Angiotensin I (PRA) RIA (CT)
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- Alejandro Tebar Espejo
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1 Instrucciones de Uso Angiotensin I (PRA) RIA (CT) Radioinmunoanalisis de la angiotensina i para la determinación cuantitativa de la actividad plasmatica de la renina (pra) en plasma humano C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBLInternational.com D22335 Hamburg, Germany Fax: +49 (0)
2 Radioinmunoanalisis de la angiotensina i para la determinación cuantitativa in vitro de la actividad plasmatica de la renina (pra) en plasma humano. Sólo para uso en diagnóstico invitro. Sólo para uso profesional. 1. PRINCIPIO DEL ENSAYO La Angiotensina I RIA sirve para la determinación cuantitativa de la actividad plasmática de la renina (PARA) por medio de un radioinmunoanálisis del producto de reacción, la angiotensina I. La generación de la angiotensina I es el resultado del corte enzimático del sustrato de renina, en plasma humano en presencia del inhibidor ACE (ECE enzima convertidora de la angiotensina I); un inhibidor enzimático que bloquea la conversión de angiotensina I en angiotensina II. El radioinmunoanálisis de la angiotensina I es de tipo competitivo. Las muestras desconocidas, controles y calibradores se incuban con angiotensina I marcada con I 125, como trazador, en tubos recubiertos con un anticuerpo policlonal. Despues de la incubación, se aspira el contenido de los tubos y se determina la radioactividad enlazada. Los valores desconocidos se determinan mediante interpolación con la curva estándar. 2. REACTIVOS PROPORCIONADOS Todos los reactivos son estables entre 2 y 8 C hasta la fecha de caducidad del equipo, la cual se indica en la etiqueta de éste. Las condiciones de almacenamiento de los reactivos después de la reconstitución o dilución se indican en el inciso procedimiento del análisis. La fecha de caducidad impresa en las etiquetas de los reactivos son validas, solo para el fabricante, durante su almacenamiento a largo plazo hasta antes de ser ensamblados como componentes del kit. No tomar en cuenta. TUBES TRACER Tubos recubiertos con anticuerpo policlonal antiangiotensina I: 2 x 50 tubos (listos para su uso) Angiotensina I marcada con I 125 : un frasco de 11 ml (listo para su u para su uso) El frasco contiene 260 kbq de angiotensina I marcada con I125, en la fecha de fabricación, en amortiguador con suero bovino, ProClin 300 (< 0.06%, véase inciso sobre precauciones) y un colorante. CAL 0 5 Calibradores: seis frascos 1 ml (listos para su uso) Los frascos calibradores contienen desde 0 hasta aproximadamente 30 ng/ml de angiotensina I en amortiguador con suero bovino, azida de sodio (< 0.1%, véase inciso sobre precauciones). La concentración exacta se indica en la etiqueta. Los calibradores se calibraron contra RP 86/536. CONTROL Muestra control testigo: un frasco de 1 ml (listo para su uso) Los frascos contienen angiotensina I en amortiguador con suero bovino, azida de sodio (< 0.1%, véase inciso sobre precauciones). La concentración exacta se indica en la hoja suplemento. INHIBITOR LYO Inhibidor enzimático: un frasco (liofilizado) Tambien contienen azida de sodio (< 0.1%, véase inciso sobre precauciones). WASHBUF CONC Solución de lavado (20x): un frasco de 50 ml Diluir la solución concentrada antes de su uso. 3. MATERIAL REQUERIDO PERO NO PROPORCIONADO Además del equipo normal de laboratorio se requiere lo siguiente: Micropipetas de precisión (75 L; 100 L). Dispensor ajustable (200 L; 300 µl; 2 ml). Baño de agua. Baño de hielo. Mezclador tipo vórtex. Agitador horizontal u oscilatorio. Sistema de aspiración. Contador gamma calibrado para I PRECAUCIONES 4.1 Generales La solución del inhibidor enzimatico, los calibradores y los controles deben enfriarse a 28 C antes de utilizarse. Los viales de los calibradores y controles deben ser abiertos durante el menor tiempo posible, para así evitar evaporaciones excesivas. No mezclar los reactivos de lotes diferentes. Incluir una curva de calibración en cada ensayo. Es recomendado realizar el ensayo por duplicado. Cada tubo debe estar utilizado solamente una vez. Revision nr : /1 1 / 6
