De la Investigación a la Clínica: Aplicaciones de Citometría de Flujo en la Práctica Clínica

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1 De la Investigación a la Clínica: Aplicaciones de Citometría de Flujo en la Práctica Clínica T.M. MsC Juan Luis Castillo N. Citometría de Flujo Hospital del Trabajador Concepción, Facultad de Medicina Universidad de Concepción Lunes 24 de Abril de

2 Papers Citometría de Flujo: Publicaciones / año (23/04/2006 : 17:00 hrs) AÑOS Datos Tomados de PubMed usando las palabras: flow Cytometry

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8 Flow Cell Sheath fluid Injector Tip Fluorescence signals Focused laser beam

9 Citometría de flujo: mediciones GATE SCATTER FLUORESCENCIA IMAGEN G L M

10 Qué se puede analizar por citometría de flujo? Parámetros Nucleares Enzimas Pared Celular Proteínas Enzimas DNA Enzimas Proteínas Moléculas Superficie Celular Parámetros Superficie Celular Parámteros Citoplasmáticos Parámetros Extracelulares Proteínas Secretadas

11 CITOMETRIA DE FLUJO: APLICACIONES Hematología Inmunología Patología Transplantes Farmacología Biología Toxicología Microbiología Parasitología Citogenética Virología

12

13 1996 CITOMETRIA DE FLUJO: Aplicaciones Clínicas más Frecuentes Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas Estudio de Ploidia de ADN y Ciclo Celular Estudio de HLA-B27 Estudio de Células Progenitoras (CD34) Estudio de Citokinas Intracelulares

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15 Linfocitos 20 a 30% de los leucocitos circulantes Se originan en médula ósea Se encuentran Sangre Linfa Ganglio linfático Timo Médula ósea

16 Subpoblaciones Linfocitarias y sus funciones Linfocitos Linfocitos T Linfocitos B Células NK Células NK-T Producción de Anticuerpos Citoxicidad Directa. Destrucción de células tumorales y células infectadas por microorganismos Lisis de células Tumorales y células infectadas por virus. Regulación inmune Linfocitos T CD4 Helper Colaboran y Dirigen la Respuesta Inmune Linfocitos TCD8 Citotóxicos Supresores Citotoxicidad celular. Suprimen la respuesta inmune

17 Subpoblaciones Linfocitarias y sus Marcadores de Superficie Linfocitos Linfocitos T Linfocitos B Células NK Células NK-T CD3(+) CD3(-)/CD19(+) CD3(-)/CD16(+)/CD56(+) CD3(+)/CD16(-)/CD56(+) Linfocitos T CD4 Helper CD3(+)/CD4(+)/CD8(-) Linfocitos TCD8 Citotóxicos Supresores CD3(+)/CD4(-)/CD8(+)

18 HLA-DR Indicador de activación celular Expresado en: Linfocitos T activados Células NK activadas Células NK-T activadas células presentadoras de antígeno: Linfocitos B Monocitos y Macrófagos

19 Infección VIH-SIDA

20 Ejemplo de alteraciones del recuento de Subpoblaciones Linfocitarias Situación LT Totales LTCD4 LTCD8 LB NK NK-T LT HLA-DR(+) Inicio de respuesta inmune celular (ej.: infección) Establecimiento de respuesta inmune celular Supresión y control de la respuesta inmune celular N N N Inmunodepresión celular (infección VIH) N N N Inmunodepresión celular severa (SIDA) N Infección viral (herpes) N N Terapia Inmunosupresora : Aumentado : Disminuido N : Normal

21 Caso Clínico Varón 28 años, Síndrome Disentérico, CEG y Baja de peso (15-20 kg en 2 meses). Paciente relata haber presentado un cuadro gripal 1 mes antes del comienzo de su cuadro diarreico. 3 Coproparasitológicos (-) EDB y biopsia compatibles Test de Elisa para VIH (-) CU Hospitalización Terapia ATB, corticoides. El 10º día se reemplaza terapia por sulfasalazina, prednisona oral y nutrición vía oral Paciente sufre de una inmunodepresión severa por tratamiento para CU, y desarrolla infecciones por agentes oportunistas. Recuento Linfocitos TCD4: 5 mm3 VIH (+) Confirmado por ISP

22 Evaluación de la Fagocitosis y del metabolismo oxidativo

23

24 Estallido Respiratorio En la destrucción de microorganismos fagocitados se libera peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ) La prueba de estallido respiratorio mide la producción de H 2 O 2 Permite determinar: El grado de activación celular La respuesta a la estimulación.

