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1 Documento de Aplicación CULTIVOS CELULARES

2 Índice de materias: CULTIVOS CELULARES Introducción a los cultivos celulares. Conceptos actuales de cultivo celular. Tipos de cultivos de tejidos. Biología de la célula en cultivo. El medio de cultivo. El sustrato de cultivo. La fase gaseosa. Oxígeno. Dióxido de carbono. Propiedades físicas. ph y capacidad tamponadora. Osmolaridad Temperatura Viscosidad Tensión superficial Condiciones fisiológicas. Las contaminaciones. Contaminación bacteriana y por levaduras. Contaminación por micoplasmas. Contaminación por virus. Técnicas de contaje celular. Métodos de disgregación celular. Mecánicos. Químicos. Enzimáticos. El laboratorio de cultivo celular. Cabinas de flujo laminar. Incubadores. Incubador de CO 2. Incubadores tipo "roller". Instrumentos ópticos de observación: microscopio de contraste de fases invertido. Congeladores e instalación de criogenia (depósito de N 2 líquido). Equipo de esterilización. Equipo de filtración. Autoclave. Mechero Bunsen Otros instrumentos. Centrífugas. Contador electrónico de células ("cell counter"). Equipo de purificación de agua. Pipeteadores. Productos Documento de Aplicación Page 2 of 31

3 Introducción a los cultivos celulares. Introducción histórica El cultivo de tejidos se desarrolló a partir de los últimos años del siglo XIX como una continuación de las técnicas de la embriología. Wilhem Roux mantuvo en el año 1885 células de embrión de pollo en solución salina durante unos días. El zoólogo americano R.G. Harrison es considerado el iniciador de los cultivos de tejidos animales, en Harrison fue el primer autor que empleó técnicas in vitro para el estudio de fenómenos in vivo, realizando cultivos de médula espinal embrionaria de anfibios. Pudo observar el crecimiento de los axones de los neuroblastos, y estableció que el axón se formaba por expansión a partir del cuerpo neuronal y no por fusión de una cadena de células. El cultivo se realizaba en una gota de linfa del anfibio que colgaba de un cubreobjetos sobre una cámara sellada. La primera limitación para el establecimiento de cultivos era lograr un medio nutritivo adecuado. Burrows (1910) empleó plasma de pollo para nutrir los explantes de tejidos embrionarios de pollo. Este medio se reveló mucho mejor que los anteriormente probados, lo que le permitió observar el crecimiento del tejido nervioso, corazón y piel. Burrows y Carrel realizaron los primeros intentos de establecer cultivos de células de mamífero, y consiguieron mantener explantes obtenidos a partir de perros, gatos y conejos de indias, así como en el crecimiento de tumores sólidos. Demostraron que la vida del cultivo se puede prolongar mediante subcultivo. Los medios empleados fueron plasma suplementado con extractos de embrión. Roux y Jones (1916) emplearon por vez primera extractos enriquecidos en tripsina para disociar las células de embriones de pollo, estableciendo el primer cultivo celular. Uno de los mayores problemas que describen para el establecimiento de los cultivos celulares es la aparición de múltiples contaminaciones, por lo que desarrollaron numerosos métodos de manipulación en condiciones de asepsia que aún hoy día se utilizan. En 1913 Carrel demostró la posibilidad de mantener en cultivo células extraídas de un animal, embrión de pollo, durante un periodo de tiempo superior al de la vida de éste. Mantuvo en cultivo células de pollo durante 34 años (Sharp, 1977). Gran parte del éxito en el mantenimiento de los cultivos se debió al desarrollo del denominado frasco de Carrel. Entre los años 1920 y 1940 se desarrollaron diferentes estrategias de obtención de cultivos y de mantenimiento de las condiciones estériles, pero sin grandes avances. A partir de los años 40, con el aislamiento de los primeros antibióticos, se desarrollaron numerosas aplicaciones de entre las que podemos destacar : 1948 Earle y col. (Sanford, Earle y Likely, 1948) aislaron células de la línea celular L y mostraron que eran capaces de formar clones en el cultivo de tejidos. Demostraron que para que una célula llegue a dividirse necesita ser alimentada con los nutrientes correctos Gry y col. (Grey, Coffman y Kubicek, 1952) establecen la primera línea celular continua, las actualmente bien conocidas células HeLa. El medio empleado era extremadamente complejo y poco definido: plasma de pollo, extracto de embrión bovino y suero de cordón umbilical humano Rita Levi-montalcini y col. establecen que el factor de crecimiento nervioso estimula el crecimiento de los axones en tejidos en cultivo (Levi-Montalcini y Calissano, 1979). Este trabajo supuso el Premio Nóbel para Levi-Montalcini en Eagle (Eagle, 1955) realiza la primera investigación sistemática de los requerimientos nutritivos de las células en cultivo. Describe que las necesidades del cultivo de soluciones corporales complejas (sueros,... ) pueden ser satisfechas por tan poco como el 1% de suero de caballo dializado en un medio definido de pequeñas moléculas (aminoácidos, azúcares,...) 1961 Hayflick y Moorhead usaron por primera vez antibióticos para prevenir la contaminación de los cultivos de fibroblastos. Pudieron mantener estos cultivos durante unos 12 pases, pero no consiguieron establecer líneas estables Ham introduce el primer medio definido libre de suero capaz de mantener algunas células de mamífero en cultivo indefinidamente (Ham, 1965) Augusti-Tocco y Sato establecen la primera línea celular estable de neuroblastoma aislando clones que establecían procesos nerviosos y que eran eléctricamente excitables (Augusti-Tocco y Sato, 1969). Se empiezan a establecer las primeras líneas celulares diferenciadas Albert Claude, George Palade y Christian de Duve recibían el Premio Nobel de Medicina por haber hecho posible la mirada cercana a ese mundo en miniatura que es la célula con sus estructuras subcelulares y organelos con las primeras fotos de una célula intacta obtenidas mediante un microscopio electrónico Kohler y Milstein establecen la primera línea celular hibrida productora de anticuerpos monoclonales (Koehler y Milstein, 1975). El establecimiento de la tecnología de obtención de anticuerpos monoclonales les valió el Premio Nóbel Sato y col. publicaron sus trabajos en los que demuestran que las diferentes líneas celulares requieren mezclas distintas de hormonas y factores de crecimiento para crecer en medios libres de suero. (Sato y col., 1982). Documento de Aplicación Page 3 of 31