3 4.2 Seguridad radiológica La compra, posesión, uso y transferencia de material radiactivo están sujetas a las disposiciones legales del país en el que se utiliza. El cumplimiento de las normas básicas de seguridad radiológica proporciona protección adecuada. No se debe comer, beber, fumar o aplicarse cosméticos en presencia de materiales radiactivos. No pipetear las soluciones radiactivas con la boca. Evitar cualquier contacto con materiales radiactivos mediante el uso de guantes y bata de laboratorio. Toda manipulación de material radiactivo debe realizarse en el lugar adecuado, alejado de corredores y espacios ocupados. Los materiales radiactivos deben almacenarse en el contenedor aprobado en una zona especializada. Se debe llevar y conservar actualizado un registro de las entradas y almacenamiento de todos los productos radiactivos. El equipo y la vidriería de laboratorio que son objeto de contaminación se deben separar para evitar la contaminación con otros radioisótopos. Cada caso de contaminación radiactiva, o de pérdida de materiales radiactivos se debe resolver de acuerdo con los procedimientos establecidos. El desecho radiactivo debe manipularse de acuerdo a las reglas establecidas por el país donde se utiliza. Este kit contiene 125 I (vida media: 60 días), emitiendo ionizante x (28 kev) y γ (35.5 kev) radiaciones 4.3 Azida de sodio Algunos reactivos contienen azida de sodio como conservador. La azida de sodio puede reaccionar con el plomo, el cobre y el bronce para formar azidas metálicas explosivas. Deseche los reactivos a través del sistema de drenaje mediante lavado con grandes cantidades de agua. 4.4 ProClin 300 R43: Posibilidad de sensibilización en contacto con la piel. 4.5 Material de origen humano Los reactivos de este equipo deben manejarse como si fueran capaces de transmitir hepatitis o SIDA. Los desperdicios deben eliminarse según los reglamentos nacionales actuales. 5. COLECCIÓN, PROCESAMIENTO Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS Colectar la sangre en tubos frios con EDTA. Separar el plasma de las células mediante centrifugación a 28 C. Guardar las muestras a < 20 C (1 año máximo), si la determinación no se realizara inmediatamente, preparar alícuotas para evitar repetidas descongelaciones y congelaciones. Nota: La temperatura del plasma debe permanecer a 28 C en el curso de su utilización. Evitar posteriores manipulaciones para evitar la formación y descomposición de la angiotensina I. 6. PROCEDIMIENTO DEL ANÁLISIS 6.1 Preparación y almacenamiento de los reactivos Preparación, solución del inhibidor enzimático Reconstituir el contenido de los frascos con el volumen de agua destilada (4 C) señalado en la etiqueta. El inhibidor enzimático reconstituido debe almacenarse entre 2 y 8 C hasta la fecha de caducidad del equipo Preparación de la solución de lavado Diluir el contenido del frasco con 950 ml de agua destilada y homogenizar. El reactivo es estable entre 2 y 8 C hasta la fecha de caducidad del equipo. 6.2 Paso enzimático. generación de la angiotensina I Notas y recomendaciones El inhibidor enzimático debe enfriarse a 4 C antes de añadir la muestra. Deben respetarse estrictamente las temperaturas de incubación (4 C y 37 C). Aun las variaciones muy ligeras causan enormes errores en la determinación. El tiempo de preincubación enzimática a 37 C debe determinarse precisamente como sea possible y debe mantenerse dentro de un limite muy estrecho para la incubación de todos los tubos. La verificación del incremento en la temperatura de 4 C a 37 C y la disminución de las mismas son muy importantes. Para entibiar el agua es recomendable utilizar un baño de agua circulante. Para enfriar el agua se recomienda el uso de un baño de agua con regulador de temperatura o enfriador. Se recomienda utilizar tubos hechos de un material conductor (vidrio) para optimizar el aumento y la disminución de la temperatura. Si se espera una actividad baja de la renina en las muestras, se deben aumentar hasta tres horas el tiempo de incubación en el paso enzimático. Revision nr : /1 2 / 6
4 6.2.2 Paso enzimático procedimiento Cuidado : No realizarlo con los calibradores o muestras controles Adicionar 200 L del inhibidor enzimático, previamente enfriado, a 200 µl de cada muestra de plasma y mezclar. Dividir cada muestra en dos alícuotas de 200 L. Pasar una alícuota del baño de agua fria en hielo a un refrigerador (Para la determinación de la angiotensina I basal a 4 C). Poner la segunda alícuota en un baño de agua 37 C (Para la determinación de la angiotensina I generada a 37 C). Incubar todas las alícuota durante 1 hora. Después de la incubación, enfriar las muestras de 37 C a 4 C inmediatamente con la ayuda del baño de agua helada (con hielo). 6.3 Procedimiento del inmunoanálisis PASO 1 Adiciones* A los tubos recubiertos de anticuerpo agregar sucesivamente: 75 µl de calibradores, controles o muestras Después de la incubación enzimática a 37 C y a 4 C respectivamente y 100 L del trazador.