PREVALENCIA DEL POLIMORFISMO EN EL GEN DEL INHIBIDOR DEL ACTIVADOR DEL PLASMINOGENO (PAI-1) EN PACIENTES CON INFARTO MIOCARDICO RESUMEN

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1 PREVALENCIA DEL POLIMORFISMO EN EL GEN DEL INHIBIDOR DEL ACTIVADOR DEL PLASMINOGENO (PAI-1) EN PACIENTES CON INFARTO MIOCARDICO RESUMEN El IM es un fenómeno multifactorial, resultado de la interacción entre factores genéticos y ambientales relacionados al desarrollo de aterosclerosis y trombosis. Los avances en las áreas de biología molecular han permitido identificar un polimorfismo en la región promotora del gen PAI-1, el cual ha sido asociado con un incremento en la concentración plasmática del PAI-1 y el desarrollo de enfermedad arterial coronaria. En este proyecto se determinó por métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) anidada, la mutación del inhibidor del activador plasminógeno (PAI-1 alelos 4G/5G) en pacientes con infarto miocárdico y testigos sanos. Para lo cual se estudiaron 150 pacientes con diagnóstico clínico, electrocardiográfico y de laboratorio de infarto miocárdico y 100 donadores de sangre que acudieron al Servicio de Urgencias del Hospital de Cardiología del Centro Médico Nacional Siglo XXI del IMSS. Se incluyeron pacientes de ambos sexos mayores de 18 años y mayores de 45 que fuera su primer infarto. A cada paciente o donador se le tomaron 10mL de sangre venosa en tubos vacutainer con EDTA, los cuales se rotularon e identificaron debidamente, así mismo se llenó una hoja de recolección de datos clínicos y personales. A partir de la muestra, se vació a dos tubos, uno se centrifugó y separo el plasma para determinar los niveles del inhibidor del activador del plasminógeno (PAI), y la otra se diluyo con PBS, se homogeneizó y se separaron las células mononucleares a través de un gradiente de Ficoll hypaque. Una vez obtenidas las células mononucleares se separaron en tubos y congelarán a C para su posterior extracción de DNA. El DNA se extrajo utilizando el método de Chomczysky y Sacchi, una vez obtenido se determinó la pureza por el método espectrofotométrico, y se realizó la PCR anidada utilizando los oligonucleótidos correspondientes para determinar la mutación en el gen PAI-1 (alelos 4G/5G), realizando los corrimientos electroforéticos en geles de agarosa al 2%, obteniéndose los siguientes resultados: de los 100 testigos sanos, 18% fueron mujeres y el 82% hombres, de los 150 casos de pacientes 12% fueron mujeres y 88% hombres, encontrando los fenotipos y alelos siguientes: 4G/4G (10%), 4G/5G (32%), y 5G/5G (58%) para el grupo control y 4G/4G (20%), 4G/5G (53:3 %), y 5G/5G (26.7%) para los pacientes, encontrando que el polimorfismo 4G/5G fue el que mas se asoció con el desarrollo de infarto miocárdico en pacientes menores de 45 años.

