Proteína C Proteína S. Proteína Ca. Acción fibrinolítica

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1 170 PRIMERA PARTE DISCUSIONES GENERALES Coagulación Trombina Proteína C Proteína S Proteína Ca Acción anticoagulante Inactiva los factores Va y VIIIa Trombomodulina Superficie de las células endoteliales Inactiva el inhibidor del tpa Acción fibrinolítica Aumenta la actividad del tpa Figura 6-9. Acciones que implican a la proteína C. tpa, Activador del plasminógeno tisular. Los números romanos se refieren a los factores de coagulación asociados con esos números, y una a asociada indica que el factor está activado. Plasma Trombo Plasminógeno Plasmina Antiplasminas tpa Plasminógeno Fibrina Plasmina Productos solubles Fibrinógeno Degradación Fibrinogenolisis Fibrinolisis Figura Acciones del activador del plasminógeno tisular (tpa) y la plasmina. plasmina inhibe la plasmina libre, pero la plasmina unida a fibrina se protege. La α 2 -macroglobulina inhibe la proteína Ca y puede inhibir en cierto modo la plasmina.también inhibe algunos factores de la coagulación activados. La fibrinolisis ocurre más fácilmente en los capilares que en la circulación sistémica. En los capilares existe una densidad mucho mayor de células endoteliales. Se estima que los capilares representan más del 90% de todo el área de superficie de las células endote-

2 CAPÍTULO 6 Evaluación de la Hemostasia: Alteraciones de la Coagulación y de las Plaquetas 171 liales corporales. Consecuentemente, la activación de la proteína C mediada por trombomodulina y la eliminación de la trombina son superiores en los capilares que en los grandes vasos.además, la liberación de tpa es superior en los capilares y puede haber menos cantidad de antiplasmina disponible para inhibir la fibrinolisis. La fibrinolisis rápida de los trombos en los grandes vasos puede salvar la vida pero la fibrinolisis puede ser importante para mantener la integridad de los vasos capilares. ANTICOAGULANTES La coagulación de la sangre de las muestras se evita empleando o bien quelantes de Ca 2+ (ácido etilendiaminotetracético [EDTA] y citrato) o heparina en los tubos de obtención. El EDTA es el anticoagulante de elección para el hemograma completo en la mayoría de especies.tras la mezcla con EDTA hay una dilución mínima de la muestra y los frotis que se preparan con este anticoagulante se tiñen de forma óptima con las tinciones hematológicas rutinarias. Desafortunadamente, la sangre de algunas aves y reptiles se hemoliza cuando se recolecta con EDTA. En estas especies, suele emplearse heparina como anticoagulante. El inconveniente de emplear heparina es que los leucocitos no se tiñen tan bien y que las plaquetas se agregan más que en la sangre conservada en EDTA. El citrato es el anticoagulante preferido para la toma de plasma para pruebas de coagulación y de plaquetas para pruebas de función plaquetar. Las muestras tomadas en solución de citrato se diluyen al 10%. Si se realizan recuentos de plaquetas, deben corregirse para esta dilución. El citrato es también el anticoagulante que se emplea típicamente en la recolección y almacenamiento de sangre para transfusiones. La unión de la heparina a la antitrombina III acelera mucho la inhibición de la trombina por parte de la antitrombina III, inhibiendo por ello la coagulación. Los factores de coagulación IXa y Xa y el complejo VII-TF también parecen inhibirse por el complejo antitrombina III heparina. La heparina se emplea como un anticoagulante para los hemogramas completos de especies en las que el EDTA provoca hemólisis. La heparina de litio se emplea como anticoagulante cuando el plasma (en vez del suero) se emplea para los paneles bioquímicos séricos. La heparina se añade frecuentemente a las soluciones de sales isotónicas para limpiar las vías intravenosas y puede inyectarse para inhibir la coagulación de la sangre in vivo. PRUEBAS DE CHEQUEO DE ALTERACIONES DE LA HEMOSTASIA No existe ninguna prueba única que evalúe todos los componentes de la hemostasia. Por ello, suelen realizarse varias pruebas de hemostasia para determinar la naturaleza de una alteración de la hemostasia.

