Plataforma Tecnológica de Animales Transgénicos para la Producción de Biofármacos y Alimentos Funcionales.

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1 Primer Foro Nacional de Biotecnología, BIOUY2014 Plataforma Tecnológica de Animales Transgénicos para la Producción de Biofármacos y Alimentos Funcionales. Marcelo E. Criscuolo Director de Estrategia e I+D Biosidus S.A.

2 Historia En 1980, Biosidus inicia sus actividades formando parte de una tradicional compañía farmacéutica local. Conformó un equipo de Investigación y Desarrollo compuesto por profesionales del sector académico. Durante su primera década, trabajó en desarrollar los Recursos Humanos y las habilidades necesarias para incursionar en el mercado farmacéutico biotecnológico.

3 Tecnologías productivas Desarrollamos plataformas tecnológicas para la producción de principios activos biofarmacéuticos mediante la tecnología de recombinación de ADN. Fermentación Bacteriana: Transformamos cepas de bacterias Escherichia coli mediante la inserción de plásmidos que contienen la secuencia de ADN que codifica para la proteína humana de interés. Cultivo Celular Masivo: La producción de proteínas recombinantes humanas se realiza a partir de células de mamífero (CHO) genéticamente modificadas para producir la proteína blanco.

4 Productos Eritropoyetina: Hemax, Hypercrit, Zyrop, Epoyet, Potex Filgrastim: Neutromax, Biofigran, Colstim, Granulostim Interferón alfa 2b: Bioferon, Inter 2B, Citopheron, Zavinex, Ganapar Interferón beta 1a: Blastoferon Interferón alfa 2a: Inter 2a, Inmutag, Inferon Lenograstim: Lenobio, Leumostin, Gran Probiótico intestinal: Bioflora Somatropina: HHT, Biotrofin, Somatrop Teriparatida: Osteofortil

5 Presencia Comercial Tenemos presencia comercial en 30 países de América Latina, Asia, Europa, África y Oriente Medio, además de estar desarrollando 29 nuevos mercados. El 75% de nuestra venta es de Exportación. La mayor parte de los productos son promocionados bajo las marcas registradas de Biosidus.

6 Plantas Productivas Contamos con dos plantas farmacéuticas, una para la producción de materias primas y otra para la manufactura del producto final, que estamos reacondicionando y ampliando con el objetivo de aumentar nuestra capacidad productiva. Planta de Almagro (6,200 m 2 ): I&D Fabricación de principios activos biotecnológicos. Planta Bernal (4,500 m 2 ): Manufactura final de productos biotecnológicos: Fraccionamiento aséptico, liofilización, hermetado, inspección y empaque. Auditorías cgmp: Nuestras plantas cuentan con aprobación de entes regulatorios de la región (MERCOSUR, ANVISA, INVIMA) y han superado exitosamente auditorías de otros países como Libia, Sudáfrica, Argelia, Túnez, etc.

7 Nuestros RR.HH. Somos un equipo de 405 personas, de los cuales 180 son profesionales y técnicos. Nuestro equipo de Investigación y Desarrollo está integrado por 30 científicos. 42 % son Profesionales y Técnicos

8 Pipeline Nuestro robusto pipeline nos permitirá ampliar nuestro portfolio de productos para: Nuevas indicaciones de productos actuales Segunda generación de Biosimilares (biobetters), y Nuevas proteínas terapéuticas (especialmente anticuerpos monoclonales) Desarrollo primario Scaling-up Desarrollo producto terminado Estabilidad y preclínico Clínico Registro EPO & (Anemia & Cancer) Lenograstim (Tratamiento Pie Diabético) IFN Beta 1a (sin albúmina) HGH (Biohormon ) INF Beta 1a (simil Avonex ) IFN Beta 1b (simil Betaferon ) Agalsidase PEG Filgrastim PEG Inter 2a

9 Animales transgénicos

10 Capacidad productiva vs. demanda Masa Proteica Capacidad Instalada

11 Capacidad productiva Fermentación Bacteriana Productividad según Proteína Teapéutica Principio activo rhu-ifn alfa 2b r-met-hu-g-csf r-hu-gh Viales/Día (aprox.)

12 CULTIVO CÉLULAS FETALES OVOCITO FETO JERSEY 75 d VACA DONANTE GEN DE LA HORMONA DE CRECIMIENTO HUMANA FIBROBLASTO TRANSGENICO OVOCITO ENUCLEADO TERNERA TRANSGÉNICA JERSEY EMBRIÓN TRANSGÉNICO 5-9 DÍAS VACA RECEPTORA ABERDEEN ANGUS TRANSFERENCIA EMBRIONARIA 278 días

13 Ovocito maduro antes de la extracción del núcleo

14 Identificación del núcleo del ovocito Núcleo

15 Enucleación del ovocito

16 Implantación Ovocito enucleado Célula somática

17 Fusión Ovocito enucleado y célula somática Célula somática con núcleo Ovocito enucleado

18 División celular Pronuclear 2 células 4 a 8 células Transcurridos 5 a 9 días de cultivo, los blastocistos se transfieren a la vaca receptora. Blastocistos

19 Pampa Mansa

20 Productividad Concentración de somatropina en leche de vacas transgénicas Masa de h-gh diaria Jul 18-Jul 28-Jul 7-Ago 17-Ago 27-Ago 6-Sep 16-Sep 26-Sep 6-Oct 16-Oct Masa (mg) Vol (ml) Masa Vol Poly. (Masa)

21

22 Purificación de hgh a partir de la leche de vacas transgénicas kda & 8: marcadores de PM 2 & 5: Material crudo-pre purificación 3 & 6: Purificación parcial 4 & 7: hgh pura

23 Estructura primaria completa

24 Análisis comparativo hgh de leche de vacas transgénicas Vs Estándar Internacional de hgh

25 Caracterización Molecular Adicional Análisis conformacional utilizando diferentes Anticuerpos Monoclonales dirigidos a diferentes regiones de la molécula. Análisis de reactividad contra receptores y líneas de células respondedoras. Dicroismo circular Capacidad de inducir señales de transducción en células respondedoras.