2 INTRODUCCIÓN La hemostasia se lleva a cabo por un delicado equilibrio entre los procesos protrombótico y antitrombótico, los cuales son mediados por componentes celulares, proteínas solubles en plasma y factores derivados del endotelio. Existen diversas anormalidades que comprometen la producción, actividad o metabolismo de ciertos factores específicos que alteran este balance fisiológico a favor del desarrollo de trombosis, ya sea arterial o venosa. La fisiopatología de la trombosis arterial involucra interacciones complejas entre la superficie endotelial, las plaquetas y diversos activadores de la coagulación. La enfermedad arterial coronaria representa la causa más importante de morbi-mortalidad en el mundo. Diversos estudios han demostrado que en los Estados Unidos más de un millón de personas presentan infarto miocárdico (IM), y más de 500,000 mueren por esta causa. El IM es un fenómeno multifactorial, resultado de la interacción entre factores genéticos y ambientales relacionados al desarrollo de aterosclerosis y trombosis. El desarrollo del IM es favorecido por la presencia de factores ambientales como son: tabaquismo, hábitos dietéticos, sobrepeso y sedentarismo, así como de otras condiciones patológicas como la hipertensión arterial sistémica (HAS), diabetes mellitus (DM) e hipercolesterolemia. En la actualidad se reconocen diversas alteraciones genéticas en los factores que constituyen el sistema hemostático, denominados polimorfismos, que contribuyen al desarrollo de IM. Sin embargo las alteraciones genéticas que ocurren en los sistemas de coagulación y fibrinolítico que favorecen el desarrollo de trombosis arterial no han sido ampliamente investigadas. Entre los diversos polimorfismos que se han descrito como asociados al desarrollo de enfermedad arterial coronaria se encuentran: el inhibidor-1 del activador del plasminógeno (PAI-1), el gen del receptor de la glicoproteína plaquetaria IIIa (PIA2) y el gen que codifica para la enzima 5, 10 metilen tetrahidrofolato reductasa. En algunos casos, estos polimorfismos provocan alteraciones en las funciones de las proteínas del sistema hemostático o alteración en la pared endotelial, produciendo estados pretrombóticos. Los avances en las áreas de biología molecular han permitido identificar un polimorfismo en la región promotora del gen del PAI-1, el cual ha sido asociado con un incremento en la concentración plasmática de PAI-1 y el desarrollo de enfermedad arterial coronaria. El polimorfismo más importante se encuentra localizado en la región promotora 675 bp corriente arriba del sitio de inicio de la transcripción (4G/5G). El incremento en la transcripción genética del PAI-1 esta asociado con 4 bases de guanina (el alelo 4 G), lo cual da como resultado la unión a una proteína del activador de transcripción del PAI-1, mientras que el de 5 bases de guanina (el alelo 5 G), se une a una proteína receptora que disminuye la unión del activador. Los individuos homocigotos para el alelo 4G (4G/4G genotipo) tienen concentraciones 25% mas altas de PAI-1 que los sujetos que son homocigotos para el alelo 5G (5G/5G) genotipo. Los estudios llevados a cabo in vitro, han permitido identificar diferencias en la capacidad de unión a este sitio de las proteínas reguladoras de la transcripción.

3 Diversos estudios han demostrado una asociación entre el incremento de los niveles de PAI-1 y el desarrollo del síndrome de resistencia a la insulina, así como los parámetros del índice de masa corporal, niveles de triglicéridos, niveles de insulina y presión sistólica sanguínea. En los pacientes con hipertrigliceridemia, el genotipo 4G/4G expresa concentraciones plasmáticas altas de PAI-1. Además, estudios in vitro han demostrado que los triglicéridos son un estimulo para el incremento en la producción de PAI-1 por los hepatocitos, cuyo efecto es mediado por los receptores de las moléculas VLDL. Estas observaciones sugieren, que el síndrome de resistencia de la insulina, a través del efecto del incremento de los triglicéridos alteran las síntesis y secreción del PAI-1, lo cual incrementa el riesgo ateromatoso y por lo tanto, favorecen el desarrollo de IM. Debido a los trabajos realizados anteriormente, aún existen datos contradictorios sobre la relación del polimorfismo del gen PAI-1 y el desarrollo de IM. Las características funcionales del polimorfismo 4G/5G y su aparente interacción con las concentraciones séricas de triglicéridos, sugieren que el alelo 4G es más probable que contribuya al IM y a la presencia de hipertrigliceridemia, así como al desarrollo del síndrome de resistencia a la insulina. Se planteó lo siguiente: Cual es la prevalencia de la mutación en el inhibidor del activador del plasminógeno (PAI-1) en pacientes con infarto del miocardio. Hipótesis: Los pacientes con infarto miocárdico presentan asociación con los polimorfismos en los genes del inhibidor 1 del activador del plasminógeno (PAI.1). OBJETIVOS: Determinar la prevalencia de la mutación en el inhibidor del activador del plasminógeno (PAI-1) en pacientes con infarto del miocardio. Determinar la prevalencia entre la presencia del polimorfismo en el gen del inhibidor 1 del activador del plasminógeno (PAI-1) y otros factores de riesgo establecidos: hipertensión arterial sistémica, diabetes mellitus, tabaquismo, obesidad, dislipidemia y la presencia de infarto miocárdico. MATERIAL Y METODOS Extracción de la muestra sanguínea: Se extrajeron de la vena antecubital 5 ml de sangre total en un tubo con EDTA, se centrífugo a 2500 g por 10 minutos. Posteriormente la capa superior (plasma) se retiro cuidadosamente tratando de no perturbar la siguiente capa en donde se encuentra localizado el contenido de células mononucleares (buffy coat), se transfirió con una pipeta de de plástico estéril a un tubo eppendorf estéril, de 1.5 ml libre enzimas (RNasas y DNasas). Finalmente el concentrado eritrocitario se desechó.

