool II. 5. Añadir al tubo rotulado como células III, 50 ul del pool III. 6. Añadir 100 ul del suero en análisis a cada uno de los tubos. 7. A partir de este momento se inician las tres fases de una prueba de antiglobulina: i. Fase i, centrifugación inmediata o prueba rápida: 1. Centrifugar los tubos 15 segundos a 3000 rpm. 2. Resuspender con suavidad, leer y anotar resultados. ii. Fase ii, incubación a 37ºC: 1. Después de la lectura anterior, colocar los tubos a 37ºC por 30 minutos. 2. Centrifugar los tubos 10 segundos a 3000 rpm. Leer y anotar resultados. 3. Realizar tres lavados con solución salina fisiológica. iii. Fase III, antiglobulina:

8 1. Añadir 100ul del reactivo de antiglobulina humana poliespecífico (suero de Coombs). 2. Mezclar y centrifugar 10 segundos a 3000 rpm. 3. A las pruebas que dieron negativo, se les realiza el control con Células Control, agregando 50ul de las células reactivo de Control de Antiglobulina Humana. 4. Mezclar y centrifugar 10 segundos a 3000 rpm, leer y anotar resultados.

9 3. Procedimiento 4 Pruebas de Compatibilidad Sanguínea Principio La transfusión sanguínea representa en la actualidad una parte importante de la práctica médica y en algunas patologías, la única terapia existente. Sin embargo, el éxito de la hemoterapia depende de que se asegure compatibilidad entre el donador y el receptor de un hemocomponente. Por ejemplo, las primeras transfusiones de sangre documentadas (que datan del siglo XVII), terminaron en la muerte de los receptores de la donación. Gracias a los avances y descubrimientos en el área de la Inmunohematología que fueron realizados a partir del siglo XX, pudo comprenderse que la existencia de antígenos y grupos sanguíneos o de anticuerpos dirigidos contra estos, son factores determinantes del éxito y beneficio de una transfusión sanguínea. Las primeras pruebas de compatibilidad se realizaron tomando en cuenta la necesidad de que donante y receptor fuesen ABO compatibles. Los pioneros en este campo mezclaban el suero del paciente con las células rojas del donador y estudiaban la lisis, la aglutinación o ambas del glóbulo rojo, lo que se conoce como la prueba cruzada mayor. Actualmente el cruce de sangre para la compatibilidad sanguínea forma parte de una serie de procedimientos conocidos como pruebas pretransfusionales, las cuales tienen el propósito de seleccionar los hemocomponentes con menor probabilidad de causar una reacción adversa en el receptor y prevenir sobre todo las reacciones por incompatibilidad de grupos. Para que un hemocomponente pueda ser utilizado en un paciente particular, las normas internacionales (AABB) indican que debe cumplirse de previo con los siguientes procedimientos: - Solicitud del hemocomponente por parte del médico tratante. - Muestra del receptor. La identidad del paciente y de la muestra deben ser corroboradas, con el fin de evitar cualquier tipo de confusión. - Pruebas al donante: grupo ABO/Rh, determinación del fenotipo Rh y Kell, detección de anticuerpos irregulares y serología para enfermedades transmisibles por transfusión sanguínea. - Pruebas al receptor: grupo ABO/Rh, detección de anticuerpos irregulares. - Prueba cruzada mayor.

10 Además, es necesario incluir diferentes etapas de verificación que permitan confirmar que efectivamente se están trabajando las muestras correspondientes al hemocomponente y al receptor. Este proceso, como se indicó anteriormente, al ser realizado correctamente y siguiendo estrictas normas de control de calidad, permite disminuir considerablemente los riesgos de una reacción postranfusional. Tomando en cuenta los antígenos del sistema de grupos sanguíneos ABO y Rh (D) la compatibilidad puede alcanzar hasta un 98%; el resto del porcentaje restante se logra por medio del estudio de anticuerpos irregulares clínicamente significativos y la prueba de compatibilidad entre el suero del receptor y los eritrocitos del donador. A pesar de esto, siempre existe la posibilidad de que existan anticuerpos irregulares en cantidades no detectables antes de la transfusión, o con especificidades no reconocidas por los paneles de células más comúnmente utilizados. PROCESO DE LAS PRUEBAS PRETRANSFUSIONALES La Solicitud, identificación y colección de la muestra de sangre: Aproximadamente el 50% de las reacciones por transfusión se deben a reacciones hemolíticas secundarias a errores de tipo clerical por identificación equívoca del paciente a transfundir, confusión al momento de extraer la muestra, o en el laboratorio. Los procedimientos exactos en la identificación del paciente, la muestra sanguínea y la unidad a transfundir, tienen que estar perfectamente definidos y escritos en Manuales de Procedimiento de Banco de Sangre, en forma de rutas críticas para ser consultados cuando sean requeridos. Antes de realizar la extracción de sangre, el tubo y la solicitud deben de coincidir con la identificación del paciente, preguntando directamente cuando sea factible al paciente o corroborando con brazaletes de identificación; nunca se debe de guiar por los números de cama ya que los pacientes pueden ser cambiados dependiendo de la necesidad del servicio. La solicitud debe tener como datos mínimos: Identificación del paciente, número de cédula de identidad o pasaporte. Nombre completo y edad del receptor. Sexo. En caso de conocerse se debe de indicar valores como por ejemplo grupo ABO y Rh, hemoglobina y hematocrito, antecedentes transfusionales, gestaciones, inmunización materno fetal, reacciones adversas que se hubieran presentando y medicamentos que se están administrando. Diagnóstico de certeza o de probabilidad, así como el motivo de la indicación transfusional. Número de expediente, cama y nombre del servicio donde será transfundido.