3 172 PRIMERA PARTE DISCUSIONES GENERALES Recuento de plaquetas Los frotis teñidos deben examinarse cada vez que se realizan recuentos plaquetares para verificar que los recuentos bajos de plaquetas, determinados manualmente o mediante máquinas, son válidos. La presencia de agregados plaquetares puede resultar en recuentos erróneamente reducidos. Los factores empleados para estimar el número de plaquetas varían dependiendo del microscopio que se emplee, método de preparación del frotis de sangre, y el área del frotis examinada; sin embargo, la fórmula siguiente generalmente facilita un estimado plaquetar razonable. Plaquetas por microlitro = Número de plaquetas por campo de inmersión de 100X Las plaquetas de los gatos son más grandes que las de otros animales domésticos; consecuentemente, no es posible separarlas de forma precisa mediante contadores de impedancia (como el Coulter Counter S+4 y el Abbott Cell-Dyne 3500) de los eritrocitos por su tamaño. Los contadores celulares que cuentan las plaquetas empleando citometría de flujo láser (como el Bayer Advia 120) son capaces de contar las plaquetas del gato de forma más precisa en sangre completa. Desafortunadamente, los agregados plaquetares se forman con facilidad en la toma de sangre en el gato, como resultado, frecuentemente habrá recuentos plaquetares erróneamente reducidos. Puede que se disponga de anticoagulantes con inhibidores plaquetares añadidos, que reducirían la agregación plaquetar. Los recuentos de plaquetas en Galgos sanos y Cavalier King Charles Spaniels suelen ser menores que los que se registran en otras razas de perros. El límite inferior del intervalo de referencia para los recuentos plaquetares en los greyhounds sanos descrito es de cerca de /µl, cuando se determina con contadores automáticos de impedancia. Manualmente se medirían recuentos algo superiores. El límite inferior del intervalo de referencia del recuento plaquetar en el Cavalier King Charles Spaniel es difícil de determinar con certeza, porque existe una elevada incidencia de una trombocitopenia hereditaria asintomática con macroplaquetas en esta raza. El límite inferior del intervalo de referencia se cree que es de unas /µl. los recuentos de plaquetas determinados con contadores de impedancia son erróneamente bajos en los Cavalier King Charles Spaniels con macroplaquetas, porque estos contadores no pueden diferenciar las plaquetas grandes de los eritrocitos pequeños. Volumen plaquetar medio El volumen plaquetar medio (MPV) es el volumen medio de una plaqueta registrado en fentolitros. Los contadores celulares de impedancia pueden determinar de forma precisa el MPV en sangre completa de perros y caballos, pero no en la de gatos. Los contadores