26 Estudios Preclínicos Toxicidad a dosis repetida Biodisponibilidad en perros Bioidentidad en ratas hipofisoprivas Potencia biológica en ratas hipofisoprivas

27 Farmacocinética Estudio efectuado en perros La biodisponibilidad relativa de HHT y Biohormon luego de la inyección sc 0,2 UI/kg.

28 Biodisponibilidad relativa en voluntarios sanos Biohormon No se encontraron diferencias significativas entre productos No se reportaron eventos adversos

29 Publicaciones y patentes High level expression of bioactive recombinant human growth hormone in the milk of a cloned transgenic cow Journal of Biotechnology 124 (2006) A Process of Making Transgenic Mammals that Produce Exogenous Proteins in Milk and Transgenic Mammals Produced Thereby. US 7,718,845 May 18, 2010 Process for Producing Exogenous Protein in the Milk of Transgenic Mammals and a Process for Purifying Proteins Therefrom. US TPO 12/138,529 June 13, 2008 (non provisional) Un proceso para producir proteína exógena en la leche de mamíferos transgénicos y un proceso para purificar proteínas a prtir de ella. MX 277,088, May 2010 A Process for Producing exogenous protein in the milk of transgenic mammals and a process for purifying proteins therefrom No (Russia), Jun 27, 2009

30 Otros usos Producción de alimentos funcionales: Leche con nanoanticuerpos de camélidos con capacidad de neutralizar la infección por Rotavirus.

31 Epidemiología de la Infección por Rotavirus ROTAVIRUS es la principal causa de diarrea en niños de hasta 5 años de edad en todo el mundo 2500 M casos 25 M visitas ambulatorias 2,4 M hospitalizationes 611,000 muertes por año En Argentina: Rotavirus representa el 42% de las causas de hospitalización en niños menores de 3 años.

32 Estructura Molecular del Rotavirus VP6 Cápside interna VP7 (G tipos) Altamente preservada Los anticuerpos convencionales contra VP6 no neutralizan la infección por RV VP7 Cápside exterior Molécula que difiere de un anticuerpo convencional con afinidad a VP6 VP4 Cápside exterior LA CAPACIDAD NEUTRALIZANTE DE LA INFECCIÓN POR RV ESTÁ RELACIONADA CON EL SEROTIPO??

33 Camélidos Domésticos Llamas Alpacas Camellos Bactrianos Salvajes Guanacos Vicuñas Dromedarios Cuatro inmunoglobulinas diferentes: IgM, IgA, IgD e IgG convencionales y de cadena pesada

34 Inmunoglobulinas de camélidos IgG1 IgG Convencional % de la IgG del suero de llama IgG2 IgG3 Anticuerpos de cadena pesada % de la IgG del suero de llama VHH 15kDa Anticuerpo Monoclonal Recombinante PROPIEDADES Única Cadena Polipeptídica Tamaño Pequeño Resistente a condiciones fisicoquímicas extremas Hidrosoluble Afinidad: nanomolar

35 VHH anti VP6 de Rotavirus: Actividad neutralizante in vitro FFU Infección Rotavirus Falta de Infección Nanoanticuerpos + Rotavirus Virus neutralization (%) Wa (P[8]G1) RV Humano KA4 2KD1 3A6 3B2 Non related VHH [VHH] (ug/ml)

36 Protección luego de desafío viral en ratones Diarrea Excreción viral RATONES CON DIARREA (%) # # Abs 405nm 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 # # # # 3B2 3A6 2KD1 2KA4 VHH sin sin no rel tratar desafiar Hs post desafío 2KA4 2KD1 3A 63B2 Antisuero anti- RV C486 Antisuero normal Grupo no tratado VHH No relacionado Tratamiento con VHH disminuye en forma significativa la excreción viral

37 Desafío con Rotavirus humano en cerdos gonotobióticos n=5 Percentage of pigs with diarrhea % PROTECCION CONTRA ROTAVIRUS HUMANO Wa (P[8]G1) Reducción Excreción Viral n=5 0 3B2 VHH no neutralizante IgY control VHH negativo Anti VP6 de convencional Control Rotavirus Anti VP6 de Neutralizant Rotavirus e No neutralizante

38 Ensayos de eficacia VP6 VHH 3B2 passive treatment (n=6) IgM IgA IgG W a HRV ASC / 10E5 MNC Ileum Duodenum Jejunum Spleen MLN Blood Protección luego del desafío con Rotavirus humano en el modelo de cerdos gonotobióticos Fuerte respuesta anti Rotavirus de células secretoras

39 Estado actual del proyecto Se espera para agosto 2014 el nacimiento de las primeras terneras transgénicas para VHH.

40 Plataforma tecnológica Generación de una plataforma tecnológica para obtener leche con nanoanticuerpos destinados a neutralizar diferentes tipos de infecciones adaptable a las características epidemiológicas de cada región geográfica. Mediante la creación de tambos chicos a medianos compuestos por vacas transgénicas que expresen altos niveles de VHH en su leche, puede satisfacerse la demanda diluyéndola en leche común.

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