11 Señalar el producto a solicitar incluyendo cantidad de unidades, volumen o características requeridas. Fecha y hora en que se realizará la transfusión y, de ser necesario el señalamiento de la urgencia de la transfusión. Fecha, nombre completo y firma del médico que indica la transfusión. Las solicitudes transfusionales deben ser escritas en forma legible para evitar al máximo la equivocación. Después de haber realizado una adecuada identificación del receptor, la muestra de sangre debe ser obtenida, usando técnicas muy cuidadosas para evitar hemólisis, ya que la misma produce activación del complemento y algunos anticuerpos pueden ser enmascarados al requerirse del complemento para visualizar la reacción antígeno-anticuerpo. Si no existen problemas serológicos de fondo son suficientes 5 ml de sangre del receptor para realizar todos los procedimientos inmunohematológicos. DETERMINACIÓN DEL GRUPO SANGUINEO ABO/ Rh EN EL RECEPTOR Grupo ABO En la medida de lo posible los receptores deberán recibir hemocomponentes sanguíneos ABO idénticos, sin embargo, en ciertas situaciones puede ser necesario hacer selecciones alternativas. La determinación del grupo ABO es el paso más importante de las pruebas serológicas pretransfusionales. Se emplean antisueros hemoclasificadores anti A y anti B para determinar grupo eritrocítico y glóbulos rojos con antígenos A1 y B para la prueba inversa. En receptores menores de 4 meses de edad la prueba inversa no se realiza, ya que en este tipo de pacientes el desarrollo de los anticuerpos naturales todavía es inmaduro. En caso de discrepancias entre grupo directo e inverso se emplearán técnicas adicionales antes de establecer el tipo sanguíneo. Cuando se está en presencia de una urgencia extrema, en la que el grupo ABO no se puede determinar se podrá utilizar glóbulos rojos empacados del grupo O para transfundir. ESQUEMA DE SELECCION DE HEMOCOMPONENTES POR ABO: Si se va a transfundir sangre total o sangre total reconstituida no hay alternativa transfusional, todas deberán de transfundirse grupo ABO idéntico.

12 Si la solicitud se refiere a Glóbulos Rojos Empacados se pueden utilizar alternativas como se indican en la tabla 1 dependiendo de las existencias y reservas del Banco de Sangre. Tabla 6: Alternativas de selección de unidades de Glóbulos Rojos Empacados dependiendo del grupo ABO del paciente a transfundir Grupo Alternativas del Paciente Primera Segunda Tercera Cuarta O O A A O - - B B O - - AB AB A * B* O * Uno u otro de estos grupos sanguíneos pueden ser utilizados en cualquier momento, pero si se escoge uno debe de mantenerse por el resto de las transfusiones realizadas, no es recomendable hacer cambio de grupo. Debido a lo anterior, se prefiere la utilización de unidades del grupo A sobre B, ya que la frecuencia en la población del grupo A es mayor y, por lo tanto, es más frecuente encontrar más cantidad de sangre A en reservas en los Bancos de Sangre. Grupo Rh La identificación de antígeno Rh D se realiza usando el hemoclasificador anti D, la prueba puede realizarse en tubo o en placa de acuerdo a lo establecido por el fabricante y será validado mediante una prueba de control en paralelo, que permita demostrar que el eritrocito previamente no tenía inmunoglobulina tipo IgG adherida en la superficie, si el control es positivo, el resultado debe ser invalidado. Cuando la prueba da un resultado negativo, se investigará la expresión débil del antígeno con la utilización del reactivo de antiglobulina humana, en neonatos y donadores de sangre. Las reacciones positivas con anti D, incluyendo el antígeno D expresado débilmente se clasificarán como Rh POSITIVOS y los restantes como Rh NEGATIVOS. Si el grupo Rh no puede ser establecido, dado a que el control también presenta aglutinación y la transfusión es urgente podrá ser utilizado glóbulos rojos empacados Rh negativo. Los hemocomponentes Rh positivos deberán rutinariamente ser enviados a receptores Rh positivos.

