TÉCNICAS DE BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR UTILIZADAS EN INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA BÁSICA Y APLICADA CITOMETRIA DE FLUJO.

Transcripción

1 CME Curso de Posgrado 2009 TÉCNICAS DE BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR UTILIZADAS EN INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA BÁSICA Y APLICADA CITOMETRIA DE FLUJO Ivan Mascanfroni imascan@fcq.unc.edu.ar Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CIBICI, CONICET Facultad de Ciencias Químicas Universidad Nacional de Córdoba

2 CITOMETRIA DE FLUJO Introducción Conceptos básicos Aplicaciones

3 Es la ciencia que permite clasificar y separar células vivas determinando propiedades físicas o biológicas de las diferentes poblaciones celulares.

4 Citometría de flujo Surge a mediados de la década del 70. Resulta de la integración del desarrollo de otras técnicas fundamentales: Microscopía Tinciones citoquímicas Tinciones fluorescentes (1880) Anticuerpos conjugados (1950) Anticuerpos monoclonales (1975) Electrónica Fotomultiplicador (conversión de fotones en pulsos eléctricos (1945) Computación

5 Muestra Células suspendidas en un medio líquido Sangre Cultivos celulares Tejidos Tumores sólidos Alimentos (para estudio de contaminación bacteriana) Las muestras sólidas se disgregan por digestión mecánica o enzimática

6 Parámetros a medir

7 FLUORESCENCIA Fenómeno en el que un compuesto absorbe energía luminosa a una determinada longitud de onda (espectro de absorción) y luego emite el exceso de energía en forma de fotón a una longitud de onda que le es característica (espectro de emisión) excited states excitation emission ground state

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10 Componentes básicos de un citómetro Cámara de flujo Fuente de luz y óptica de focalización Fotodetectores y sistema óptico para direccionar Sistema electrónico (amplificación y conversión a señal eléctrica) Computadora (hardware y software)

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15 Transferencia de energía transfer excitation A B emission phycoerythrin-texas Red phycoerythrin-cyanine5cyanine5 ECD PC5

16 Sistema óptico Bancada óptica

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18 Dispersión de la luz Forward Scatter

19 Dispersión de la luz Side Scatter

20 Dispersión de la luz Fluorescencia

21 MARCACION DE CELULAS CON ANTICUERPOS FLUORESCENTES Se utilizan, generalmente, inmunoglobulinas monoclonales contra antígenos de la supercicie de las celulas, marcadas con colorantes fluorescentes. Control negativo: Anticuerpo del mismo isotipo marcado con el mismo fluorocromo pero que no reconoce ninguna de las moléculas de la superficie. Control negativo: células que no fueron marcadas para determinar autofluorescencia. Control positivo: células normales, células de líneas celulares.

22 Fluorocromos utilizados FL1 FL2 FL4 FL3

23 ADQUISICION CELULAR y ANALISIS DE DATOS Los datos colectados se pueden observar de 2 maneras: 1) Histograma Eventos medidos FLUORESCENCIA

24 Intensidad de fluorescencia y sitios de unión Número de eventos FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC Intensidad de fluorescencia FITC

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26 2) Dot-plot

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28 Expresión de Resultados Datos porcentuales Datos absolutos : Partículas de cuantificación Datos estadísticos Quadrant Statistics File: Normal01.05 Log Data Units: Linear Values Sample ID: Patient ID: Tube: CD3/CD8 Panel: IMK-Lymphocyte Acquisition Date: 15-Jun-95 Gate: G1 Gated Events: 2383 Total Events: 6000 X Parameter: FL1-H CD3 (Log) Y Parameter: FL2-H CD8 (Log) Quad Location: 17, 17 Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean UL UR LL LR Citometría de Flujo

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30 Setting colour compensation Use Cells labelled alone with each of the fluorochromes or Cells labelled with two fluorochromes for two mutually exclusive antigens or Beads containing fluorescent dyes whose spectral characteristics closely match those of the fluorochromes being used

31 Electronic colour compensation using mutually exclusive populations BAD Y-mean Q3=Q4 FL2 GOOD X-mean Q1=Q3 FL1 X-mean Q1 < Q3 FL2 FL FL FL1 Y-mean Q3 < Q4 Not enough FL2-%FL1 Too Much FL2-%FL1 Too Much FL1-%FL2 Y-mean Q3 > Q4

32 Cells stained with CD8-FITC & CD4-PE (uncompensated) FL1 fluorescence in FL2 channel FL2 - x% FL1

33 Cells stained with CD8-FITC & CD4-PE (compensated) FL2 - x%fl1 FL1 - y%fl2

34 Lymphocytes stained with CD8-FITC & CD4-PE - correct and incorrect compensation UNDERCOMPENSATED OVERCOMPENSATED CORRECT COMPENSATION