4 Desde que Cultek se inició como empresa en 1976, los cultivos celulares han conocido una revolución tecnológica que pasa por la incorporación de las técnicas de ingenieria genética, el desarrollo de reactores para cultivos masivos, producción de vacunas virales, el cultivo en microcarriers, el desarrollo de nuevas superficies de cultivo en monocapa de alta adherencia, sustitutos de suero, robotización de las manipulaciones de cultivo, etc. En la actualidad, entre las areas de aplicación en las que el cultivo celular in vitro es una herramienta basica cabe destacar: - El Cancer que se puede considerar como una enfermedad del ciclo celular. Los defectos en el control del ciclo pueden conducir a una proliferación celular anormal o a alteraciones cromosómicas como las que se observan en las células cancerosas. Se están estudiando las relaciones entre la regulación del ciclo celular y el cáncer, así como el papel específico de dos tipos de genes, los oncogenes y los genes supresores de tumores, presentes en las células normales, y cuyas alteraciones pueden conducir precisamente a la aparición del cáncer. - La reproducción y diferenciación celular. Sus aplicaciones se refieren, de una parte, a la llamada reproducción asistida y al controvertido tema de la clonación y, de otra, a la Medicina Regenerativa en la que, a partir de celulas madre o troncales, se forman o reconstruyen tejidos que sustituyen a otros dañados por diversos procesos patológicos. - La medicina regenerativa, que pretende conseguir la regeneración, total o parcial, de los tejidos que han perdido masa celular, utilizando técnicas de trasplante celular para implantar células troncales o células madre. Conceptos actuales de cultivo celular. Actualmente se entiende por cultivo celular al conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de las células 'in vitro', manteniendo al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas. Dependiendo del grado de preservación de la estructura del tejido o del órgano de origen y de su duración hablaremos de diferentes tipos de cultivos: de órganos, explantes, primarios o secundarios,... Los estudios que emplean cultivos celulares abarcan gran número de disciplinas y aproximaciones al estudio del fenómeno celular. Actividad intracelular. Mecanismos implicados en los diferentes procesos intracelulares, como por ej. transcripción de DNA, síntesis de proteínas, metabolismo energético... Flujo intracelular. Movimientos intracelulares de sustancias y señales asociadas a los diferentes procesos fisiológicos, como por ej. ensamblaje y desensamblaje de los diferentes componentes intracelulares, movimientos del RNA: núcleo-citoplasma, movimiento de proteínas,... Ecología celular. Estudio de las condiciones ambientales responsables del mantenimiento de la funcionalidad celular, de su diferenciación..., como por ej. estudio de las necesidades nutricionales, infecciones, estudio de la transformación celular (inducidas por virus o agentes químicos), cinética de la población celular,... Interacciones celulares. Procesos de inducción embrionaria, cooperación metabólica, inhibición por contacto o por adhesión, interacciones célula-célula. Como ejemplo de áreas de investigación fuertemente dependientes de las técnicas de cultivo celular son: Virología: establecimiento de condiciones de cultivo de virus animales y de plantas, producción de vacunas antivirales,... Investigación del Cáncer Inmunología. Gracias especialmente a la introducción de las técnicas de fusión celular en la producción de anticuerpos monoclonales, así como en el análisis de la genética de la célula somática. Ingeniería de proteínas. Por la producción de proteínas en líneas celulares: interferón, insulina, hormona de crecimiento,... Documento de Aplicación Page 4 of 31

5 Estudios de interacción y señalización celular, en la diferenciación y en el desarrollo. Comprende el estudio de los receptores y de las vías de translocación de la señal. Aplicaciones diagnósticas. Por ejemplo en medicina y farmacología destacan el análisis cromosómico de células crecidas a partir de muestras de amniocentesis, detección de infecciones virales, ensayos de toxicidad,... Aplicaciones médicas: mantenimiento y producción de tejidos para transplante. Aplicaciones industriales y agronómicas: producción por reproducción "in vitro" de clones de plantas de interés comercial,... Los cultivos celulares tienen una serie de ventajas innegables, pero al mismo tiempo tienen unas desventajas que hay que tener en consideración. Como ventajas podemos citar: Permiten un control preciso y fino del medio ambiente. En un cultivo se pueden controlar todos los factores del medio: físicoquímicos (ph, temperatura, presión osmótica, niveles de O2, CO2, tensión superficial...), y fisiológicos (hormonas, factores de crecimiento, densidad celular,...). Esto es cierto completamente sólo para algunas líneas celulares para las que se han definido los denominados medios definidos. Un medio definido es aquel en el que se conocen todos y cada uno de los componentes que lo forman, y la concentración exacta en que se encuentran. Establecer un medio definido supone conocer con precisión las necesidades nutritivas de las células en cuestión. Sin embargo en muchas líneas no se han llegado a establecer medios definidos. En estos casos se trata de medios que se suplementan con soluciones complejas (suero, extractos de embrión, etc...) en los que se encuentran factores hormonales y nutritivos imprescindibles para el mantenimiento del cultivo pero cuya naturaleza se desconoce. Estas soluciones complejas están sujetas a variación de lote a lote. Caracterización y homogeneidad de la muestra. Las células en cultivo de una línea celular (cultivo primario propagado), o de una línea continua son homogéneas, con morfología y composición uniformes. Se pueden obtener con facilidad un número elevado de réplicas idénticas, con lo que se supera el grave problema de heterogeneidad de las muestras inherente asociado al uso de animales de experimentación. Economía. Suponen una economía en el uso de reactivos o drogas a estudiar pues al realizarse en volúmenes