Ruptura y Disrupción celular

Transcripción

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2 Utilización de las reglas de oro de la purificación REGLA 1 Elegir procesos de separación basados en diferentes propiedades físicas, químicas o bioquímicas REGLA 2 Separar las impurezas más abundantes primero Es importante eliminar el agua en las primeras etapas del proceso. Tratar de reducir el material de trabajo hasta un 90% del volumen inicial REGLA 3 Seleccionar un proceso que permita aprovechar al máximo las diferencias entre las propiedades fisicoquímicas del producto y los contaminantes. - Se deben conocer las propiedades del producto y de las principales impurezas REGLA 4 Realizar las separaciones más caras y difíciles al final KEEP IT SIMPLE!

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4 Ruptura y Disrupción celular

5 1.Separación celular: Costos de los procesos de centrifugación son más dependientes del tamaño de las partículas que los procesos de separación con membranas Filtración por membrana más económica Total separation co osts Centrifugación más economica Average particle size (units) Se pierde de 1 al 5% del material Centrifugación (part > 2 u)

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8 DISRUPCIÓN EN GRAN ESCALA Mecánica No mecánica Molino de bolillas Homogeinizador FISICA Descompresion Shock osmotico Termolisis QUIMICA Antibioticos Agentes quelantes Caotropos Detergentes Solventes Hidroxido ENZIMATICA Enzimas liticas

9 Métodos Químicos Tratamiento con Alcali Ventajas: Económico y fácilmente escalable. Desventajas: El producto debe ser estable a las condiciones sometidas. Caso Proteínas Recombinantes No quedan células viables

10 Solventes Orgánicos Fundamentos de su uso: Extracción de algún componente lipídico de las membranas? Ventajas: Económicos, escalables. Ciertos solventes actúan sin que queden microorganismos viables. Desventajas: El producto de interés puede ser sensible a la acción del solvente. El manejo de grandes volúmenes de solventes requiere una infraestructura adecuada tanto para el proceso de ruptura como para su descarte y/o reutilización. El solvente más utilizado es el TOLUENO. Solventes miscibles con agua (ETOH, Acetona) pueden liberar proteínas del espacio periplásmico.

11 Detergente- Permeabilización de la Pared Celular Fundamento: Solubilización de componentes proteicos de las membranas. Desestabilización. Ventajas: Permeabilización, no se liberan grandes cantidades de componentes intracelulares (ácidos nucleicos, proteínas, etc). Desventaja: Costosos. Muy difíciles de eliminar. El producto puede verse afectado por su acción. Ejemplos: Triton X-100, Tween, etc. Pueden utilizarse en forma conjunta con Agentes Caotrópicos (Guanidina-HCl, UREA). Estos actúan también por solubilización de componentes proteicos de las membranas. Peligro: Desnaturalización. Deben ser eliminados en las etapas siguientes (ejemplo, por UF)

12 Métodos Biológicos Lisis enzimática Fundamento: Enzima o conjunto de enzimas que actúan clivando uniones específicas de los componentes de la pared celular. Ejemplo: Lisozima (hidroliza uniones β-1,4- glicosídicas). Bacterias Gram -: Membrana externa impide el ataque enzimático. Agregado de agentes quelantes (EDTA) las vuelven susceptibles. Ventajas: Eligiendo correctamente el sistema de enzimas no se vería afectada la actividad del producto. Desventaja: Liberación de ácidos nucleicos (DNAasa y posterior activación). Costoso. Contamino el producto con otra proteína que después debe ser eliminada y es irrecuperable.

13 Métodos Físicos- Mecánicos Molino Húmedo

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15 Molino Húmedo Ecuación que rige el proceso: Ln (Rm/Rm-R) = k.t RM : determinada experimentalmente y definida por una metodología adecuada Método CONTINUO Variables que lo afectan: Velocidad del agitador, velocidad de ingreso de la suspensión a la cámara de agitación, geometría de la cámara, tamaño de las partículas abrasivas, concentración celular, densidad de partículas, diseño del agitador. A tener en cuenta: generación de altas temperaturas por la fricción.

16 Métodos Físicos Mecánicos Homogeneizador de alta presión

17 Diseño de la Válvulo de Impacto

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20 Homogeinizador de laboratorio(niro Soavi) 170 ml/minuto 1500 bar

21 Homogeinizador escala industrial

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23 Ecuación que rige el proceso: Ln (Rm/Rm-R) = k. N. P a N- número de pasajes A- coeficiente que depende del microorganismo y su historia. Método NO CONTINUO. Variables que lo afectan: Presión, diseño de las válvulas y anillos de impacto, temperatura, etc. NO DEPENDE DE LA CONCENTRACIÓN. Hay sistemas que operan a presiones mayores a las 1000 bar lo que implica importantes aumentos de la TEMPERATURA (alrededor de 2.5 ºC cada 100 bar) que pueden afectar la estabilidad del producto.

24 Conclusiones La técnica más recomendada para alta escala son los homogeinizadores - Homogeinización: - suspensiones celulares 15-20% (peso seco) - concentración celular no afecta la eficiencia - es necesario refrigerar (4-5ºC) - Modelos más grandes 6,000 L/h (levaduras y bacterias) -Molinos de perlas pequeñas perlas de vidrio ( mm φ) - diferentes diseños de agitadores - concentración de células afecta la eficiencia concentración óptima 30-60% peso húmedo modelos mas grandes 2000 L/h -Ruptura química o enzimática limitado a baja escala (Lysozyme, Triton, otras)

25 Conclusión: Para cada sistema (proteína-microorganismo) hay que evaluar cuál es el método adecuado que permita liberar el mayor contenido del producto sin que se vea afectada su actividad.