13 El uso de productos Rh negativos para pacientes Rh positivos es permitido, aunque en forma ideal, deberán de reservarse exclusivamente para pacientes o receptores Rh negativos. De forma inversa, los productos Rh negativos pueden no estar disponibles, en esta situación se podrá optar por otras medidas alternativas, como posponer la transfusión o en caso de que el retardo de la transfusión ponga en peligro la vida del paciente y siempre que el rastreo de anticuerpos del paciente esté negativo se podría utilizar sangre Rh positiva con un riesgo de inmunización de un 70%. PRUEBA CRUZADA PARA TRANSFUSIÓN DE ERITROCITOS El cruce de sangre en la actualidad ha sido expuesto a una serie de interrogantes en cuanto a si debe ser eliminada o no en aquellos pacientes que no presentan anticuerpos irregulares. Lo anterior, dado que el rastreo rutinario de anticuerpos en los sueros del receptor y del donador tiene una alta sensibilidad. Esto no aplica para cuando la transfusión sea destinada a un paciente que presente anticuerpos clínicamente significativos. A estos pacientes, una vez identificado el anticuerpo y seleccionada una unidad carente del antígeno es obligatorio realizar la prueba cruzada. La prueba cruzada mayor se refiere a la técnica mediante el cual se demuestra la ausencia de anticuerpos en el plasma del receptor contra los antígenos del glóbulo rojo del donador. Por otro lado, la prueba cruzada menor se refería al cruce entre los eritrocitos del receptor con el suero del donador y ha sido sustituida en la mayoría de los bancos de sangre por el rastreo rutinario de anticuerpos clínicamente significativos en los donantes de sangre. En caso de existir en el donante un anticuerpo de baja incidencia en su plasma estos probablemente no causen una reacción transfusional al ser diluidos en el plasma del receptor. También se han modificado los medios de reacción, las temperaturas óptimas y los períodos de incubación, seleccionando procedimientos con un menor tiempo, costo y un máximo de detecciones de incompatibilidad. La incubación de la prueba cruzada a temperatura ambiente ha sido siendo eliminada y se cambió por la fase I de lectura rápida. La prueba cruzada está constituida por tres fases que se describen en detalle en la parte del procedimiento y se considera que existe compatibilidad cuando no se visualiza hemólisis o aglutinación en ninguno de los pasos de la prueba.

14 PRUEBA CRUZADA EN SITUACIONES ESPECIALES Urgencias. La necesidad urgente de transfusión en ciertas situaciones clínicas establece que la sangre sea liberada antes de que la prueba cruzada sea terminada. El médico tratante debe estar consciente de este riesgo y firmar una hoja de autorización para que la unidad sanguínea sea liberada, mientras el Banco de Sangre finaliza la prueba. En caso de que durante el proceso se determine alguna incompatibilidad en alguno de los pasos se dará aviso de inmediato al médico encargado para que se administre el tratamiento oportuno. De acuerdo a la necesidad de liberación urgente del producto sanguíneo el Banco de Sangre puede optar por: Enviar glóbulos rojos empacados del grupo O Rh negativo y en caso de no tener en existencia emplear grupo O Rh positivo cuando se desconozca el grupo sanguíneo del receptor. Enviar sangre compatible a grupo ABO y Rh del receptor y donador. Siempre que sea posible, realizar la primera fase de centrifugación inmediata antes de enviar el producto sanguíneo. Cuando la transfusión no es de extrema urgencia, pero la sangre se requiere lo más pronto posible, se puede acortar el tiempo de incubación de la fase II de la prueba cruzada, empleando diferentes medios de reacción que requieran un período de incubación más breve a 37ºC para finalizar con la fase de Antiglobulina Humana. Prueba de compatibilidad para productos plasmáticos Deberán ser transfundidos con la corroboración previa del grupo inverso de acuerdo al esquema transfusional que se indica en la tabla 7. En el caso de la transfusión de plasma no se debe tomar en consideración el tipo Rh del paciente o donante debido a que estas unidades no contienen el antígeno D. Para el caso de la transfusión de plaquetas, estas deben de ser transfundidas bajo el esquema de sangre total pues poseen componentes celulares y plasmáticos. También para las plaquetas, dependiendo del tipo de receptor y del volumen de células transfundidas se puede considerar la administración de inmunoglobulina Rh a los pacientes Rh negativos transfundidos con productos Rh positivos. Tabla 7: Alternativas de selección de unidades de plasma dependiendo del grupo ABO a transfundir Grupo del Paciente Alternativas Primera Segunda Tercera Cuarta