reducidos, y con un acceso directo de las células a la droga las concentraciones requeridas son mucho más bajas que en animal completo. Es diferente el coste de investigación de un nuevo fármaco para la empresa farmacéutica que está desarrollando moléculas si ha de sintetizar de cada una de las que ha de probar en cantidades del orden del gramo (para el estudio en animales) a que baste con pocos miligramos. Motivaciones éticas. La investigación biomédica supone el sacrificio cada año de muchos miles de animales de experimentación. El cultivo celular no puede reemplazar siempre al ensayo 'in vivo' pero es una alternativa válida en muchas situaciones. Incluso un cultivo celular primario permite realizar experimentos que suponen el sacrificio de uno o pocos animales, pero con ellos se pueden ensayar un número de condiciones experimentales que pueden suponer si el estudio se hace con animales de experimentación el sacrificio de decenas o cientos. En cuanto a las desventajas del cultivo celular: Técnica sensible. El crecimiento de las células animales es mucho más lento que el de los contaminantes más habituales (hongos, levaduras, bacterias, micoplasmas,...) y además dado que proceden de organismos pluricelulares son incapaces de crecer en ausencia de una compleja mezcla de nutrientes que simula el plasma o el fluido intersticial. Esto supone la necesidad de mantener las condiciones de asepsia en todo momento, lo cual es limitante a nivel tanto del instrumental requerido como del personal cualificado para su manipulación. Cantidad y costo. El costo de producción de 1 gr de tejido en cultivo es más de 10 veces superior al obtenido en el animal. Asimismo existe una limitación de producción, que es del orden de 10 gr de células en un laboratorio normal, y que para ser superior a 100 gr requiere instalaciones de tipo industrial. Inestabilidad. Muchas de las líneas celulares continuas son inestables, como consecuencia de la dotación cromosómica aneuploide. La población celular puede variar su composición si alguna de las subpoblaciones celulares es capaz de crecer con una tasa ligeramente superior, es decir podemos encontrar diferencias significativas en la línea celular de una generación a la siguiente. La única manera de evitarlo es emplear líneas estables que se resiembran a partir de un stock congelado cada determinado tiempo, o después de un determinado número de generaciones. Validez del modelo in vitro. Cuando nos referimos a un cultivo celular nos estamos refiriendo exactamente a un disgregado celular de un tejido de origen y que se diferencia de éste en que: se ha perdido la organización espacial tridimensional propia del tejido. se han perdido las interacciones heterotípicas, entre los distintos tipos celulares, y entre las células y la matriz extracelular. Es de destacar que los avances más excitantes en la función celular proceden del reconocimiento de la importancia de las interacciones específicas de las células con otras células o con el sustrato. carece de los componentes sistémicos de regulación, implicados en la regulación de la homeostasis 'in vivo', especialmente los sistemas nervioso y endocrino. Cuando se establece el cultivo, las células se desdiferencian, y entre otras cosas se hacen móviles e inician su proliferación. Esta desdiferenciación puede, en algunos casos ser revertida por procedimientos de diferenciación inducida por hormonas, confluencia, inductores químicos (ésteres de forbol,...) pero no está claro si el estado rediferenciado es equivalente al estado de diferenciación 'in vivo'. Documento de Aplicación Page 5 of 31

6 Por todo lo anterior hemos de ser precavidos en cuanto a la validez de los resultados obtenidos in vitro respecto a lo que pueda observarse in vivo. Sin embargo actualmente se están realizando gran cantidad de estudios de validación de modelos in vitro dentro del desarrollo de los métodos alternativos a la experimentación animal, por ejemplo por ECVAM (European Center for Validation of Alternative Methods), ALTWEB (Colección de recursos para el desarrollo de métodos alternativos a la experimentación animal en web de la Universidad John Hopkins, USA), Invittox (Colección de protocolos in vitro ), Invitroderm (Alternativas a los ensayos de irritación dérmica en animales), etc. Tipos de cultivos de tejidos. Se podría hablar de tres tipos de cultivos: Cultivo de órganos. Implica que la arquitectura característica del tejido in vivo se mantiene al menos en parte. Para ello el órgano se mantiene en un medio del que obtiene los nutrientes y al que puede liberar los desechos y en el que mantiene su estructura tridimensional, en general esférica. Este tipo de cultivo permite mantener los tipos celulares diferenciados y es por ello una buena réplica del tejido de origen, pero por el contrario no permite su propagación pues el crecimiento, de producirse, se limita a la periferia y es debido fundamentalmente a los tipos celulares embrionarios. La imposibilidad de propagar obliga a partir en cada nuevo experimento de nuevo material animal lo que conlleva una elevada heterogeneidad. Explantes primarios. Fragmentos de tejidos o de órganos que se adhieren a una superficie y en la que proliferan las células de la periferia del explante. Cultivo celular. Supone una disgregación celular ya sea por medios enzimáticos o mecánicos. La suspensión celular se puede cultivar como una monocapa adherente o en suspensión en el medio de cultivo. Este tipo de cultivo permite su propagación, aumentando notablemente la masa celular del cultivo a lo largo de las generaciones. Como característica negativa se pierde la heterogeneidad celular de partida, la población se hace uniforme y homogénea al predominar en el cultivo aquellos tipos celulares que tienen superior tasa de crecimiento. En la actualidad los cultivos celulares son los más empleados fundamentalmente por la posibilidad de propagación, así como por las ventajas en la cuantificación, caracterización y repetitibilidad de las muestras. A fin de compensar la ausencia de interacciones heterotípicas se realizan desde hace unos años cultivos mixtos con importantes éxitos. Biología de la célula en cultivo. En el proceso de establecimiento de un cultivo celular se seleccionan las células que crecerán según numerosos criterios. Así solo formarán el cultivo