TÉCNICAS DE MUESTREO, ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN. Ingeniería Ambiental
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- Josefina Belmonte Montes
- hace 7 años
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1 TÉCNICAS DE MUESTREO, ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN Ingeniería Ambiental
2 Problema Elección del método analítico Toma de muestra Tratamiento de la muestra Proceso de medida Tratamiento de los datos Valoración de los resultados Informe y conclusiones
3 UNIDAD Nº6 EXTRACCIÓN - CROMATOGRAFÍA
4 CONCEPTO DE CROMATOGRAFÍA. La cromatografía se define como la separación de una mezcla de dos o mas compuestos por distribución entre dos fases inmiscibles, una fase móvil (llamada también activa) que transporta las sustancias que se separan y que progresa (se desplaza en una dirección definida) en relación con la otra, denominada fase estacionaria. Fase estacionaria: sólido o líquido retenido por fijación a un sólido. Fase móvil: fluido (líquido o gas) que arrastra la muestra a través de la fase estacionaria. Los distintos componentes de la mezcla interaccionan de manera diferente con las dos fases estableciéndose un reparto entre ambas Se establece un equilibrio de adsorción o partición del analito entre las dos fases (móvil y estacionaria)
5 FASE ESTACIONARIA FASE MÓVIL
6 CROMATOGRAFÍA (CLASIFICACIONES) 1. Según la finalidad del análisis Separación y purificación Preparativa Separación, cuantificación y caracterización Analítica 2. Según los tipos de fase estacionaria y fase móvil Fase estacionaria Fase móvil Sólida Líquido Líquida o gaseosa Líquida o gaseosa Cromatografía de Adsorción Cromatografía de Partición
7 CROMATOGRAFÍA (CLASIFICACIONES) 3. Según donde se contenga a la fase estacionaria a. Cromatografía en Columna b. Cromatografía en Batch c. Cromatografía en Papel d. Cromatografía en Capa Fina (o Cromatografía en Capa Delgada)
8 CROMATOGRAFÍA (CLASIFICACIONES) 4. Según la fuerza impulsora a. Gravedad b. Capilaridad (papel, capa fina) c. Diferencia de Presión (GC y HPLC)
9 CROMATOGRAFÍA (CLASIFICACIONES) 4. Según la interacción entre la fase móvil y el soluto a. Cromatografía de intercambio iónico Interacción Electrostática b. Cromatografía de interacción hidrofóbica efecto hidrofóbico c. Cromatografía de afinidad variada pero específica d. Cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC) enlaces covalentes e. Cromatografía de fase normal y reversa dipolos
10 CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN El soluto se distribuye entre dos fases; una sólida (adsorbente), la fase estacionaria, y otra móvil. El sólido se presenta en forma de gránulos para incrementar la superficie, es decir el número de procesos de adsorción-desorción. Por ello, la efectividad de interacción depende de los grados de interacción del soluto con ambas fases. A mayor interacción sólido-soluto A mayor interacción soluto-solvente Mayor retención, mobilidad más lenta Mayor avance con la fase móvil Mobilidad más rápida
11 PASOS DEL PROCESO CROMATOGRÁFICO 1. Armado de la Placa o Columna 2. Siembra 3. Desarrollo 4. Revelado 5. Elución
12 CONCEPTO DE R.F. (RELACIÓN DE FRENTES) R F : es la relación entre la distancia que recorre la muestra desde el punto de su aplicación (lugar de siembra) y la distancia que recorre el disolvente hasta el frente del eluyente (solvente de corrida). A mayor RF, mayor movilidad del analito
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17 VARIABLES DE CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN ADSORBENTE: Alúmina: 50 y 200 micrones (comercialmente). Básica (ph=10), neutra (ph=7) y ácida (ph=4). Presenta grados de Actividad de acuerdo a su deshidratación (cantidad de sitios activos) Grado (I): calentamiento entre 300 C-400 C varias horas Grado (II a V): (II) 3%-4%, (III) 5%-7%, (IV) 9%-11% y (V) 15-19% Sílica: Presenta grados de Actividad de acuerdo a su deshidratación (cantidad de sitios activos) Grado (I): calentamiento cercano a 300 C varias horas. Grados (II a V): (II) 5%, (III) 15%, (IV) 25% y (V) 38%.
18 VARIABLES DE CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN ADSORBENTE: Tamaño de Grano del Adsorbente: A menor tamaño de grano, mayor superficie de interacción del analito con la fase estacionaria. Incremento de la Resolución A menor tamaño de grano (en columnas se hace lenta la elución, requiriéndose aplicación de presión). (5 micrones: HPLC; 5-40 micrones: CCD y CCP; micrones: columna) Empaquetamiento en Columnas: Se debe lograr homogeneidad en la fase estacionaria En TLC empaquetamientos menos densos implican un R F mayor y empaquetamientos mas densos un R F menor, ocasionando indefinición o irreproducibilidad. En Columna la homogeneidad esta dada por el asentamiento parejo del relleno.
