TEMA 13. Métodos manuales y automatizados para la identificación microbiana
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- María del Carmen Maestre Venegas
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1 TEMA 13 Métodos manuales y automatizados para la identificación microbiana
2 Tema 13. Métodos manuales y automatizados para la identificación microbiana 1. Esquema general de identificación microbiana 2. Métodos convencionales 2.1. Pruebas bioquímicas 3. Métodos rápidos 3.1. Sistemas manuales Enterotubo Lectura e interpretación de los resultados API Lectura e interpretación de los resultados Diferentes tipos de galerías API Sistema ATB (API automatizado) 3.2. Sistemas automatizados Abac-Abactor II Procedimiento Vitek Procedimiento
3 1. Esquema general de identificación microbiana Microscopio (fresco/tinciones) Pruebas inmunológicas Pruebas genéticas Muestra Aislamiento (medios selectivos) Microscopio (fresco/tinciones) Pruebas inmunológicas Pruebas genéticas Pruebas bioquímicas Cultivo puro Identificación
4 2. Métodos convencionales 2.1. Pruebas bioquímicas Rápidas (algunas) catalasa, oxidasa - enzimas preformadas -inmediatas Lentas (la mayoría) - cultivo del microorganismo (18 a 24 horas) - medios con sustrato a metabolizar - reacción positiva cambios de color (ph, reactivos)
5 Cambios de color por ph
6 Cambios de color por reactivos +
7 3. Métodos rápidos Pruebas bioquímicas convencionales Ayuda inestimable en identificación de bacterias Sistemas comerciales de identificación Manuales Automatizados Ventajas: Rapidez de manipulación Homogeneidad de resultados (comparación entre laboratorios) Disposición de bases de datos (interpretar resultados)
8 3.1. Sistemas manuales 1880: primeros cultivos de microorganismos en medio sólido (Robert Koch) 1914: comercialización de un medio deshidratado (Difco) : sistemas comerciales (Enterotubo y API 20E) Primeros sistemas diseñados para enterobacterias Frecuencia en muestras clínicas Rápido crecimiento Buen conocimiento de identificación (pruebas bioquímicas)
9 3.1. Sistemas manuales Comercialización de pruebas metabólicas en paneles o galerías miniaturizados Gran adelanto en identificación de bacterias (principalmente) Características: Pocillos de plástico Mínima cantidad de medio o de sustrato (liofilizado o desecado) Inoculación directa del medio (rehidratación del sustrato) Entre 10 y 50 pruebas Manipulación y lectura siguiendo instrucciones del fabricante Posibilidad de identificar enterobacterias, bacilos Gram negativos no fermentadores, estafilococos, estreptococos, neiserias, corineformes, bacterias anaerobias y levaduras
10 3.1. Sistemas manuales Ventajas Fiabilidad semejante a pruebas convencionales Iguales entre sí Ocupan poco espacio (incubación y almacenamiento) Larga duración (caducidad: 6-12 meses) Manejo sencillo Fácil inoculación Fácil interpretación de resultados Pruebas y medios uniformes
11 Enterotubo Becton Dickinson Diagnostics Tubo de polipropileno (forma de lápiz) 12 compartimentos 12 medios de cultivo diferentes (pruebas bioquímicas) 15 resultados posibles
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13 Enterotubo Alambre para inoculación Compartimentos Centro del tubo atravesado por alambre Alambre sobresale por los extremos (tapones de rosca) No se necesita suspensión bacteriana Inoculación directa desde colonias aisladas (alambre)
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15 Enterotubo Insertar alambre en los 4 primeros compartimentos (condiciones anaerobias) Romper el resto (colocar tapones de rosca) Agujerear 8 compartimentos restantes (condiciones aerobias) Incubar horizontalmente 18 a 24 horas a 37ºC Reactivos inyectados con aguja hipodérmica (a través del tubo de propileno)
16 Lectura e interpretación de los resultados Lectura de las pruebas: positivas (1), negativas (0) Obtención de un número binario ( ) Agrupar las pruebas de tres en tres - negativas (todas valen 0) - positivas primera del triplete vale 4 segunda vale 2 tercera vale 1 Obtención del número de biotipo (5 dígitos) Comprobar identificación con ENCISE (Enterobacteriaceae Numerical Coding and Identification System) (registro de perfiles)
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18 API Biomerieux Suministradas en sobres de aluminio sellados Bandeja de plástico y tapa transparentes
19 API Tiras de plástico con 20 minitubos Orificio en parte superior (inoculación) Contienen sustratos deshidratados de 20 pruebas bioquímicas Los pocillos de la bandeja se llenan con agua de grifo (mantener la humedad) Necesaria suspensión bacteriana A partir de colonias aisladas Agua destilada o solución salina estéril (NaCl al 0,85%)
20 API Llenado de los tubos en la galería API 20E Aceite de parafina Cúpula Tubo Suspensión bacteriana Nivel de llenado estándar Aceite de parafina Para evitar la formación de burbujas de aire al llenar los tubos, dejar resbalar la suspensión por la pared del tubo
21 Lectura e interpretación de los resultados Pruebas de lectura directa e indirecta (necesitan adición de reactivos) Identificación de pruebas positivas y negativas por el color Pruebas negativas API 20E Pruebas positivas