aquellas células que sean por una parte capaces de superar el proceso de disgregación, y por otra capaces de adherirse al sustrato y proliferar en forma de monocapa o en suspensión. El crecimiento en monocapa significa que las células se adherirán al sustrato y en esa forma inician la proliferación. Muchas líneas celulares son anclaje dependientes, es decir no inician la proliferación hasta que se han adherido al sustrato. Este es el modo normal de proliferación de la mayor parte de las células, con excepción de las células hematopoyéticas maduras. El crecimiento en suspensión es propio de aquellas células capaces de proliferar sin necesidad de adherirse al sustrato, independientes de anclaje, y es propio de las células hematopoyéticas, algunas líneas celulares transformadas y de células procedentes de tumores. Es de destacar que en todo tejido existe una fracción o tipo celular que es capaz de crecer en suspensión. A pesar de que su origen no está claro se cree que se trata de células cepa ("stem cells") indiferenciadas. Documento de Aplicación Page 6 of 31

7 Cuando se mantiene el cultivo se establece una nueva selección: aumentan en número aquellas células que tienen una mayor tasa de crecimiento. En el momento en que se alcanza la confluencia las células, en general, detienen su crecimiento, aunque pueden existir tipos celulares, neoplásicos, que sigan duplicándose y que desplacen a los otros del cultivo. Así pues se ha de entender el cultivo como un ente dinámico en el que las proporciones relativas de los diferentes elementos que lo forman varían en el tiempo en función de la presión selectiva a la que estén sometidos. Una vez se alcanza la confluencia en el cultivo es cuando muchas líneas celulares expresan sus aspectos más característicos. Es en este estado cuando el parecido morfológico y fisiológico es mayor al modelo celular de origen. Es también el momento en el que se detiene el crecimiento y se hace necesario dividir, replaquear o propagar las células. Es una observación generalizada que después del tercer replaqueo el cultivo se estabiliza y homogeneiza: el tipo celular de mayor tasa de crecimiento ha ocupado completamente el cultivo desplazando a los otros tipos celulares. En general, si no se establecen condiciones selectivas las células del tejido conjuntivo, especialmente fibroblastos, serán las seleccionadas finalmente. Para evitar que las células más especializadas del cultivo se vean desplazadas de éste por los fibroblastos y otras células de rápido crecimiento se han establecido protocolos detallados de medios selectivos. Evolución de una línea celular hipotética. Comportamiento a lo largo de las semanas. En el momento en que las células comienzan a dividirse en la placa su número se incrementa, hasta ocupar todo el espacio. En ese momento es necesario tomar algunas y resembrar en una nueva placa. En el caso de células en cultivo primario el factor de dilución de un pase al siguiente suele ser de 1/2 a 1/5 pero no superior. En el caso de líneas celulares establecidas la dilución puede ser tan elevada como 1/100 o 1/1000, siendo la habitual 1/10. El caso más extremo serían los procesos de clonaje en los que se siembran en pocillos (multiwell de 96 pocillos) 1 única célula. El crecimiento de las células en cultivo primario prosigue a lo largo de una serie de generaciones o pases característicos de cada tipo celular y condiciones de cultivo. Así los hepatocitos de adultos no se establecen más que como cultivo primario mientras que las células endoteliales de cordón umbilical humano (HUVEC) permanecen en cultivo de 3 a 9 pases, y los fibroblastos dérmicos humanos pueden superar los 20 pases. Sin embargo al final todas ellas entran en una fase de senescencia, con acumulación de numerosas anormalidades, perdida de funciones especializadas, etc... que conducen a la muerte del cultivo. Sólo ocasionalmente un cultivo primario se mantiene durante más generaciones de las esperadas. Es debido a la aparición en el cultivo de células inmortales. Estas células forman líneas estables o cultivos celulares permanentes. La razón de la inmortalización de estas células es en la mayor parte de los casos desconocida pero se incrementa la frecuencia de inmortalización mediante infecciones virales, tratamientos con mutágenos, etc... por lo que deben estar relacionadas con la pérdida, espontánea o inducida por el tratamiento, de las vías de control celular. Se hipotetiza que la capacidad de un cultivo celular primario para establecerse como línea estable está relacionado directamente con su variabilidad genética. Así líneas celulares que nunca se establecen como estables se mantienen euploides como es el caso de fibroblastos humanos (Hayflick y Moorhead, 1961), fibroblastos de pollo (Hay y Strehler, 1967), y la glia humana (Pontén y Westermarck, 1980) mientras que otras líneas frecuentemente se convierten en aneuploides y se transforman en líneas celulares continuas con mayor frecuencia, como es el caso de las células epidérmicas (Green y col., 1979; Thomas J., 1979). Comparación del número de cromosomas por célula en una línea primaria glial y una línea estable de melanoma. Documento de Aplicación Page 7 of 31

8 Existen diferencias muy importantes entre una línea celular continua y una línea primaria o un cultivo primario. En la tabla siguiente se recogen las propiedades diferenciales de las líneas finitas y continuas. Finita Continua Ploidía Diploide / Euploide Heteroploide / Aneuploide Transformación Normal Transformada Tumorogenicidad No-tumorogénica Tumorogénica Dependencia de anclaje Si No Inhibición por contacto Si No Limitación de crecimiento por densidad Si No Mantenimiento Cíclico Posible mantenerlas quiescentes Requerimientos de suero Elevados Bajos Eficiencia de clonaje Baja Elevada Marcadores Pueden expresar marcadores específicos Cromosomales, enzimáticos... se pierden Funciones especializadas Se mantienen Se suelen perder Tasa de crecimiento Rendimiento en cultivo Baja (24 a 96 h tiempo de replicación) Bajo (<10 6 células/ml; <10 5 células/cm 2 ) Rápida (12 a 24 h) Alto (>10 6 células/ml; >10 5 células/cm 2 ) Algunas definiciones que son importantes son: Cultivo primario. Cultivo establecido a partir de un tejido u órgano. Las células mantienen la viabilidad un periodo de tiempo limitado y no se reproducen en cultivo. En general en cultivo presentan una reducción en el número total de células vivas a lo largo del tiempo. Ejemplos: hepatocitos obtenidos de hígado adulto, neuronas, etc... Línea primaria. Cultivo establecido a partir de un tejido u órgano que se mantiene un periodo de tiempo limitado pero con reproducción de las células en el cultivo. Ejemplos: fibroblastos dérmicos, queratinocitos, células endoteliales de aorta bovina (BAEC), células endoteliales de cordón umbilical (HUVEC), etc... Línea celular continua. Cultivo que se establece a partir de un tejido u órgano, en muchos casos de un tumor, y que se mantiene en cultivo un tiempo ilimitado. Se trata de células inmortales. Documento de Aplicación Page 8 of 31