15 O O A* B* AB A A AB - - B B AB - - AB AB * Uno u otro de estos grupos sanguíneos pueden ser utilizado en cualquier momento, pero si se escoge uno debe de mantenerse por el resto de las transfusiones realizadas, no es recomendable hacer cambio de grupo. Materiales y reactivos: Frascos de anti A, anti B, anti AB, anti D, anti A 1, Reactivo de antiglobulina humana, albúmina al 22%, células A y B al 3%. Tubos con muestras de eritrocitos a analizar. Tubos con muestras de suero a analizar. Células rastreadoras. Tubos de 12 x 75 mm para realizar las reacciones Solución salina al 0.85% (Pizetas). Centrífugas Serológicas. Microscopios. Frascos con células control de antiglobulina humana. Pipetas Pasteur. Bulbos para pipeta Pasteur. Baños de María a 37ºC. Portaobjetos. Caja de aplicadores. Gradillas metálicas. Gradillas madera. Papel toalla. Método: Rotular los tubos con el nombre Paciente 1, Paciente 2, Paciente 3 y Paciente 4 Realizar suspensiones de trabajo 3-5% de los donantes 1, 2, 3 y 4. Añadir 50ul de la suspensión del donante 1 al tubo rotulado como Paciente 1. Añadir 50ul de la suspensión del donante 2 al tubo rotulado como Paciente 2. Añadir 50ul de la suspensión del donante 3 al tubo rotulado como Paciente 3. Añadir 50ul de la suspensión del donante 4 al tubo rotulado como Paciente 4. Añadir 100ul del suero del paciente 1 al tubo rotulado como paciente 1. Añadir 100ul del suero del paciente 2 al tubo rotulado como paciente 2.

16 Añadir 100ul del suero del paciente 3 al tubo rotulado como paciente 3. Añadir 100ul del suero del paciente 4 al tubo rotulado como paciente 4. Añadir 100 ul de albúmina bovina al 22% a todos los tubos. Mezcle los tubos, a partir de este momento iniciamos con las tres fases de la prueba de antiglobulina humana indirecta. Fase I: Centrifugación inmediata o prueba rápida: Centrifugar los tubos 15 segundos a 3500 rpm. En esta fase se establece la compatibilidad al sistema ABO, sin embargo, otros anticuerpos (ejemplo: auto-anti-i), pueden también ser detectados en esta fase. Leer y realizar las anotaciones. Fase II o a 37ºC: Después de la lectura anterior colocar todos los tubos a 37ºC por 30 minutos. Al concluir la incubación sacar los tubos del baño y centrifugar por 10 segundos a 3000 rpm. Leer y hacer las anotaciones correspondientes. Realizar tres lavados con solución salina fisiológica. Llevar la prueba a la fase de antiglobulina. Fase III o antiglobulina: Añadir 100ul del reactivo de antiglobulina humana poliespecífico. Mezclar y centrifugue 10 segundos a 3000 rpm. Leer y realizar anotaciones. Las reacciones con resultado negativo confirmar con las células control. Durante el período de incubación realizar las determinaciones de grupo sanguíneo eritrocitario a cada una de las suspensiones de los pacientes y donantes. RESULTADOS Prueba Cruzada Fase I Paciente 1/ Donante 1 Paciente 2/ Donante 2 Paciente 3/ Donante 3 Paciente 4/ Donante 4 Fase II Fase III Grupo ABO/Rh Donante Grupo ABO/Rh Paciente Anti-A Anti-B Anti-D Control Grupo

17 eritrocítico ABO /Rh Paciente 1 Paciente 2 Paciente 3 Paciente 4 Anti-A Anti-B Anti-D Control Grupo eritrocítico ABO /Rh Donante 1 Donante 2 Donante 3 Donante 4 Interpretación de Resultados: Paciente 1: Paciente 2: Paciente 3: Paciente 4:

18 Recomendaciones: Los resultados de las pruebas deberán ser leídos contra luz blanca. Se puede utilizar espejos magnificadores, lentes y microscopios que ayuden con la lectura de las pruebas. El botón de las células se resuspenderá, se hará la lectura y se asignará los puntajes en cruces en la hoja de trabajo. En caso de resultados incompatibles deberán ser investigados en busca de su causa. Consideraciones finales: Procedimiento 21 Identificación de Anticuerpos Principio Una vez que se ha detectado la existencia de un anticuerpo irregular se debe identificar su especificidad y su importancia clínica. La determinación de la especificidad de los anticuerpos detectados en los análisis pretransfusionales es importante para seleccionar unidades que no posean el antígeno contra el cual va dirigido el anticuerpo. Los paneles de identificación están compuestos por juegos de 8 a 16 tipos diferentes de células del grupo O con fenotipo conocido contra los principales antígenos de grupo sanguíneo.