25 Estallido respiratorio en Fagocitos Adulto normal No estimulado : Estimulado con PMA : % %

26 Ejemplo de alteraciones del Estallido Respiratorio Situación Granulocitos Monocitos B E Δ B-E B E Δ B-E Normal N N >50 N N >50 E.G.C. <20 <20 Sepsis <20 <20 Infección Bacteriana leve a moderada N >25 <50 N >25 <50 Infección viral / Herpes / Aftas bucales / Estrés N >25 >50 N >25 <50 TTO antioxidantes / vitaminas / Zn / Se N N >40 >50 N N >40 >50 : Aumentado : Disminuido N : Normal B : Basal E : Estimulado Δ B-E: Diferencia

27 Expresión de HLA-DR en Monocitos

28 Monocitos

29 Procesamiento y Presentación de Antígenos Ag Molécula MHC ( HLA-DR) Procesamiento Ag CPA Presentación Ag

30 Procesamiento y Presentación de Antígenos Ag Molécula MHC (HLA-DR) Procesamiento Ag CPA (monocito) Presentación Ag Linfocito T Respuesta Inmune TCR/CD3

31 Expresión de HLA-DR en Monocitos Predicting organ failure in patients with acute pancreatitis (Values in parentheses are 95% CI) Cut-off point Sensitivity (%) Specificity (%) HLA-DR(+) monocytes 78 % 83 (64 94) 72 (67-77) APACHE II score 7 % 76 (56 90) 74 (68 79) The Biochemical Society: Clinical Science 2003; 105: HLA-DR (% Expression) Survivors Non survivors Changes in HLA-DR expression on monocytes in patients with septic shock after admittance to the intensive care unit. Clinical Chemistry 2002; 48: days 5 days

32 Expresión de HLA-DR en Monocitos Rango (%) Menor a 24 Interpretación niños y adultos(**) Normal Inmunodepresión leve. Cuadro infeccioso leve. Inmunodepresión. Presencia de cuadro infeccioso moderado a severo. Inmunodepresión severa. Presencia de inflamación sistémica, sepsis. Inmunodepresión severa, sepsis, compromiso vital de alto riesgo.

33 Inmunofenotipo de Leucemias y Linfomas

34 Hematopoiesis PLURIPOTENT STEM CELL MIXED PROGENITOR CELL COMMITTED PROGENITOR CELL RECOGNIZABLE BONE MARROW PRECURSOR CELL MATURE BLOOD CELL BFU-E/CFU-E pronormoblast red cell CFU-GM myeloblast monoblast neutrophil monocyte CFU-Eos eosinophil myeloid progenitor cell CFU-Baso CFU-Meg megakaryocyte basophil platelet pluripotent stem cell pre-t lymphoblast T-cell lymphoid progenitor cell pre-b lymphoblast B-cell & plasma cell

35 CLASIFICACION INMUNOFENOTIPICA (LA) LLA-B : LLA-T : LMA : -BI-pro B: CD79a y/o CD22 Y/o CD19. -BII Común : CD10. -BIII Pre B: clg. -BIV Madura : slg -TI-proT: CD7 -TII-pre T: CD2 y/o CD5 y/o CD8 -TIII-Cortical: CD1a -IIV-Madura: CD1a y CD3mb -LMA-M6 : glicoforina A -LMA-M7 : CD61, CD41, CD42b -LMA-M3 : HLA-DR(-) -LMA-M4 : HLA-DR(+)