9 El cultivo de las células no presenta las mismas dificultades independientemente del tipo de célula de que se trate. Hay grandes diferencias que se relacionan fundamentalmente con el grado de diferenciación del tipo celular. Así pues en general se puede establecer como norma que una línea celular será tanto más fácil de establecer o cultivar cuanto más indiferenciada sea, con las excepciones de las líneas tumorales de células diferenciadas. Los cultivos primarios de muchos tipos celulares son posibles porque las células pierden algunas de sus propiedades diferenciadas, entre ellas la característica incapacidad de dividirse, y se convierten en células que mantienen tan solo algunas de las propiedades que las caracterizaban. Esta pérdida de propiedades puede ser debida a desdiferenciación o desadaptación. La primera implica una pérdida irreversible de una propiedad diferencial del tipo celular ( por ejemplo un hepatocito en cultivo pierde sus enzimas característicos (arginasa, aminotransferasas,...) no puede almacenar glucógeno ni sintetizar las proteínas del suero...), mientras que la segunda implica que la característica especializada perdida no es irreversible sino consecuencia de la pérdida de la señal (por ejemplo externa, hormonal, nerviosa,...) y que basta con recuperarla para que se reexprese (por ejemplo Michalopoulos y col. (Michalopoulos y Pitot, 1975; Sattler y col., 1978) han demostrado que los hepatocitos de rata pueden reexpresar tirosina aminotransferasa en presencia de ciertas hormonas (insulina e hidrocortisona) cuando crecen sobre una matriz de colágeno). Documento de Aplicación Page 9 of 31

10 El medio de cultivo El cultivo celular se realiza en medios artificiales preparados mediante la mezcla de componentes purificados o de soluciones orgánicas complejas, en el interior de instrumentos que mantienen las condiciones físico-químicas adecuadas y sobre soportes o recipientes que los contienen y aíslan del medio exterior. Por ello consideraremos que el medio de cultivo estará formado por cuatro elementos: la naturaleza del sustrato o fase en que crecen las células, las condiciones físico-químicas y fisiológicas del medio, la naturaleza y composición de la fase gaseosa y las condiciones de incubación, especialmente la humedad y la temperatura. El sustrato de cultivo. La mayor parte de las líneas celulares crecen en forma de monocapa unidas a un soporte más o menos sólido. El crecimiento en suspensión está usualmente restringido a algunas líneas celulares especialmente de células hematopoyéticas y tumores ascíticos. Según si la línea celular precise o no unirse al sustrato para proliferar se dice que es dependiente (adhesión) o independiente (suspensión) de anclaje: La mayor parte de las células que se mantienen en cultivo proceden de disgregación tisular o de tumores formados por células adheridas y mantienen esa característica: necesitan adherirse al sustrato para mantenerse. Los cultivos en suspensión suelen coincidir con los de aquellas células que in vivo son circulantes, en general células sanguíneas. El gran interés que tiene el cultivo de células sanguíneas (linfocitos) ha extendido notablemente la caracterización de los cultivos en suspensión. El cultivo de células en suspensión tiene algunas ventajas: mayor facilidad de manipulación y pase de un cultivo al siguiente (replaqueo) pues no requieren separación del sustrato mediante por ej. tripsinización, posibilidad de cultivo en mayor escala pues sólo dependen de la accesibilidad del medio y de los gases pero no de la superficie del recipiente, etc... y algunas desventajas: son cultivos homogéneos en los que se pierden las interacciones (espaciales, de adhesión, etc...). Los tipos de sustrato más empleados en la actualidad son los siguientes: Vidrio. Empleado usualmente como sustrato de cultivo tiene como ventajas su escaso coste y su facilidad de limpieza y esterilización. Asimismo es especialmente útil para su posterior observación al microscopio por su calidad óptica. Plástico desechable. Muy empleado en la actualidad como material desechable estéril por irradiación. El plástico más empleado es el poliestireno, de buena calidad óptica. Debido a que este plástico es hidrofóbico requiere un tratamiento mediante irradiación-gamma, químico, o mediante descargas eléctricas que produzca una superficie hidrofílica. El tratamiento es característico de los diferentes suministradores, y por ello los productos varían en calidad de uno a otro. Aunque para la mayor parte de los usos rutinarios no es necesario, es recomendable probar muestras de distintos orígenes y medir la eficacia de plaqueo y las tasas de crecimiento para maximizarlas especialmente en aquellas líneas celulares de crecimiento difícil. Otros plásticos que se emplean son polivinil-cloruro, policarbonato (PVC), politetrafluoretileno (teflón, PTFE), thermanox (TPX). Actualmente es de gran interés, especialmente para el cultivo de células epiteliales polarizadas, el uso de membranas plásticas porosas. Un ejemplo de este tipo de cámara se representa en la figura. Documento de Aplicación Page 10 of 31