4 CAPÍTULO 6 Evaluación de la Hemostasia: Alteraciones de la Coagulación y de las Plaquetas 173 celulares que cuentan y determinan el tamaño de las plaquetas mediante citometría de flujo láser pueden medir de forma precisa el MPV en sangre completa de gatos, pero los agregados plaquetares se forman con facilidad en la toma de muestra de sangre en gatos, resultando en valores de MPV erróneamente elevados. Antes de que se consideren válidos el recuento plaquetar y el MPV de una muestra de sangre, se emplean contadores celulares para determinar si la distribución del tamaño de las plaquetas se aproxima al histograma que normalmente se espera de ellas. Si el histograma tiene una forma anormal o hay un número insuficiente de plaquetas para una construcción apropiada del histograma (recuentos plaquetares muy bajos), los valores no se van a registrar. Consecuentemente, los recuentos de plaquetas en sangre completa y los valores de MPV no pueden determinarse en todas las muestras. Desafortunadamente, los valores de MPV no se registran en animales con trombocitopenia, en los que podrían facilitar una información útil. En los rangos normales de recuentos plaquetares y MPV, existe una correlación inversa entre el recuento plaquetar y el MPV en algunas especies. Los resultados de los estudios sobre los efectos de los anticoagulantes y condiciones de almacenamiento sobre el MPV no son conclusivos. Los valores de MPV pueden ser ligeramente superiores cuando la sangre se almacena en EDTA en vez de citrato como anticoagulante, y los aumentos del MPV pueden ser más probables cuando la sangre se almacena a 5ºC, respecto a la temperatura ambiente. Un valor elevado de MPV sugiere que existe una potenciación de la trombopoyesis, pero el MPV puede también estar elevado en animales con alteraciones mielodisplásicas. Los Cavalier King Charles Spaniels tienen una trombocitopenia hereditaria que puede tener valores elevados de MPV por la ocurrencia de una población de macroplaquetas. Un valor normal de MPV no descarta una potenciación de la trombopoyesis. La presencia de pequeñas agregaciones de plaquetas en las muestras de sangre puede resultar en un valor de MPV erróneamente elevado. Una reducción del MPV (presencia de microtrombocitos) se ha asociado con la trombocitopenia inmunomediada en perros y humanos como resultado de la fragmentación de plaquetas. Los MPVs se han descrito ligeramente superiores en gatos con hipertiroidismo y ligeramente menores en perros con hipotiroidismo, respecto animales eutiroideos. Los perros con deficiencia de fosfofructoquinasa en los eritrocitos y el músculo esquelético tienen valores ligeramente elevados de MPV con recuentos plaquetares normales. Tiempo de sangría El tiempo de sangría es una prueba simple pero ruda de la hemostasia. Se encuentra prolongado en animales con alteraciones plaquetares. Como el tiempo de sangría se espera que esté prolongado en animales con recuentos plaquetares bajos, esta prueba no facilita información adicional acerca de animales que se sabe que tienen una trombocitopenia severa. El tiempo de sangría de la mucosa bucal se determina para evaluar la función pla-

5 174 PRIMERA PARTE DISCUSIONES GENERALES quetar en animales con recuentos de plaquetas normales o casi normales.tras la penetración de la mucosa oral con una lanceta, la zona debe sangrar libremente. Si no se interviene, el sangrado generalmente se detiene en menos de 4 minutos en perros sanos y 3 minutos en gatos sanos. Los tiempos de sangría determinados por el corte de una uña (tiempo se sangría de cutícula) en perros y gatos anestesiados no sólo evalúan la función plaquetar sino que también pueden detectar defectos severos de la coagulación porque la lesión de los vasos provocada por esta técnica es más sustancial que la producida en la prueba de la mucosa oral. El tiempo de sangría de cutícula es difícil de estandarizar y carece de repetibilidad. Tiempo de coagulación activado El tiempo de coagulación activado (ACT) evalúa las vías de la coagulación intrínseca y común (Figura 6-11). Debe realizarse muy cerca del animal que se está evaluando. El ACT requiere un tubo de recolección especial que contiene arenas silíceas (Producto Nº ; Becton, Dickinson and Company) y un método para mantener los tubos de recolección a 37ºC. la sangre se recoge en tubos precalentados y se mantiene a 37ºC hasta que coagula. El ACT suele ser menos de 200 segundos en caballos, menos de 165 segundos en gatos y menos de 125 segundos en perros. Tiempo de tromboplastina parcial activado La prueba del tiempo de tromboplastina parcial activado (APTT) también se emplea para evaluar las vías intrínseca y común. El APTT se mide en plasma obtenido de sangre recogida con citrato sódico al 3.2% cono anticoagulante, en una mezcla 9:1. Las muestras deben mantenerse refrigeradas y las pruebas realizarse a los 30 minutos de la toma de la muestra. Debe medirse un APTT de animales control sanos en el mismo momento. El APTT probablemente estará prolongado si el tiempo del paciente es un 30% o más superior al tiempo del control. El intervalo de referencia dependerá del método empleado. El APTT puede prolongarse de forma errónea si el cociente entre el plasma y el anticoagulante es inapropiadamente bajo, como ocurre si se recoge una cantidad insuficiente de sangre en un tubo de vacío que contiene una solución pre-medida de citrato o si existe eritrocitosis (p. ej. deshidratación severa). Tiempo de protrombina El tiempo de protrombina (PT) se emplea para evaluar las vías extrínseca y común (ver Figura 6-11).También requiere plasma obtenido con sangre anticoagulada con citrato. Las muestras deben mantenerse en refrigeración y realizarse la prueba en los 30 minutos posteriores a la recolección. Debe medirse el PT de un animal control sano en el mismo momento.