36 Colon normal C.U. Crohn Crohn

37 ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL Espectro de presentación. Colitis ulcerosa Enfermedad de Crohn Alteración de la inmunoregulación de mucosa intestinal Inflamación persistente y/o recurrente Congestión ulcerativa Granulomatosa Cáncer

38 ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL Colitis ulcerosa Enfermedad de Crohn Estudios celulares de mucosa intestinal: Células epiteliales Macrófagos Linfocitos: TCD4 Presentadoras de antígenos. Moduladores Perpetuación Induction and Modulation of Gastrointestinal Inflamation FALK Symposium 104, Amsterdam, 1999.

39 Inmunofenotipo de Macrófagos Intestinales (Histológicamente normales) Mucosa HLA-DR CD16 CD54 CD25 CD68 CD80, CD86 CD11b Normal 20-30% Ausente 7% Ausente Ausente Ausente 5% EII Presente Presente C.U. 70% Crohn 46% C.U. Presente Crohn ausente Presente Presente Presente Mahida YR et al. Gut.1989;30: Roggler G. et al. In:Innovative Concept in IBD.Kluwer Acad. Publishers 1999 pps.:

40 Ejemplo de alteraciones del Inmunofenotipo de Macrófagos Intestinales Situación HLA-DR CD16 Normalidad < 30 % < 5 % Inflamación Aguda < 30 % > 5 % Inflamación crónica con escasa actividad Inflamación crónica activa > 30 % > 30 % < 5 % > 5 %

41 Ejemplo de Macrófagos Intestinales

42 Ploidía de ADN y Ciclo celular

43 Células cancerosas difieren de las normales 1. Pérdida de funciones diferenciadas. 2. Expresión de neo antígenos no típicos del estado diferenciado. 3. Capacidad de invadir tejidos no nativos. 4. Metabolismo diferente. 5. Inestabilidad genética elevada. 6. Morfología anormal. 7. Progresión hacia malignidad.

44

45 ESTUDIO DE PLOIDIA DE ADN Y CICLO CELULAR

46 Teoría de mutaciones acumuladas Bert Vogelstein s model of colorectal cancer

47 Definición del Grado de Displasia Concordancia interobservador (0-1) 0.7 Sin displasia V/S Displasia de alto grado Displasia indefinida Displasia de bajo grado 0.46 Sin displasia Displasia indefinida V/S Displasia de bajo grado Histopathology 2004; 45: Aneuploidía precede a la displasia Aneuploidía algunos la consideran un marcador prediplásico y/o preneoplásico

48 Teoría de la aneuplodía Según la teoría de mutaciones acumuladas, el cáncer es producido por mutaciones de genes específicos, llamados oncogenes y genes supresores de tumores. Science 194:23-28 (1976) Nature 289: (1981) Science 285: (1999) Science 285: (1999) Diversos estudios han evidenciado que un gen mutado o la combinación de ellos no es suficiente para transformar una célula normal en neoplásica Science 267: (1995) Biochem J. 340: (1999) Cell cycle 3: (2004) Nature Biotechnol 21:13-14 (2003) Science 284:2089 (1999) Science 297: (2002)

49 Teoría de la aneuplodía Propone que el cáncer es causado por la dosificación anormal de miles de genes normales Esta dosificación anormal de genes es generada por la ganancia o pérdida de cromososmas específicos o segmentos de cromosomas, alias aneuploidía Proc Natl Acad Sci USA 94: (1997) Biochem J 340: (1999) Proc Natl Acad Sci USA 97: (2000) Cell Motil Cystoskel 47: (2000) Cell cycle 2: (2003) IUBMB life 56:65-81 (2004) Nature Biotechnol 21:13-14 (2003) GENES VII (Lewin B.)