19 Estos paneles poseen células positivas y negativas en combinación estratégica para poder identificar anticuerpos contra alguno de los siguientes antígenos de grupo sanguíneo: D, C,E, c, e y usualmente V, VS, f, C w M, N, S, s Fy a, Fy b Jk a, Jk b K, k y usualmente Kp a, Kp b, Js a, Js b Lu a, Lu b Le a, Le b P1 Xg a Otros antígenos con fenotipo poco frecuente pueden ser incluidos dentro del panel e incluso pueden estar incluidos dependiendo de la zona geográfica donde se encuentre la investigación. El panel de identificación dispone de una tabla antigénica de reacción donde se indica la positividad de los diferentes antígenos en relación a la célula que se está analizando, así como el lote del reactivo, fecha de vencimiento y un lugar destinado para hacer las anotaciones de los resultados obtenidos y sus interpretaciones. Para el estudio de anticuerpos es importante tener presente las características de los anticuerpos como son: - rango térmico, - temperatura óptima de reacción, - sensibilidad o aumento de reacción con enzimas, - fuerza de reacción de los resultados positivos, tanto aglutinación como hemólisis. - Resultado del autocontrol para la detección de autoanticuerpos. Si se tiene la sospecha que en el estudio están presentes dos o más anticuerpos se puede hacer uso de diferentes técnicas, procesos y reactivos durante el análisis. La aplicación de dos o más técnicas o medios de reacción permite separar los anticuerpos en base a sus características de reacción con sus antígenos respectivos, de tal manera que permitan separarlos y diferenciarlos con mayor claridad. Dentro de estas técnicas se deben considerar la utilización de procedimientos de absorción/elución, reacciones a diferentes temperaturas y uso de enzimas como medio de reacción. La mayoría de pacientes se sensibilizan contra un único antígeno y es fácil determinar su especificidad, basta con ubicarse en el perfil de reacción dentro de la tabla antigénica del panel.( 1,2 )

20 Características de los anticuerpos en las fases de reacción: Fase de Centrifugación Inmediata: A 22ºC reaccionan mejor los anticuerpos del tipo IgM como el M, N, Lewis, y el P. El anti I tiene un rango térmico desde 4ºC hasta fase de antiglobulina, sin embargo, su temperatura óptima es de 4ºC, por lo que para detectarlo mejor se debe incubar en el refrigerador. INCUBACION A 37ºC: En este grupo se incluyen los anticuerpos del tipo IgG que tiene la capacidad de aglutinar sin llegar a la fase de antiglobulina humana. Se pueden mencionar los anti C, c, E, e, que reaccionan óptimamente al ser incubados por 30 minutos. También pueden reaccionar a esta temperatura el anti S, s, D y el Kell. FASE DE ANTIGLOBULINA HUMANA: En esta fase se incluyen todos los anticuerpos tipo IgG no aglutinantes como el anti Duffy, Kidd, Lutheran, S, s y Cellano. EQUIPOS Y REACTIVOS: Solución salina fisiológica Panel de identificación Panel de identificación tratado con enzima Tubos 12 x 75mm para reacción. Centrífugas serológicas. Papel toalla. Pipetas Pasteur. Bulbos para pipetas Pasteur. Tubos rotulados como muestra 1 con de suero/plasma a identificar. Tubos rotulados como muestra 2 con de suero/plasma a identificar. Tubos con eritrocitos a analizar Frascos con cloroformo. Tubos 13 X 100 mm. Tapones rojos. Pipetas 10 ml. Pipeteadores. Método: Panel de identificación Mezclar con suavidad y homogenizar el juego de reactivos del panel de identificación según corresponda. Rotular un juego de 11 tubos con el número y la muestra a analizar.

21 Añadir 50ul de las células reactivo correspondiente 1 al tubo rotulado como células 1. Añadir 50ul de las células reactivo correspondiente 2 al tubo rotulado como células 2 y así sucesivamente hasta completar los 11 tubos. Añadir 100ul del suero o plasma a estudiar a los 11 tubos. A todos los tubos añadir 100ul del reactivo de albúmina bovina al 22%. Mezclar y a partir de este momento se inicia con las tres fases de la prueba de antiglobulina humana indirecta. Anotar los resultados obtenidos en la tabla antigénica que corresponde al lote del panel. Identificar según perfil antigénico obtenido el antígeno contra el cual va dirigido el anticuerpo en estudio. Procedimiento 22 Técnica de adsorción de anticuerpos Principio En inmunohematología se habla de adsorción cuando se utilizan células con fenotipo conocido para provocar que un anticuerpo se pegue a la superficie del glóbulo rojo. A partir de un proceso de adsorción se pueden separar a nivel de laboratorio dos o más anticuerpos mezclados en un suero. Como primer punto para seleccionar las células a utilizar en la absorción se deben agrupar las reacciones obtenidas en el panel de identificación y establecer cuáles eventuales anticuerpos pueden estar presentes.