** Mezclar. PASO 2 Incubación Incubar 2 hrs. De 1825 C con agitación (>280 rpm). PASO 3 Conteo Aspirar cuidadosamente el contenido de los tubos (excepto el de los dos tubos cpm total ). Lavar con 2 ml de la solción de lavado. Aspirar dos veces. Determinar la actividad (cpm) por 1 min. * Antes de utilizar enfriar a 4 C los calibradores, las muestras controles y las muestras a analizar. ** Agregar 100 µl de trazador a 2 tubos adicionales para obtener las cpm totales. 7. RESULTADOS Los resultados se obtienen por interpolación con la curva estándar. La curva sirve para determinar la concentración de la angiotensina I en las muestras medidas al mismo tiempo que los calibradores. 7.1 Curva de calibración Los resultados presentados en este folleto han sido calculados usando una curva logitlog (regresión cubica de peso) donde B/T (%) o B/B 0 (%) han sido marcadas sobre el eje vertical y las concentraciones de la angiotensina I de los calibradores sobre el eje horizontal. La utilización de otros métodos de cálculo pueden dar resultados ligeramente diferentes. Actividad total: cpm Calibradores Angiotensina I cpm (n=3) B/T (%) B/B0 (%) (Ejemplo de curva de calibración, no utilizar como modelo para realizar los cálculos) 7.2 Muestras Para cada muestra o control incubados a 4 C, o a 37 C, localiza los valores B/T (%) o B/B 0 (%) sobre el eje vertical y leer la correspondiente concentración de la angiotensina I en ng/ml sobre el eje horizontal. 7.3 Cálculos de la actividad de la renina plasmatica. La determinación de la actividad de la renina de plasma se lleva a cabo indirectamente midiendo la generación de la angiotensina I (AI) por hora. Para calcular la PRA, la AI basal, determinada en las muestras de plasma incubadas a 4 C, se sustrae de la AI generada a 37 C utilizando la fórmula que se muestra a continuación: [ AI (37 C) AI (4 C) ] x 2 PRA ng of AI /ml/hr = Tiempo de incubacion enzimática (hrs) Donde: AI (37 C): concentración de la angiotensina I en ng/ml de la muestra incubada a 37 C AI (4 C): concentración de la angiotensina I en ng/ml de la muestra incubada a 4 C Revision nr : /1 3 / 6
5 8. CONTROL DE CALIDAD La obtención de óptimos resultados implica que las muestras testigo sean usadas en cada serie de experimentos para asegurar la calidad de los resultados obtenidos. Dichas muestras testigo deben ser procesadas de la misma manera que las muestras a analizar. Es recomendado que los resultados sean analizados utilizando los métodos estadísticos apropiados. En caso de detectar un deterioro en el embasado del producto ó que los resultados expresen una alteración en las características del mismo, contactar con el Distribuidor local ó notificar a la dirección de IBL@IBLInternational.com 9. VALORES ESPERADOS Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. Los valores que se proporcionan a continuacion son solo indicativos percentile Mediana MinMax Adulto normal N (ng/ml/h) (ng/ml/h) (ng/ml/h) 38 Mañana, supino Posición erguida, 2 horas CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO DEL ANÁLISIS (Para mayores detalles ver la página de APENDICES ) Se facilitan datos representativos solo a modo de ejemplo. El rendimiento obtenido en los distintos laboratorios puede variar Sensibilidad Sensibilidad Analítica: 0.07 ng/ml Sensibilidad Funcional: 0.20 ng/ml 10.2 Especificidad El anticuerpo usado en el inmunoanálisis es altamente específico para la angiotensina I. Este presentó niveles extremadamente bajos de reacción cruzada contra la angiotensina II. Sin embargo, la influencia de posibles interferencias que pueden resultar en la PRA, se elimina por la sustracción de su nivel basal Reproducibilidad Intraanálisis Las muestras se evaluaron 25 duplicados en las mismas series. Los coeficientes de variación fueron iguales o por debajo de 11.3 % Interanálisis Las muestras se evaluaron en duplicado en 10 series diferentes. Los coeficientes de variación fueron iguales o por debajo de 20.9 % Precisión Efecto del tiempo de incubación en la actividad enzimática. Las muestras fueron incubadas en presencia del inhibidor enzimatico por 60, 120, y 180 minutos. No se observo algún efecto significativo en los resultados de PRA Prueba de dilución Las muestras presentes en concentraciones altas se diluyeron serialmente con el calibrador Cero. Los porcentajes de recuperación obtenidos fueron entre 78 % y 99 % Prueba de recuperación Las muestras de plasma de baja concentración se regularon con cantidades conocidas de angiotensina I. Los porcentajes de recuperación obtenidos fueron entre 104 % y 123 % Rango de medida (a partir de la sensibilidad análitica del calibrador más alto): desde 0.07 hasta aproximadamente 30 ng/ml. 11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO El no