11 Microsoportes ("microcarriers"). Se trata de soportes plásticos (poliestireno), de sephadex o poliacrilamida en forma de pequeñas bolas ("beads") a las que se unen las células dependientes de anclaje. Estas bolas con las células adheridas se mantienen en suspensión. Otros sustratos artificiales. Se han desarrollado técnicas para crecer células de glia en sustratos metálicos, de paladio (Westermark, 1978) o en discos de acero (Birnie y Simmons, 1967). Superficies tratadas. La adherencia y crecimiento de las células en un frasco mejora en muchos casos si la superficie ha sido tratada con el medio de crecimiento de otro cultivo, debido a la presencia de colágeno o fibronectina liberada por las células, o bien sobre superficies recubiertas de proteínas de matriz extracelular (fibronectina, colágeno, vitronectina, Matrigel, etc...). Así, se pueden tratar los recipientes de cultivo con fibronectina (1 ng/ml) añadido al medio, o con colágeno. El tratamiento con colágeno desnaturalizado aumenta la adhesión de muchos tipos celulares, y especialmente de las células epiteliales. Muchos resultados parecen indicar que el tratamiento de las superficies con compuestos biológicamente activos pueden inducir alteraciones específicas de la adhesión o el comportamiento celular. Se han descrito métodos para la reconstitución de membranas basales con la finalidad de optimizar las condiciones de diferenciación celular (Reid y Rojkind, 1979). Estos resultados refuerzan la noción cada vez más extendida de que las interacciones célula-matriz extracelular son determinantes en la regulación de la proliferación y la diferenciación. Otros tratamientos que se han usado han sido: gelatina (músculo), poli-d-lisina (algunos teratomas de ratón). "Feeder layers". Se ha descrito previamente que algunos tipos celulares para crecer en cultivo y expresar sus características diferenciadas precisan de suplementos específicos. Una manera de obtener estos suplementos es la de hacerlos crecer sobre los restos de monocapas de otros tipos celulares. Estas monocapas previas se esterilizan o se inhibe su crecimiento (normalmente por irradiación X o gamma). Este efecto podría ser debido a dos posibilidades: suplementación del medio, o modificación del sustrato. Una de las monocapas más empleadas son los fibroblastos de ratón 3T3 irradiados. Matrices tridimensionales. Son sustratos en los que las células penetran, estableciendo una distribución tridimensional: geles de colágeno (Douglas y col., 1980), esponja de celulosa sola (Leighton y col., 1951), o recubierta de colágeno (Leighton y col., 1968), o "gelfoam". En estas matrices muchos tipos celulares crecen y se establecen de una manera análoga a como lo hacen en el tejido de origen: células epiteliales de mama se organizan en disposición tubular, mientras que las células del carcinoma de mama lo hacen de una forma mucho más desordenada (Yang y col., 1981). Sustratos no adherentes. Son sustratos que no permiten la adhesión celular, por ejemplo agar, agarosa, o methocel (metilcelulosa de alta viscosidad). Son de utilidad en situaciones en las que no conviene que exista dispersión de las células derivadas de una originaria, por ejemplo en los procesos de aislamiento de colonias infectadas por virus. Interfases líquido-gel o líquido-líquido. Se han observado en algunas situaciones proliferación celular y adhesión a las interfases líquido-líquido o líquido-gel, a pesar de que se desconocen exactamente los mecanismos (Rosenberg, 1965). Haces microcapilares permeables ( hollow fiber ). Son cámaras de crecimiento de células formadas por un recipiente cilíndrico en el que se siembra, y en el interior del cual hay un haz de capilares plásticos permeables adecuados para que las células se adhieran. Los capilares se encuentran conectados a un circuito de recambio del medio. Este dispositivo ofrece una gran superficie de crecimiento apta para el crecimiento celular, y un eficaz sistema de recambio del medio. Documento de Aplicación Page 11 of 31

12 Tal como se ha descrito previamente, el material más utilizado como sustrato es el plástico desechable, en forma de diferentes tipos de recipientes. Los más comunes son: placas de Petri (ventiladas). Disponibles en 3 tamaños: 3,5, 6,0 y 10 cm de diámetro son las más empleadas cuando se trata de crecer las células para usar directamente en experimentos. No es recomendable, por su escasa estanqueidad, emplearlas para el mantenimiento de líneas. multiplacas. Es una variante de las placas de Petri. Placas de varios pocillos, desde 6 a 96 pocillos. frascos de Roux (botellas ventiladas o no). Disponibles en diferentes tamaños, son recomendables para el mantenimiento de las líneas y la producción de células, o bien para el crecimiento de células en suspensión. Documento de Aplicación Page 12 of 31

13 "roller bottles". Se trata de tubos, con una cara plana sobre la que se fija el cultivo, y que se incuban en los incubadores dotados de "roller". Existen variantes con una gran superficie de adhesión (espirales de plástico...) y que se destinan a la producción de gran número de células. Incubador tipo roller Roller bottles La fase gaseosa. Los componentes más significativos de la fase gaseosa son el oxígeno y el dióxido de carbono: Oxígeno. Las necesidades de oxígeno para la mayor parte de los cultivos celulares es cubierta con la tensión atmosférica, aunque existen cultivos, especialmente los cultivos de órganos que requieren una tensión de oxígeno superior (del 95%) posiblemente debido a la geometría del órgano y a las dificultades de difusión del gas en su interior. Se ha propuesto (McKeehan y col., 1976) que los requerimientos de selenio en el medio podrían ser debidos a su papel en la detoxificación de radicales de oxígeno, especialmente en los medios sin proteínas séricas. Dióxido de carbono. El dióxido de carbono juega un complejo papel en el medio debido a que influye la cantidad de CO 2 disuelto, el ph y la cantidad de iones HCO 3 -. Las reacciones que tienen lugar en el medio son: H 2O HCO + + CO2 H2CO3 H + 3 [1] + NaHCO 3 Na + HCO 3 [2] El incremento de la concentración de ión bicarbonato desplaza la ecuación [1] hacia la izquierda, de modo que el ph se establezca en 7,4. Se puede emplear asimismo otra base, por ejemplo NaOH, siendo la ecuación: NaOH H2 CO3 NaHCO3 H2O Na + HCO3 + H2O [3] De modo que para establecer un ph determinado se debe tener en cuenta especialmente los niveles de bicarbonato sódico y la tensión de CO 2. Cada medio tiene una concentración recomendada de bicarbonato y tensión de CO 2 para alcanzar el ph correcto. Sin embargo, se emplean otras sustancias tamponadoras en la formulación de muchos medios en la actualidad, lo que permite una estabilidad superior del ph en el medio, así como una mayor capacidad