22 Seguidamente se debe buscar dentro de las unidades del Banco de Sangre una unidad cuyo fenotipo posea sólo uno de los antígenos que se sospecha. Una vez seleccionada la unidad se toma una alícuota y se realiza el proceso de adsorción bajo las condiciones óptimas del anticuerpo en estudio. La parte final del proceso establece una centrifugación que sirve para separar los glóbulos rojos sensibilizados del plasma y así obtener los dos anticuerpos separados. EQUIPOS Y REACTIVOS: Solución salina fisiológica Panel de identificación Panel de identificación tratado con enzima Tubos 12 x 75mm para reacción. Centrífugas serológicas. Papel toalla. Pipetas Pasteur. Bulbos para pipetas Pasteur. Tubos rotulados como muestra 1 con de suero/plasma a identificar. Tubos rotulados como muestra 2 con de suero/plasma a identificar. Tubos con eritrocitos a analizar Baños a 37ºC Tubos 13 X 100 mm. Tapones rojos. Pipetas 10 ml. Pipeteadores. Método: - Seleccionar una unidad adecuada para adsorción de glóbulos rojos y tomar estérilmente una alícuota de unos 20 ml. - Lavar tres veces el paquete con solución salina fisiológica. - Dejar el paquete el máximo posible sin salina después del último lavado. - Agregar igual cantidad del suero en estudio. - Incubar a 37ºC por 30 minutos. - Mezclar cada 10 minutos para ayudar al proceso de adsorción. - Tomar una muestra de eritrocitos y realizar una prueba de antiglobulina humana directa. - Mantener en incubación a 37ºC, hasta que se alcance el máximo de positividad de antiglobulina humana directa, idealmente debe tener una aglutinación de 3 a 4 cruces. - Centrifugar 10 minutos a 2000 r.p.m, para separar el suero adsorbido y los eritrocitos sensibilizados. - Rotular un tubo con los datos necesarios y transferir el suero del tubo centrifugado. - Al suero realizar el panel de identificación de anticuerpos. - Al paquete globular realizar procedimiento de elución.

23 Procedimiento 23 Técnica de Elución de Anticuerpos Principio El término elución significa en Inmunohematología liberar los anticuerpos unidos a la membrana del glóbulo rojo proveniente de un proceso de adsorción. Dependiendo de las necesidades y protocolos de trabajo del Banco de Sangre se puede: Separar el anticuerpo conservando la integridad de la membrana del glóbulo rojo o se puede Separar el anticuerpo rompiendo las membranas del eritrocito mediante agentes químicos como el éter, cloroformo, digitonina o mediante condiciones físicas extremas como la congelación o el calor. Una vez liberado el anticuerpo en el eluído se procede a determinar su especificidad a través del panel de identificación de anticuerpos. EQUIPOS Y REACTIVOS: Solución salina fisiológica Panel de identificación Panel de identificación tratado con enzima Tubos 12 x 75mm para reacción. Centrífugas serológicas. Papel toalla. Pipetas Pasteur. Bulbos para pipetas Pasteur. Tubos rotulados como muestra 1 con de suero/plasma a identificar. Tubos rotulados como muestra 2 con de suero/plasma a identificar. Tubos con eritrocitos a analizar Frascos con cloroformo. Baños a 37ºC. Tubos 13 X 100 mm. Tapones rojos. Pipetas 10 ml. Pipeteadores. Método:

24 Técnica de elución con cloroformo - Tomar el paquete de glóbulos rojos sensibilidados después del proceso de adsorción. - Lavar una vez con solución salina. - A un volumen igual de células lavadas agregar un volumen de cloroformo. - Tapar el tubo y agitar fuertemente por 1 minuto. - Centrifugar 10 minutos a 2000 r.p.m, - El tubo queda dividido en tres capas, una del cloroformo, otra de restos de membrana y un eluido o hemolizado donde se encuentra el anticuerpo separado. - Transferir el eluído a otro tubo y realizar un panel de identificación de anticuerpos. Recomendaciones: Para encontrar la especificidad del anticuerpo los resultados positivos por aglutinación así como los negativos deben ser comparados con la tabla antigénica del panel en su lote respectivo. Para trabajar procedimientos de adsorción/elución siempre tomar en consideración la temperatura óptima de reacción. Esta va a ser la temperatura donde ocurrió la aglutinación más fuerte. Anotaciones y consideraciones finales: Práctica: Esta práctica incluye los procedimientos del 20 al 22 inclusive. Se trabajará en grupo de trabajo por mesa en dos sesiones de laboratorio. La primera sesión realizar la identificación de anticuerpos con panel corriente y panel con enzima. Con las muestras indicadas realizar proceso de adsorción y elución de anticuerpos. Obtener el suero adsorbido y colocar en la gradilla para trabajarlo en la siguiente sesión de laboratorio.