respetar las instrucciones de uso puede afectar significativamente a los resultados. Los resultados deben ser interpretados con la luz de la presentación clínica total del paciente, incluyendo su historia clínica, los datos de pruebas adicionales y las otras informaciones apropiadas. No utilice muestras hemolizadas, ictéricas o lipémicas. En los ensayos en los que se utilizan anticuerpos existe la posibilidad de que se produzcan interferencias debido a la presencia de anticuerpos heterófilos en la muestra del paciente. Los pacientes que hayan estado en contacto regularmente con animales o hayan recibido inmunoterapia o procedimientos diagnósticos con inmunoglobulinas o fragmentos de inmunoglobulinas pueden producir anticuerpos, p.ej. HAMA, que interfieren con los inmunoensayos. Esos anticuerpos que crean interferencias pueden causar resultados erróneos. Evaluar cuidadosamente los resultados de los pacientes que se sospeche que puedan tener esos anticuerpos. Revision date : Revision nr : /1 4 / 6
6 APÉNDICE Los datos mostrados a continuación sirven como ejemplo. El rendimiento obtenido en los laboratorios individuales pueden variar. A. Exactitud A.1 La dependencia de tiempo de incubación enzimática No se observó ninguna dependencia de la PRA en el tiempo. Tiempo, minutos PRA ng/ml/hour Muestra A Muestra B Muestra C Muestra D Muestra E A.2 Test Dilución Tres muestras de plasma se diluyeron con la calibrador cero y se ensayaron de acuerdo con el procedimiento del kit. Muestra A B C Dilución undiluted 1/2 1/4 1/8 undiluted 1/2 1/4 1/8 undiluted 1/2 1/4 1/8 1/16 Concent. Teórica Concent. Medida Recuperado (%) A.3 Recuperación Las muestras de plasma fueron sobrecargadas con cantidades conocidas de la angiotensina I y se ensayaron de acuerdo con el procedimiento del kit. Conc. Inicial añadida angiotensin Conc. Observado Adición Observado Recuperación (%) Revision nr : /1 5 / 6
7 B. Precision B.1 Intra Ensayo Muestra 1 2 Número de determinaciones PRA, ng/ml/hora CV (%) B.2 Inter Ensayo Después de la generación de angiotensina I, las muestras se determinaron por duplicado en 10 series diferentes de acuerdo con el procedimiento del kit. Se obtuvo la actividad de la renina plasmática y se utiliza para el cálculo de la precisión interensayo. Muestra A B C D E Número de determinaciones PRA, ng/ml/hora CV (%) C. Especificidad Reactividad Cruzada (%) Angiotensin I 100 Angiotensin II ND Angiotensin III ND Tetradecapeptide ND Angiotensinogen ND REFERENCIAS 1. Brossaud, J., Corcuff JB. Clin. Chim. Act. 410:90, Bystrom CE et al., Clin Chem, 56:XXX, Campbell, DJ, et al., Clin. Chem. 55:867, Cartledge, S., Lawson, N., Ann. Clin. Biochem. 37:262, Derkx FH et al., J Biol Chem, 262:2472, Hartman D, et al., Clin Chem, 50:2159, Pimenta E, Calhoum D, Hypertension, 55:e17, Reudelhuber, TL, Hypertension, 55:1071, Sealey, JE, J. Hypertension, 13:27, Sealey, JE, Clin. Chem. 37/10(B): 1811, Sealey et al., Trends Endocrin Metab, 16:86, Ulmer PS, Weikle AW, Clin Chem. 46:1442, Revision nr : /1 6 / 6
8 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα REF LOT CONC LYO IVD Cat.No.: / Kat.Nr.: / No. Cat.: / Cat.No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / ΑριθμόςΚατ.: LotNo.: / ChargenBez.: / No. Lot: / LotNo.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων: Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / InvitroDiagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για InVitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. COMPLAINTS: Complaints may be submitted initially written or vocal. Subsequently they need to be filed including the test performance and results in writing in case of analytical reasons. WARRANTY: The product is warranted to be free from material defects within the specific shelf life and to comply with product specifications delivered with the product. The product must be used according to the Intended use, all instructions given in the instructions for use and within the product specific shelf life. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. LIMITATION OF LIABILITY: IN ALL CIRCUMSTANCES THE EXTENT OF MANUFACTURER S LIABILITY IS LIMITED TO THE PURCHASE PRICE OF THE KIT(S) IN QUESTION. IN NO EVENT SHALL MANUFACTURER BE LIABLE FOR ANY INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL DAMAGES, INCLUDING DAMAGES FOR LOST PROFITS, LOST SALES, INJURY TO PERSON OR PROPERTY OR ANY OTHER INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL LOSS. IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany Tel.: + 49 (0) Fax: 11 IBL@IBLInternational.com WEB: Symbols Version 4.5 /
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