6 CAPÍTULO 6 Evaluación de la Hemostasia: Alteraciones de la Coagulación y de las Plaquetas 175 Vía intrínseca Vía extrínseca ACT APTT HMWL-PK XII HMWK-XI IX APLT + Ca++ VIII:C VII Factor tisular Ca++ PT Vía común X V APLT + Ca++ Protrombina Fibrinógeno XIII TCT Fibrina Figura Partes de la cascada de la coagulación evaluadas empleando el tiempo de coagulación activada (ACT), el tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT), tiempo de protrombina (PT) y tiempo de coagulación de la trombina (TCT). HMWK, kininógeno de elevado peso molecular; PK, prekalikreína; Ca ++, iones de calcio; APLT, plaquetas activadas; VIII:C, componente coagulante del complejo del factor VIII. El PT estará probablemente prolongado si el tiempo del paciente es un 30% o más superior al tiempo del control. El intervalo de referencia va a depender del método empleado. Tiempo de coagulación de la trombina El tiempo de coagulación de la trombina (TCT) es un indicador de alteraciones cuantitativas y cualitativas del fibrinógeno. Se emplea plasma citrado para el TCT. Las muestras deben mantenerse en refrigeración y realizarse las pruebas en los 30 minutos posteriores a la recolección de la muestra. Debe medirse al mismo tiempo un TCT de un animal control sano para compararlo con el del paciente. El intervalo de referencia va a depender del método empleado. Fibrinógeno La prueba de precipitación por calor es una prueba práctica para estimar los valores de fibrinógeno, pero no es lo bastante sensible para diferenciar los valores normales bajos de los valores bajos cuando las determinaciones se realizan por sustracción del valor de proteínas totales medido con un refractómetro. Pueden obtenerse valores más precisos median-

7 176 PRIMERA PARTE DISCUSIONES GENERALES te micrometría ocular, pero se requiere algo más de tiempo y un microscopio con un micrómetro ocular calibrado. El fibrinógeno se mide de forma más precisa empleando una prueba basada en la coagulación. Productos de degradación de la fibrina La prueba de los productos de degradación de la fibrina (FDP) facilita evidencias de fibrinolisis in vivo. Los PDFs producidos por fibrinolisis tienen propiedades antihemostáticas que promueven hemorragias, que pueden aparecer como secuela de una coagulación intravascular diseminada (CID). Los equipos basados en anticuerpos para la medición de PDFs en plasma y suero humanos están disponibles a nivel comercial.afortunadamente, varias pruebas tienen la suficiente reactividad cruzada para poder emplearlas en animales domésticos, pero los resultados de la prueba pueden variar dependiendo del equipo empleado. Los resultados positivos a las pruebas de PDFs en animales aparecen con fibrinolisis (iniciada por un CID) y animales con fibrinogenolisis (p. ej. envenenamiento por serpiente de cascabel con espalda de diamante del este). Inexplicablemente, algunos perros con intoxicación por rodenticidas se ha descrito que tienen resultados positivos a las pruebas de PDFs cuando se realiza una prueba en suero. Estos resultados deben confirmarse empleando pruebas de PDFs en plasma. Se han descrito valores ligeramente incrementados de FDP asociados con ejercicio, ansiedad y estrés en humanos. Los resultados falsos positivos pueden estar provocados por una recolección y manejo inapropiados de las muestras. Cuando la plasmina rompe la fibrina soluble (o el fibrinógeno), se producen PDFs en fragmentos X,Y, D y E. cuando la plasmina rompe la fibrina de uniones cruzadas, se producen productos de degradación distintos. Los D-dímeros son los productos más pequeños de rotura producidos por la acción de la plasmina sobre la fibrina de uniones cruzadas. Las pruebas de D-dímeros utilizan anticuerpos monoclonales frente un epítopo de D-dímeros humanos. Una prueba positiva de D-dímeros indica la presencia de fibrinolisis. Las pruebas tradicionales de PDFs no pueden distinguir entre la fibrinolisis y la fibrinogenolisis. Son necesarios más estudios, pero los hallazgos iniciales sugieren que los resultados de la prueba de D-dímeros y otros PDFs son similares en animales. PRUEBAS ESPECÍFICAS PARA ALTERACIONES DE LA HEMOSTASIA Factor de von Willebrand (antígeno relacionado con el factor VIII) El vwf es una glucoproteína que está compuesta de multímeros de varios pesos moleculares. Este factor es necesario para una adhesión plaquetar correcta; consecuentemente,se determina cuando se sospecha de un defecto en la función plaquetar. La deficiencia hereditaria de vwf (enfermedad de von Willebrand) es especialmente común en ciertas razas