50 Teoría de la aneuplodía Hipodiploidía Indice de ADN Límite para viabilidad Hiperdiploidía Indice de ADN mayor a = triplodía 2.0 = tetraploidía Cytometry 22: (1995) Biochem J. 340: (1999)

51 Teoría de la aneuplodía La inestabilidad genómica puede ser identificada por citometría de flujo. Número de células Normal Tetraploide Aneuploide Diploide < 6% > 6% 2N 4N 2N 4N 2N DNA/Célula

52 Teoría de la aneuplodía Relevancia Clínica de la Aneuploidía en cáncer: 1. Si el cáncer es causado por la aneuploidía, la malignidad será proporcional al grado de aneuplodía. 2. La aneuploidía precede el cáncer, por lo que este debiera ser prevenible detectando y eliminando aneuploidías precancerosas. Cell cycle 3: (2004)

53 Teoría de la aneuplodía 104 carcinomas de mama En base a proliferación celular: Near diploid Near diploid baja malignidad alta malignidad Tetraploide Tetraploide baja malignidad alta malignidad La proliferación celular permite clasificar adenocarcinomas de mama (near diploid, tetraploides y aneuploides) en neoplasias de alta y baja malignidad.

54 Teoría de la aneuplodía En la carcinogénesis colorectal y cervical, esta transición es reflejada por la displasia. La inestabilidad genética, medida por la aneuplodía, aumenta progresivamente con el grado de la displasia hasta el desarrollo de un carcinoma.

55 Teoría de la aneuplodía

56 Teoría de la aneuplodía Barrett s Esophagus Tetraploidy, Aneuploidy (>2.7N) Predict Cancer Both Tetraploidy & Aneuploidy Probability of Cancer Aneuploidy Tetraploidy Neither Years Barrett MT, Sanchez CA, Prevo LJ, Wong DJ, Galipeau PC, Paulson TG, Rabinovitch PS, Reid BJ. Evolution of Neoplastic Cell Lineages in Barrett s Esophagus. Nature Genetics, 22: , 1999

57 Tetraploidía predispone a la Aneuploidía en EB Citometría de flujo Normal N= 90 pacientes Progresando a aneuploidía 8/74 (11%) Tetraploide P < /16 (69%) Intervalo promedio entre tetraplodía y aneuploidía: 17 meses

58 p53/flow Cytometric Combinations ( ) N = 240 patients p53 mut and/or LOH and aneuploid and 4N p53 mut and/or LOH and aneuploid or 4N p53 mut and/or LOH, normal flow normal p53, normal flow

59 ANALISIS CITOMETRICO DE TUMORES SÓLIDOS ANEUPLOIDIA

60 ANALISIS CITOMETRICO DE TUMORES SÓLIDOS ANEUPLOIDIA Grado de malignidad Pronóstico Invasión Metástasis Evolución natural Respuesta a tratamiento PROLIFERACION CELULAR Tiempo libre de enfermedad. Sobrevida. Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999

61 Fases del Ciclo Celular en epitelios (tejido fresco) Parámetro Rango Referencia (*) Fase G0G1 Fase G2M Fase S (**) Fase S + Fase G2M Índice de ADN % % % % (*) Análisis modelando fase S con modelo trapezoidal y tres compartimentos.

62 Ejemplo de alteraciones de plodía y ciclo celular Mujer, 64 años. Pólipo colon Yamada II a 25 cm. Biopsia: Adenoma con atipía moderada a severa.

63 2006 CITOMETRIA DE FLUJO: Aplicaciones Clínicas más Frecuentes Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias Estallido Respiratorio en Granulocitos y Monocitos HLA-DR en monocitos. Inmunofenotipo de macrófagos intestinales Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas Estudio de Ploidia de ADN y Ciclo Celular Microbiología Estudio de HLA-B27 Estudio de Células Progenitoras (CD34) Estudio de Citokinas Intracelulares Cuantificación de moléculas Degranulación de basófilos Resistencia a drogas. Cuantificación de citokinas circulantes

64 De la Investigación a la Clínica: Aplicaciones de Citometría de Flujo en la Práctica Clínica T.M. MsC Juan Luis Castillo N. Citometría de Flujo Hospital del Trabajador Concepción, Facultad de Medicina Universidad de Concepción Lunes 24 de Abril de

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