4 Extracción de ADN: Se utilizó el equipo comercialmente disponible de la marca Qiagen (QIAamp DNAMini Kit) de acuerdo a las instrucciones establecidas por la compañía. Una vez extraído el ADN se procedió a su conservación en un refrigerador a 70 0 C, hasta ser utilizado para la amplificación de los segmentos correspondientes. Determinación del genotipo del PAI-: Una vez que se extrajo el ADN, se procedió a la amplificación mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) bajo las siguientes condiciones para la búsqueda del polimorfismo en el gen del PAI-1: Para la reacción de PCR se utilizó un oligonucleótido control (sentido) (5, - AAGCTTTTACCATGGTAACCCCTGGT-3, ) y un oligonucleótido especifico para el alelo 4G (5, AGAGTCTGGACACGTGGGGA-3, ) o bien una secuencia específica para el alelo 5G (5, AGAGTCTGGACACGTGGGGG -3, ), y un oligonucleótido (contrasentido) común par ambos alelos (5, - TGCAGCCAGCCACGTGATTGTCTAG-3, ). Las reacciones se realizaron una por cada alelo específico en ambos grupos (control y pacientes). La amplificación de cada una de las reacciones se visualizó en un gel de agarosa mediante el siguiente patrón de bandas: la reacción control llevada a cabo con los oligonucleótidos sentido y contrasentido produjo una banda de 257 pares de bases (Pb) y la reacción específica para cada alelo produjo una banda de 136 Pb. Obteniéndose los productos que se ejemplifican en la siguiente tabla. (1 a reacción de PCR) (2DA. Reacción de PCR) Pacientes PCR con oligonucleótido 4G PCR con oligonucleótido 5G Homocigotos 4G/4G 257 P b P b 257 P b Homocigotos 5G/5G 257 P b 257 P b P b Heterocigotos 4G/5G 257Pb 257Pb La reacción del alelo 4G se llevó a cabo con una reacción de PCR conteniendo lo siguiente: en un volumen final de 50 μl conteniendo 2 ng/μl de ADN, 0.8 U de la enzima Taq DNA polimerasa, una concentración final de 1 X de buffer, 1.6 mmol/l de MgCl2, 100 mol /L de mezcla de alelos específicos de dntp, 400 nmol/l del oligonucleótido específico (sentido) y 800 nmol/l del oligonucleótido (contrasentido). La reacción alelo específica de PCR para el alelo 5G es idéntica a excepción de la concentración de MgC12 que fue de 2.2 mmol/l. Las condiciones bajo las cuales se llevó a cabo la PCR fueron de (32 ciclos) para la desnaturalización (94 0 C por 35 segundos), alineación de (65 0 C por 35 segundos), y una extensión de (72 0 C por 70 segundos). Las condiciones para el alelo específico 5G fueron idénticas a excepción de una alineación final de 22 ciclos a 58 0 C.