8 CAPÍTULO 6 Evaluación de la Hemostasia: Alteraciones de la Coagulación y de las Plaquetas 177 de perros (hasta un 70% de los Doberman pinschers). Consecuentemente, este factor puede medirse antes de la cirugía o de reproducir perros de razas en las que la enfermedad es prevalente. Algunos investigadores han indicado que el hipotiroidismo puede resultar en una reducción de las concentraciones de vwf en el plasma en perros, pero otros investigadores han sido incapaces de confirmar esta relación. El vwf puede aumentar en el plasma como una proteína de fase aguda en la inflamación. Se han descrito concentraciones incrementadas en perros con enfermedades hepáticas, en el parto, en endotoxemia y tras la infusión de epinefrina. La interleucina (IL)-11 promueve la síntesis de vwf en los perros. En contraste, el tratamiento con desmopresina (1-deamino-8-D-arginina vasopresina) incrementa transitoriamente la concentración de vwf en el plasma por estimular la liberación del vwf almacenado en los cuerpos Weibel-Palade endoteliales. La concentración de vwf en el plasma suele cuantificarse empleando una prueba de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA). Existe una variación temporal sustancial en perros individuales, haciendo que la identificación de los animales portadores resulte difícil. Consecuentemente, pueden ser necesarias varias pruebas para obtener un estimado fiable de las concentraciones de vwf. Son necesarios multímeros de elevado peso molecular del vwf para una adhesión plaquetar normal. La distribución multimérica del vwf se determina por inmunoelectroforesis de proteínas. Antitrombina III La antitrombina III plasmática puede medirse mediante pruebas de cromógenos. Puede encontrarse reducida en estados de hipercoagulabilidad (p. ej. cólico equino), CID, nefropatías con pérdida de proteínas, enteropatías con pérdida de proteínas y sepsis. La antitrombina III se encuentra elevada en gatos con varias enfermedades, sugiriendo que se comporta como una proteína de fase aguda en esta especie. PIVKA (Proteínas Inducidas por la Ausencia o Antagonismo de la Vitamina K) La prueba de PIVKA (Thrombotest; Accurate Chemical and Scientific Corp,Westbury, NY) es una prueba de coagulación simple que se desarrolló para monitorizar a los humanos tratados con warfarina. Es esencialmente una prueba de PT modificada de emplea una tromboplastina tisular particular y plasma diluido para resultar en tiempos de coagulación más largos que la prueba de PT estándar. La prueba de PIVKA no es específica para la deficiencia de vitamina K. puede encontrarse prolongada en varios defectos de las vías extrínseca y común. La prueba de PIVKA no ofrece ninguna ventaja sobre el PT en el diagnóstico de intoxicaciones por rodenticidas, porque el PT se encuentra consistentemente prolongado de forma marcada en estas alteraciones. Sin embargo, la prueba PIVKA podría resultar útil en la identificación de alteraciones sutiles de la coagulación de las vías extrínseca o común, porque las pruebas de PT diseñadas para humanos pueden carecer de sensibilidad para la detección de coagulopatías en ciertas especies animales.

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