tamponadora (los denominados Good's buffers: HEPES, Tricina,.. (Good et al., 1966)). Aunque aparentemente podría ser posible prescindir del bicarbonato en la formulación del medio, esto se ha revelado falso, debido probablemente a que la ausencia de bicarbonato sódico desplazaría la ecuación [1] hacia la derecha, de modo que tendería a desaparecer el CO 2 disuelto y eventualmente el ión bicarbonato, ambos aparentemente necesarios para el crecimiento celular (Itagaki y Kimura, 1974). Una alternativa es la suplementación del medio con piruvato. Esto permite a muchos tipos celulares incrementar su producción de CO2 endógeno, haciéndolas independientes de la aportación de CO2 exógeno. En resumen, los cultivos crecidos a baja densidad en un recipiente abierto precisan una atmósfera de CO 2, cuya concentración esté en equilibrio con el bicarbonato sódico en el medio. A concentraciones celulares muy reducidas (por ej. durante el clonaje) es necesario añadir CO 2 en la fase gaseosa de los frascos cerrados. Cuando la concentración celular es más elevada puede no ser necesario añadir CO 2 a frascos cerrados, pero si en frascos abiertos. En los casos en los que la densidad celular sea elevada, con mucha producción de ácido es recomendable, por la elevada producción de CO 2 endógeno, mantener abierto el recipiente de modo que se pueda eliminar el exceso. En estos casos es especialmente recomendable suplementar el medio con HEPES para asegurar un correcto control del ph del medio. Propiedades físicas. Las características del medio son: ph, osmolaridad, temperatura, viscosidad y tensión superficial. Documento de Aplicación Page 13 of 31

14 ph y capacidad tamponadora. El ph óptimo de crecimiento para la mayoría de tipos celulares es de 7,4 aunque existen pequeñas variaciones: algunas líneas normales de fibroblasto crecen mejor entre ph 7,4 y 7,7 y células transformadas lo hacen en el margen de ph de 7,0 a 7,4 (Eagle, 1973), células epidérmicas pueden ser mantenidas a ph 5,5 (Eisinger y col., 1979). El indicador de ph que se suele emplear es rojo fenol, que presenta color rojo a ph 7,4, naranja a ph 7,0, amarillo a ph 6,5, azul-rojo a ph 7,6 y púrpura a ph 7,8. El medio de cultivo debe estar tamponado, a fin de evitar los cambios bruscos de ph. La solución tamponadora más empleada sigue siendo el tampón bicarbonato, que equilibra el CO 2 atmosférico, a pesar de su escasa capacidad tamponadora, debido a: su bajo coste, baja toxicidad, y beneficios nutricionales para el cultivo. HEPES es la solución tamponadora de elección por su elevada capacidad tamponadora en el rango 7,2 a 7,6, y se emplea en concentraciones de 10 a 20 mm. Cuando se usa conjuntamente con CO 2 externo, debe estar a concentración doble del bicarbonato para un tamponamiento adecuado (ver figura 3.3). Osmolaridad. Muchas células en cultivo tienen una amplia tolerancia frente a la osmolaridad del medio, creciendo bien en el rango de 260 a 320 mosm/kg, con pequeñas variaciones dependiendo de la especie considerada. Es recomendable emplear medios ligeramente hipotónicos para compensar la evaporación durante el periodo de incubación, especialmente en incubadores sin control de la humedad ambiente. La osmolaridad se controla mediante la determinación del punto de congelación o la elevación de la presión de vapor. Hay que tener en cuenta que la adición de HEPES, de drogas disueltas en ácidos fuertes y la neutralización posterior pueden afectar fuertemente a la osmolaridad del medio. Temperatura. La temperatura tiene gran influencia en la tasa de crecimiento de las células, de ahí la importancia de un buen control de ésta en la incubación. Influye asimismo en el ph del medio, por lo que se recomienda o bien ajustar el ph del medio 0,2 unidades por debajo del óptimo, a temperatura ambiente, o bien preparar el medio completo, incluso suero, dejar equilibrar en la estufa y después ajustar el ph, antes de añadirlo al cultivo. Viscosidad. La viscosidad del medio viene determinada fundamentalmente por el contenido en suero y tiene poca influencia sobre el crecimiento. Sí es importante para evitar el daño celular en la agitación del cultivo (menor daño a más viscosidad) y en la tripsinización. Se puede incrementar la viscosidad, especialmente en medios libres de suero, añadiendo al medio carboximetil-celulosa o polivinilpirrolidona (Birch y Pitch, 1971). Tensión superficial. La tensión superficial se ha de mantener baja, y en general sólo se ve alterada por la aparición de espumas en los cultivos en suspensión donde se burbujea CO 2. En estos casos es recomendable emplear un agente antiespumante de silicona pues en éstos casos se produce un aumento de la desnaturalización de proteínas y se incrementa el riesgo de contaminación si la espuma alcanza el cuello del recipiente de cultivo. Condiciones fisiológicas. Hacen referencia a la composición del medio. Ya se indicó que la principal dificultad para el establecimiento de las líneas celulares es el de obtener medios nutritivos adecuados que sean capaces de reemplazar al medio "natural" como extractos embrionarios, hidrolizados de proteína o sueros. Un primer grupo de medios tales como el medio basal de Eagle (MEM) (Eagle, 1955, 1959) y el más complejo 199 de Morgan y col. (Morgan y col., 1950) o CMRL 1066 de Parker y col. (1950) eran medios definidos pero que precisaban de un suplemento de suero entre el 5 y el 20%. A fin de eliminar el aporte de medios complejos no definidos se han ido formulando medios más complejos como NCTC 109 (Evans y col, 1956), 135 (Evans y Bryant, 1965), MB572/1 (Waymouth, 1959), Ham F10 y F12 (Ham, 1963, 1965), serie de los MCDB (Ham y McKeehan, 1978) y los medios de Sato suplementados con hormonas (Barnes y Sato, 1980). La aproximación recomendada para establecer un medio definido es empezar con un medio rico, por ejemplo Ham F12, suplementado con elevada concentración de suero (20%) y probar suplementos que permitan reducir la cantidad de suero hasta poderla reducir o suprimir. Después de años de investigación en la composición de los medios la elección de éstos sigue siendo empírica. Los principales medios empleados y sus aplicaciones son: Medio Basal de Eagle (BME). Medio elemental con sólo los aminoácidos esenciales. Se necesita siempre la suplementación con suero bovino fetal al 10 %. Crecimiento