25 Obtener el eluído y colocar en la gradilla para trabajarlo en la siguiente sesión de laboratorio. La segunda sesión de laboratorio realizar la identificación de anticuerpos del suero adsorbido y del eluído. Hacer el análisis y resolución de los casos de identificación de anticuerpos propuestos.

26 PRACTICA DE CASOS:

27

28

29 Procedimiento 24 Incompatibilidad materno- fetal Principio La enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN) es una enfermedad en la cual la madre en gestación produce in vivo aloanticuerpos del tipo IgG contra antígenos de glóbulo rojo del feto que este heredó del padre. Debido a esta sensibilización, los glóbulos rojos sufren una destrucción acelerada tanto antes como después del nacimiento. Para los recién nacidos que padecen la enfermedad hemolítica la elevación de los niveles de bilirrubina se convierte en un problema clínico más grave que la pérdida de la capacidad de transporte de oxígeno como resultado de la hemólisis. Los antígenos localizados en la membrana de los eritrocitos, se desarrollan en diferentes etapas de la vida intrauterina o postnatal. Los antígenos contra el sistema de grupo sanguíneo Rh, Kell, MNSs, Duffy por mencionar algunos, presentan al nacimiento una potencia antigénica similar a la observada en los eritrocitos de una persona adulta. Otros, por el contrario, se encuentran poco desarrollados, de ahí que su expresión antigénica sea menor que los antígenos de un eritrocito de una persona adulta, ejemplos de estos antígenos pueden ser los sistemas ABO, P1 y Lutheran. También hay antígenos que están muy pobremente expresados al nacimiento y es hasta después del primer año de vida cuando logran expresarse completamente, ejemplos de estos antígenos son los del sistema Lewis y el antígeno I. El contar con este tipo de información es importante pues a pesar de que la madre sea portadora de alguno de los anticuerpos de la clase IgG contra algún antígeno que no esté bien desarrollado al nacimiento, como por ejemplo un anti-lea, la debilidad o ausencia antigénica en el eritrocito del feto, impide que se inicie o exprese la enfermedad. En estos casos, puede existir la incompatibilidad eritrocitaria, sin embargo, no es una evidencia irrefutable del diagnóstico etiológico de la enfermedad hemolítica. Las acciones básicas en el estudio de la EHRN, se ajustan a las circunstancias en que se ubica el médico y el paciente. Una manera de estudiar los casos es dividiendo a los sujetos de estudio en tres grupos: el feto o neonato, la madre y el padre. Al feto o neonato se le debe realizar al menos las siguientes pruebas para su estudio: Grupo ABO/Rh, prueba de antiglobulina directa, fenotipo eritrocitario, rastreo de anticuerpos con las células pantallas y con las células A1 y B procedente del eluído de la muestra.

30 Si la muestra lo permite rastreo de anticuerpos con las células A1 y B procedente del suero de la muestra. Que se busca con estos análisis? Demostrar la presencia del antígeno en los glóbulos rojos del feto/neonato. Demostrar la presencia del anticuerpo en el suero o glóbulo del feto neonato y por consiguiente la reacción hemolítica que se está produciendo. Análisis en la madre: Determinar grupo ABO/Rh. Realizar estudio de anticuerpos. Fenotipo Que se busca con ellos? Demostrar la ausencia del antígeno. Demostrar la presencia del anticuerpo. Análisis al padre: Determinar grupo ABO/Rh. Determinar el fenotipo eritrocitario. Que se busca con ellos? Demostrar la presencia del antígeno en los glóbulos rojos paternos. De esta manera se puede contar con un panorama más completo de la situación y se puede iniciar la evaluación del caso. La enfermedad hemolítica del recién nacido, desde el punto de vista inmunohematológico, se puede clasificar en tres categorías principales dependiendo de la especificidad del anticuerpo sensibilizante: Enfermedad Hemolítica por ABO, principalmente por un anti-a,b en mujeres del grupo O. Enfermedad Hemolítica por Rh, debida al anti-d. Enfermedad Hemolítica por otros anticuerpos irregulares. Transfusión intrauterina y del neonato La sangre para transfusión intrauterina debe ser seleccionada compatible con los anticuerpos maternos capaces de cruzar la placenta. Los glóbulos rojos empacados seleccionados para la transfusión intrauterina deberán ser de preferencia O Rh negativo, y utilizando el suero de la madre para realizar las pruebas de compatibilidad.