5 Identificación de fragmentos polimórficos: Una vez amplificado el producto se procedió a su corrimiento electroforético en un gel de agarosa al 2% y posteriormente teñido con bromuro de etidio a una concentración de 1 μg/ml y visualizado usando un transiluminador de luz ultravioleta, cada paciente fue clasificado en uno de los tres grupos: 4G/4G. 4G/5G o 5G/5G. RESULTADOS A continuación se muestra una imagen representativa de los tres genotipos, encontrados en la población estudiada. 527pb 139pb D1 C1 C2 D2 C3 D3 C4D4 C5D5 La figura muestra los tres genotipos encontrados: línea 1,2 y 3 5G/5G, línea 4 4G/5G y línea 5 4G/4G. La población estudiada fueron mayores de 18 años y menores de 45, en la tabla No. 1 se presenta la edad media de la población estudiada y distribuida por genero. Tabla: 1 Distribución de la población estudiada por genero. VARIABLE GRUPO CONTROL PACIENTES CON IM EDAD (AÑOS): 39.9± ±4.87 GENERO FEMENINO: (%) 18% 12% MASCULINO: (%) 82% 88%

6 El porcentaje de varones en el grupo de estudio fue de 88% de hombres y 22% de mujeres, mientras que el grupo control fue 82% varones y 18% mujeres. La población estudiada se distribuyo de acuerdo con sus antecedentes heredo familiares de infarto y diabetes, obteniéndose los resultados que se muestran en la tabla No.2. Tabla: 2 Distribución de la población estudiada por factores de riesgo. VARIABLE GRUPO IM n=150 GRUPO CONTROL n=100 p FACTORES DE RIESGO: ANTECEDENTE HEREDO FAMILIARES (%) 33 (22.2%) 43 (43%) <0.001 Diabetes (%) 53 (35:5%) 18 (18%) <0.024 En el grupo de IM el porcentaje de sujetos con diabetes fue del 35% y en el grupo control 18% p<0.024 y Antecedentes heredo familiares fue del 43% y en el grupo control fue del 22% p<0.001). VARIABLE GRUPO IM n=150 GRUPO CONTROL N=100 P FACTORES DE RIESGO: HIPERTENSIÓN( n/%) 30 (20.2%) (47%) <0.001 TABAQUISMO (n/%) 57 (37.7%) (70%) <0.001 COLESTEROL (mg/dl) ± ±14.32 El porcentaje de hipertensos en el grupo con IM fue del 47% mientras que en grupo control fue del 20% p< Tabaquismo en el grupo con IM fue del 70% y en el grupo control 37% p<0.001.

7 A continuación se resumen los resultados obtenidos de la genotipificación para la mutación 4G/5G en el gen del PAI-1. Tabla:3 Resultado de la genotipificación de la población estudiada. RESULTADOS DEL GENOTIPO 4G/4G 4G/5G 5G/5G (100) GRUPO CONTROL 10 (10%) 32 (32%) 58 (58%) (150) PACIENTES CON IM 30 (20%) 60 (53:3%) 40 (26.7%) El porcentaje encontrado de los fenotipos y alelos es el siguiente: en el grupo control: 4G/4G, (5) 4G/5G y (17) 5G/5G y en el grupo de estudio. En el grupo de IM se encontró la siguiente distribución genotípica y alélica n/%: 4G/4G 18 (20%), 4G/5G 48 (53:3%) y 5G/5G 24 (26.7%), y en el grupo control: 4G/4G 10 (10%), 4G/5G 32 (32%) y 5G/5G 58 (58%). El porcentaje del alelo 4G en el grupo IM fue del (46.56%) y en el grupo control fue del (26%), para el 5G fue del (53:35%) en el de IM y el grupo control /74%). Tabla No. 4 COMPARACIÓN DE LA FRECUENCIA DEL POLIMORFISMO 4G/5G EN MESTIZOS Y SEIS GRUPOS ETNICOS EN MÉXICO COMPARA DON LA OBTENIDA EN NUESTRO LABORATORIO N=590 N=100 4G/4G 11% (10) 10% 4G/5G 41.7% (32) 325 5G/5G 44.3% (58) 58% *Laboratorio de Genética Molecular de la Universidad de Guadalajara. Se encuentra que: La distribución genotípica y alélica del polimorfismo 4G/5G es diferente a la reportada en otras poblaciones a nivel mundial.

8 El alelo 5G probablemente representa un factor protector para el desarrollo de infarto miocárdico. IMPACTO El conocer mejor los diferentes mecanismo que producen trombosis permitirá dirigir mejor los tratamientos para prevenir los infartos en población económicamente activa.

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