de fibroblastos de ratón y células HeLa. Medio Mínimo Esencial de Eagle (MEM). Es el medio de uso más corriente, contiene más aminoácidos y en mayor concentración que el BME. Se usa para cada casi todo tipo de cultivos y requiere la adición de suero (10%). RPMI Medio diseñado para el crecimiento de linfoblastos y líneas celulares leucémicas en suspensión. Tiene un amplio rango de aplicaciones con suplementos adecuados. Medio MEM modificado por Dulbeco (DMEM). Contiene cuatro veces la concentración de aminoácidos y vitaminas que el BME. Se usa para la selección de hibridomas suplementado con HAT o HT. Modificación de Iscove del medio DMEM (IMDM). Es un medio muy completo que incluye en su formulación albúmina bovina, transferrina, selenito, et... Es muy útil para el cultivo de linfocitos en medio libre de suero. También sirve para otros tipos celulares, pero en ese caso requiere suero a bajas concentraciones. McCoy 5A. Medio diseñado para el crecimiento para el crecimiento de líneas celulares diploides tanto de rata como humanas. Medio L-15 de Leibovitz. Utilizado para el cultivo de virus. Documento de Aplicación Page 14 of 31

15 Medio F-10 de Ham. Para el crecimiento de líneas celulares humanas, debe ser suplementado con proteínas y hormonas. Contiene metales como Fe, Cu, Zn. Es útil para el cultivo de células amnióticas. Medio F-12 de Ham. Útil para el crecimiento de líneas celulares son suplementos proteínicos. Combinado con IMDM es un medio que se usa como libre de suero. Medio 199. Muy usado para el cultivo de células no diferenciadas y estudio de cromosomopatías. Todo medio de cultivo está formado por los siguientes elementos: Soluciones salinas equilibradas (BSS). Una solución salina equilibrada es una mezcla de sales inorgánicas, incluyendo usualmente bicarbonato sódico, y suplementada con glucosa. Se usan para diluir medios más completos, como medio de disección o lavado, o para incubaciones cortas que requieren un medio isotónico no completo nutricionalmente. Su elección dependerá de: la tensión de CO 2. La concentración de bicarbonato deberá permitir el equilibrio a ph 7,54 a 36,5ºC. Así BSS-Eagle es más usada para 5% CO 2 y BSS-Hank (HBSS) es usado a la tensión atmosférica normal. su uso en la disgregación de tejidos o monocapas. En ese caso deberán carecer de Ca 2 + y Mg 2 +. Son recomendables los medios de Moscona, CMF, o PBS de Dulbeco o Vogt (PBSA). su uso para el cultivo en suspensión o de células en monocapa. Es recomendable el uso de MEM(S), variante de MEM sin Ca 2 + que reduce la agregación celular y la adherencia. Debido a su escasa capacidad tamponadora se recomienda suplementarlo con HEPES para ph en el rango 7,2 a 7,8 y Tricina en el rango 7,4 a 8,0. Aminoácidos. Es necesario suplementar el medio basal con los aminoácidos esenciales. Asimismo se suplementa con otros aminoácidos, pues los requerimientos pueden variar de una célula a otra. Un suplemento común es el de glutamina, a 2 mm final, aunque hay algunas líneas celulares pueden usar el glutamato. La glutamina es inestable en el medio, y se recomienda añadirla a partir de un stock concentrado (100 ) que se mantiene congelado, no más de 1 semana antes de añadir el medio al cultivo (conservando a 4ºC). Vitaminas. El medio MEM sólo suplementa con vitaminas del grupo B, siendo los demás grupos aportado por el suplemento de suero. En medios más definidos se suplementan todas las vitaminas. La limitación de vitaminas se manifiesta en la supervivencia de las células y en la reducción de la tasa de crecimiento más que en la densidad celular. Glucosa. Es la fuente de energía en muchos medios. Metabolizada preferentemente vía glucólisis hacia piruvato que puede ser convertido en lactato o acetoacetato que entra el ciclo de Krebs, y genera CO 2. La acumulación de ácido láctico en el medio propio de células embrionarias y transformadas parece indicar un funcionamiento diferente del ciclo de Krebs en estas células respecto al modelo in vivo. En estos casos la mayor parte del CO 2 parece proceder de un uso de la glutamina/glutamato. Otros suplementos orgánicos de bajo peso molecular. Dependiendo del medio, éste incluye en su formulación nucleósidos, intermediarios del ciclo de Krebs, piruvato, lípidos,... La adición de piruvato en el medio permite al cultivo incrementar su producción endógena de CO 2 haciéndole independiente de la aportación exógena de éste. El medio de Leibovitz L15 contiene una concentración superior de piruvato y no contiene bicarbonato sódico, y no requiere aporte de CO 2 en la fase gas. Hormonas y factores de crecimiento (suero). En los medios no definidos suele aportarlos el suero. Los tipos de suero empleados son suero de ternera ("calf serum", CF), suero bovino fetal ("fetal calf serum", FCS), suero de caballo ("horse serum", HS) y suero humano ("human serum", HuS). El más usado es el suero de ternera, mientras que el suero bovino fetal es usado en líneas más exigentes, y el suero humano en líneas humanas. La utilización de suero es problemática pues: a pesar de que la composición del suero es conocida, existen gran cantidad de componentes presentes en cantidades variables en éste que pueden influir notablemente en el cultivo (hormonas, factores de crecimiento...) el suero varía de lote a lote, y cada uno se puede emplear como máximo 1 año, probablemente deteriorándose a lo largo de ese tiempo, a pesar del almacenamiento a baja temperatura. cada cambio de lote de suero requiere realizar una serie de controles tediosos y costosos. si se cultivan varios tipos celulares cada uno puede requerir un lote diferente, lo que complica el almacenamiento e incrementa los costes. crea una dependencia importante de un suministro que no siempre puede mantenerse con la periodicidad y calidad requerida. si se han de purificar productos del medio de cultivo la presencia de los componentes del suero dificulta notablemente estos procesos. el suero está contaminado con desgraciadamente demasiada frecuencia por virus y micoplasmas, lo que representa un grave peligro para el cultivo. algunos factores séricos como el factor de crecimiento plaquetario (PDGF) estimula la proliferación de fibroblastos, lo que puede ser un problema en el establecimiento de cultivos primarios especializados. 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