19 Inercia Química: Deben tenerse en cuenta posibles reacciones parásitas, por ejemplo la sílica tiene propiedades ácidas y la alúmina básicas. El agregado de sustancias ácidas o básicas debe ser contemplado por posible formación de sales. También debe tenerse en cuenta que los adsorbentes grado (I) pueden producir deshidratación de productos lábiles. Controlar que el Adsorbente no reacciones con los analitos
20 VARIABLES DE CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN ESTRUCTURA DEL ANALITO: La capacidad de adsorción del analito viene dada por su capacidad de interacción y ello obedece a los grupos funcionales que presenta y su distribución en su estructura. En Alúmina se observa el siguiente comportamiento (se ordenan de mayor a menor interacción) Ácidos y Bases Alcoholes y Tioles Aldehidos y Cetonas Halogenuros de Alquilo y Ésteres Hidrocarburos Insaturados Hidrocarburos Saturados
21 VARIABLES DE CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN SOLVENTE DE ELUCIÓN: Es fundamental que los solventes usados sean anhidros (para no afectar la reactividad conferida a la fase estacionaria) y que sean miscibles entre sí si se corresponde a una mezcla. Se debe controlar una velocidad de elución lenta en la columna para permitir la presencia del mayor número de equilibrios de reparto POLARidad POLARidad
22 VARIABLES DE CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN TEMPERATURA: El reparto del analito entre las dos fases es un proceso de equilibrio, por ende se establecen diferentes valores de la constante de distribución a distintas temperaturas. El control de la temperatura es fundamental para lograr un proceso reproducible. SATURACION DE LA CUBA: En procesos de adsorción en placa (CCD y CCP) y de partición (cromatografía en papel) el desarrollo se da en cubas que deben estar saturadas con solvente para que cuando se lleve a cabo el proceso de corrida o elución, o en caso contrario el solvente se evaporará a la vez que corre presentandose una corrida inhomogénea. Proceso que se agrava ante mezclas de solventes, donde uno usualmente es más volátil que otro, alterándose la composición del solvente de corrida.
23 CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN REVELADO: Se pueden usar placas que vienen preparadas para observación en UV a 254nm y 366nm. Sales de Cs y Mo como revelador general: 1g de Cs 2 SO 4 2g de Acido Fosfomolíbdico (H 3 [P(Mo 3 O 10 ) 4 ] xh 2 O) 10 ml de H 2 SO 4 90 ml de H 2 O Revelados específicos.
24 APLICACIONES 1. Detección Cualitativa Rápida de Analito: por ejemplo, se puede determinar si la muestra de un compuesto es impuro (solo si da positivo, es caso negativo es no concluyente). Para la determinación de componentes de una muestra, la cantidad de manchas obtenidas solo brinda un mínimo número de sustancias presentes ( por qué?). Permite el seguimiento de una reacción química por analisis de la presencia de reactivos y productos mediante contraste frente a patrones. 2. Determinación Semicuantitativa de Analitos: De la placa se puede recuperar porción del sílice donde el revelado muestre presencia de analito y proceder a una resuspensión en solvente, posterior filtración y determinación de la concentración del analito (mediante métodos ópticos, eléctricos, etc.). 3. Aislamiento y Purificación parcial de Analitos de una Muestra: la cromatografía en capa delgada puede usarse para separar componentes de una mezcla y lograr así el aislamiento de analitos o familia de ellos (sustancias con similar R F ), el procedimiento se realiza por remoción de la porción de placa con muestra (y fase estacionaria) y resuspensión. Posteriormente se puede proceder a nuevas corridas a fin de separaciones más efectivas. 4. De Uso Preliminar para la selección de un solvente de corrida: se selecciona el solvente de corrida para CCP (300 mg de muestra mínimo y 30g de sílica o 50g de alúmina en placa 20x20 de 2 a 3 mm de espesor).
25 CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN CROMATOGRAFÍA EN PAPEL Fase estacionaria Agua de hidratación del papel Solvente Hidrofóbico (aceite de oliva, silicona, parafina, etc.) Fase móvil Líquido (Agua u otro solvente) Cromatografía en Papel de fase invertida o Cromatografía en Papel de fase inversa El valor de Rf depende de las condiciones en las cuales se corre la muestra. Se utizan solventes orgánicos saturados en agua, y los criterios de identificación son similares a los de la Cromatografía de Adsorción (La fase más polar se retiene).
26 Celulosa
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28 CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN
29 CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN REVELADO: En el caso de la corrida de iones metálicos, la exposición a H 2 S puede permitir la generación de sulfuros coloreados. En caso de dobles enlaces presentes, exposición a vapores de I 2. Revelado por bañado Por pulverización
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