35 Cells stained with CD4-PE & CD8-ECD (uncompensated) FL2 fluorescence in FL3 channel FL3 fluorescence in FL23 channel

36 Cells stained with CD4-PE & CD8-ECD (partially compensated) FL3 - y%fl2 FL3 fluorescence in FL2 channel

37 Cells stained with CD4-PE & CD8-ECD (compensated) FL2 - z%fl3 FL3 - y%fl2

38 Parámetros celulares que pueden estudiarse: Tamaño celular Complejidad celular interna (organelas, gránulos) Contenido de ácidos nucleicos (DNA, RNA) Proteínas de superficie Proteínas citoplasmáticas Actividades enzimáticas Viabilidad etc.

39 Selección de poblaciones Granulocitos Linfocitos Monocitos

40 Elijo un gate: Ej. linfocitos CD3- CD4 en sangre total CD3 CD4 en gate de linfocitos

41 Determinación de citoquinas intracelulares

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44 TUNEL: Determinación de apoptosis celular Determina ADN fragmentado, incorporando a los extremos 3 OH dntps-fitc

45 ANEXINA V

46 IODURO DE PROPIDIO

47 Proliferación celular: CFSE - Carboxifluorescein diacetato succinimidil ester (CFSE) - Sonda fluorescente que se une a proteínas intracelulares y que se reparte por igual entre las células hijas.

48 Basal Después del cultivo CFSE Fluorescencia / célula X X / 2 X / 4 M1

49 EXPERIMENTAL DESIGN 1. Antigen-specific cytotoxicity in vivo Splenocytes Flow Cytometry Day Immunisation i.v. 1) DC control 2) DC + OVA (20 mg/ml) 3) DC + OVA + LPS 4) DC + OVA + T3 (5nM) Injection i.v. Splenocyte mix(1:1) -Control (CFSE low : 0,5 μm) -SIINFEKL (CFSE high : 3 μm) CFSE low CFSE high

50 DC Control DC +OVA CFSE lo CFSE hi DC+OVA+LPS DC+OVA+T3 T3significantly increased DC ability to stimulate a cytotoxic antigen-specific response, revealed by the reduction of 3µM CFSE stained cells

51 Cytometric bead arrays (CBA) Varios analitos Ac. unidos a beads, emitiendo a distintas intesidades de FL3 Ac conjugados con PE (emitiendo en FL2), proporcionales a la conc del analito. Tonos de un color Multiplex ensayo por CF

52 CBA para citoquinas inflamatorias IL-6 IL-10 MCP-1 IFN-g TNF-a IL-12 PBS CBE FL2-Height -> FL-2 muestra FL2-Height -> FL-2 muestra.005 FL-2: Da cuenta de la concentración de la citoquina. FL-3: Da cuenta de las diferentes citoquinas.

53 Vías de señalización

54 Aplicaciones en clínica Inmunofenotipado de HIV Leucemias y linfomas Ciclo celular Análisis de ploidía en tumores Recuento de reticulocitos (Thiazole Orange) Recuento de células madre Transplante de órganos

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56 DNA Analysis Limited dynamic range (2 fold in normal cells) Small differences may be abnormal cells Immunophenotyping Broad dynamic range (100-10,000 fold) Combinations of surface marker expression often more tightly controlled than surface marker intensity

57 Separación de células usando citometría de flujo (Cell sorting) -El citómetro permite separar físicamente, poblaciones de células -Se puede realizar en condiciones de esterilidad.

58 Hoechst Stained Chromosomes

59 Chromosome Specific Probes from Flow Sorted Chromosomes

60 Cytometric Technologies for the Human Genome Program 1. Flow Cytogenetics 2. Bead Based Assays 3. DNA Fragment Analysis 4. Single Molecule DNA Sequencing

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62 Otras aplicaciones Industria alimenticia Contaminación bacteriana o por levaduras. Ecología Evaluación del impacto ambiental por determinación autofluorescencia de algas marina en muestras seriadas.

63 Debido a la necesidad de utilizar una suspensión de partículas (células, núcleos, cromosomas, etc), para ser leídos de una en una hace que se pierda información sobre la arquitectura de los tejidos que componen las células o de las propias células, así como la interacción entre estas y el medio que las rodea (patrones nodulares o difusos de los linfomas).

64 Dra. Ana M. Masini Dra. Claudia Pellizas Lab. 116 CIBICI, CONICET María M. Montesinos S. Susperreguy Juan P. Nicola Magalí Nazar Vanina Alamino Gracias por su atención!