31 Para las unidades de exanguíneotransfusión deberán ser compatibles con cualquier anticuerpo materno que hubiera entrado a la circulación fetal. Todas las unidades seleccionadas para estos procedimientos deberán ser del grupo sanguíneo O, filtradas, irradiadas, de menos de 5 días de recolectada y en el caso para las exanguíneotransfusión el plasma para su reconstitución deberá ser compatible con el grupo ABO del recién nacido. Materiales y Reactivos: Tubos 12 x 75 mm de reacción. Pipetas Pasteur. Bulbos pipetas. Muestras de suero y eritrocitos a analizar Solución salina fisiológica. Juego de reactivos anti A, anti B, anti AB, anti D, albúmina bovina al 22%, reactivo de antiglobulina hunana. Panel de identificación de anticuerpos. Frascos con células control de AGH. Juego de células rastreadoras 3%. Baños maría a 37 C. Centrífugas serológicas. Gradillas de madera. Gradillas de metálicas. Microscopios. Papel toalla. Método: Realizar a la muestra de sangre rotulada como niño una prueba de inmunoglobulina directa. Determinar el grupo sanguíneo ABO/Rh del niño. Realizar a la muestra de plasma de la madre un rastreo e identificación de anticuerpos. Realizar una prueba cruzada entre la muestra del niño y el plasma del donador. RESULTADOS: Tipo de incompatibilidad materno fetal analizada: Rastreo de anticuerpos materno: Identificación de anticuerpo materno:

32 Prueba cruzada: Anotaciones y consideraciones finales: Procedimiento 25 Anemia Hemolítica Autoinmune Principio La anemia hemolítica inmune se define como un acortamiento en la sobrevida del glóbulo rojo debido a/o a través del sistema inmune, específicamente por los autoanticuerpos. Las anemias hemolíticas autoinmune se clasifican en: Anemia Hemolítica Autoinmune por anticuerpos calientes Síndrome de aglutininas frías Hemoglobunuria paroxística al frío Anemia Hemolítica Autoinmune Combinada (Anticuerpos fríos y calientes) Anemia Hemolítica Inmune inducida por drogas Anemia Hemolítica Inmune inducida por alloanticuerpos

33 Cada una de estas se subclasifica en grupos de enfermedades dependiendo de la causa que desencadena la enfermedad, es decir, si es primaria o secundaria. La Anemia Hemolítica Autoinmune es designada como primaria si se considera como una entidad idiopática, es decir, si no está asociada con alguna enfermedad demostrable que la desencadene. En contraste, la secundaria está asociada con un desorden primario y con razones suficientes para sospechar que su asociación es más que meramente fortuita. Estos desordenes son diagnosticados en base a las características serológicas de reacción. La mayoría de los casos de AHAI son causados por autoanticuerpos cuya reacción es en caliente, es decir, anticuerpos cuya reactividad optima con los glóbulos rojos humanos es a 37ºC y que por lo general es una inmunoglobulina de la clase IgG. El Síndrome de Aglutininas frías es generalmente causado por un autoanticuerpo de la clase IgM y que exhibe una reactividad máxima a 4ºC. El anticuerpo causante de la Hemoglobinuria Paroxística Nocturna es una inmunoglobulina IgG bifásica que difiere en su modo de acción. Este anticuerpo se detecta in vitro por su habilidad de causar hemólisis de los glóbulos rojos normales en un procedimiento que lleva dos pasos, una incubación en frío seguido por una incubación a 37ºC en presencia del complemento. Finalmente, la ingesta de ciertos medicamentos pueden causar anemia hemolítica pero aquí el anticuerpo siempre posee una especificidad por la droga o sus metabolitos. Reactivos y materiales: Tubos 12 x 75 mm de reacción Pipetas Pasteur. Bulbos pipetas. Muestras de suero y eritrocitos a analizar Solución salina. Reactivo de antiglobulina humana poliespecífico. Reactivo de antiglobulina humana monoespecífico IgG. Reactivo de antiglobulina humana monoespecífico C3 Panel de identificación eritrocitos. Frascos con células control de AGH. Juego de células rastreadoras 3%. Baños maría a 37 C. Centrífugas serológicas. Gradillas de madera. Gradillas de metálicas. Microscopios. Papel toalla.

34 Método: De la muestra en estudio: Hacer una suspensión de trabajo entre el 3-5% y: Realizar una prueba de antiglobulina humana directa utilizando el reactivo poliespecífico. Realizar una prueba de antiglobulina humana directa utilizando el reactivo monoespecífica IgG. Realizar una prueba de antiglobulina humana directa utilizando el reactivo monoespecífico C3. Realizar un rastreo e identificación de anticuerpos. RESULTADOS Prueba de antiglobulina humana directa: MUESTRA Poliespecífico Monoespecífico IgG Monoespecífico C3 Rastreo de anticuerpos: Identificación: Interpretación de Resultados:

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