22 API STAPH API 20 STREP
23 Lectura e interpretación de los resultados Interpretación de resultados en función de tabla Asignar el valor + ó a cada prueba (positiva o negativa)
24 Lectura e interpretación de los resultados Agrupar las pruebas de tres en tres Negativas (todas valen 0) Positivas Primera del triplete vale 1 Segunda vale 2 Tercera vale 4 Conversión del código binario (+ +) en código octal (de 0 a 7)
25 Lectura e interpretación de los resultados Transformación de las 20 pruebas en código de 7 dígitos (número de biotipo) etc. Pruebas no incluidas en la galería Código de la muestra: Klebsiella pneumoniae o Serratia liquefaciens
26 Lectura e interpretación de los resultados Anotar resultados en tarjeta Comprobar identificación en manual o en base de datos (ordenador)
27 Diferentes tipos de galerías API API 20 NE (No fermentadores) API 20 A (Anaerobios)
28 Diferentes tipos de galerías API API 50 CH API CORYNE API LISTERIA API CANDIDA API NH
29 Sistema ATB (API automatizado)
30 3.2. Sistemas automatizados Abac Abactor II Menarini Diagnostics Conjunto de rotores (Abac) Instrumento para distribución del inóculo y lectura de las pruebas (Abactor)
31 3.2. Sistemas automatizados Abac Abactor II Ssistema semi-automatizado e informatizado Permite: 1. Identificación de bacterias Gram negativas Determinación simultánea de sensibilidad a 15 antibióticos Basado en técnicas de dilución en medio líquido 2. Determinación de sensibilidad bacteriana frente a 16 antibióticos Bacterias Gram negativas, Gram negativas urinarias, estafilococos y estreptococos 3. Determinación de la CMI
32 Abac Abactor II Abac Rotores con medio de cultivo deshidratado Identificación bacteriana Estudio automatizado de la sensibilidad antimicrobiana Abac-Identibiograma II: rotores que incluyen 13 pruebas bioquímicas y 15 antibióticos a una concentración única o doble Abac-Antibiograma: rotores que incluyen 16 antibióticos a doble concentración Abac-CMI: rotores que incluyen aminoglucósidos y beta-lactámicos Suministrados en bolsas de aluminio al vacío Conservación hasta 18 meses (temperatura ambiente)
33 Abac Abactor II Abactor II Distribución automática del inóculo Inoculación: 8 ml de suspensión en cavidad central de rotor Lectura de los rotores de forma automática Interpretación de resultados e impresión en tarjeta Resultados de identificación bacteriana o Interpretación - Exacta - Probable - Imposible Pruebas de sensibilidad
34 Descripción de Abactor II Sector destinado a la distribución automática del inóculo y la homogeneización del cultivo después de la incubación (mediante breve centrifugación) Sector que realiza la lectura de los rotores (fuente de luz enfocada por una lente al centro del pocillo) Teclado para introducción del número de identificación de las muestras y teclas de función
35 Procedimiento 1. Realizar suspensión bacteriana a partir de colonias aisladas 2. Verter 8 ml del inóculo en la cavidad central del Abac 3. Colocar el rotor en Abactor para que la rotación del aparato durante unos segundos transfiera 0,1 ml de inóculo a cada célula 4. Incubar el Abac en recipiente adecuado en la estufa a 37ºC de 18 a 20 horas 5. Colocar el rotor de nuevo en Abactor, esperar y retirar la tarjeta con los resultados impresos
36 Tarjeta de lectura Mismo color que etiqueta colocada en los rotores Formada por tres hojas autocopiables diferentes
37 Tarjeta de lectura Primera hoja para microbiólogo Resultados de pruebas bioquímicas Nombre (probable o exacto) de bacteria Posibles pruebas adicionales (confirmar identificaciones probables) Perfil de sensibilidad a antimicrobianos (resistente, intermedio, sensible) Otras copias para médico Identificación definitiva Perfil de sensibilidad
38 Vitek Sistema automatizado e informatizado Permite identificación de bacterias Gram negativas y Gram positivas incluyendo patógenos de orina, patógenos entéricos, levaduras, anaerobios, Neisseria y Haemophilus Incubador y lector Módulo de llenado y sellado Tarjetas Programa Indica susceptibilidad a antimicrobianos Disco duro Impresora Biomerieux
39 Vitek Pocillo con sustrato Tarjetas de plástico transparente Llenado por succión al vacío (hasta 10 a la vez) Transferencia automática del inóculo Módulo de lectura admite 30, 60, 120 ó 240 tarjetas Solicitud de resultados en cualquier momento del proceso Identificación disponible en 4-6 horas de media (2 horas para bacterias de crecimiento rápido)
40 Procedimiento 1. Marcar la tarjeta con número que sistema pueda leer directamente 2. Añadir diluyente al tubo que contiene la muestra y colocar tarjetas en soporte con el tubo de transferencia dentro del tubo de muestra 3. Colocar tarjetas en el módulo de llenado y sellado; la muestra se introduce por succión al vacío en los pocillos, sellando después la tarjeta
41 Procedimiento 4. Colocar tarjetas en bandeja e introducir en módulo de incubación y lectura 5. Posibilidad de solicitar informe preliminar una hora después de cargar la muestra 6. Para cada tarjeta se imprime automáticamente al final del ciclo un informe final
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