Manual de Procedimientos

Transcripción

1 Ministerio de Salud y Ambiente Secretaría de Políticas, Regulación y Relaciones Sanitarias Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud Dr. Carlos G. Malbran Manual de Procedimientos Diagnóstico, aislamiento y caracterización de Shigella spp. SERVICIO ENTEROBACTERIAS DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGÍA Buenos Aires Argentina 2005

2 INDICE CAPÍTULO I- INTRODUCCIÓN 3 CAPÍTULO II- AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE SHIGELLA spp ESPECÍMENES 5 2.-PROCESAMIENTO AISLAMIENTO IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE SHIGELLA spp. 7 Pruebas Bioquímicas Diferenciales 9 Agar Hierro Tres Azúcares y Agar Kligler 10 Agar Lisina Hierro 13 Prueba del Indol 14 Prueba de la Beta Galactosidasa 16 Test de Utilización de Azúcares 18 Test de Decarboxilasa-Dehidrolasa 20 Prueba del Acetato 22 Prueba del Mucato 23 Citrato de Christensen SEROTIPIFICACIÓN DE SHIGELLA spp. 25 Flujograma para Serotipificación de Shigella spp. 28 CAPÍTULO III- IDENTIFICACIÓN DE SHIGELLA spp. Y DETECCIÓN DE FACTORES DE VIRULENCIA POR REACCIÓN DE LA POLIMERASA EN CADENA (PCR) INTRODUCCIÓN PROCEDIMIENTO GENERAL PROTOCOLOS ESPECÍFICOS PARA SHIGELLA spp PCR para Identificación de Shigella spp PCR para Identificación de S. sonnei y S. flexneri PCR para Detección de factores de Virulencia de Shigella spp. 40 CAPÍTULO IV-MEDIOS DE CULTIVO Y PRUEBAS BIOQUÍMICAS 44 Agar McConkey 44 Agar EMB 44 Agar SS 45 Agar XLD 46 Agar Hektoen 47 PLANILLAS DE RESULTADOS 48 2

3 CAPÍTULO I - INTRODUCCIÓN Las bacterias del género Shigella, de la familia Enterobacteriaceae, son bastones Gram negativos, de 0.3 a 1 µm de diámetro y de 1 a 6 µm de longitud, que pueden estar solos, en cadenas o de a pares. Son no móviles, no esporulados, anaerobios facultativos, oxidasa negativo, fermentan la glucosa y otros azúcares sin producción de gas, Voges-Proskauer negativo y rojo de metilo positivo. No utilizan citrato de Simmons, no producen SH 2 y son lisina descarboxilasa, arginina dehidrolasa y ureasa negativos (Tabla 1). La temperatura de crecimiento óptima es 37º C. El género está formado por Shigella dysenteriae (serogrupo A); Shigella flexneri (serogrupo B); Shigella boydii (serogrupo C); Shigella sonnei (serogrupo D). La shigellosis, infección causada por Shigella spp., está distribuida en todo el mundo, pero es endémica en países tropicales y de clima templado con mayor incidencia en verano. Es causa de infección intestinal aguda en niños pequeños. Las 2/3 partes de los casos y la mayoría de las defunciones ocurren en niños de 6 meses a 10 años. Representan también un riesgo para viajeros que se trasladan hacia áreas endémicas y son frecuentes los brotes en condiciones de hacinamiento y falta de saneamiento como cárceles, hospitales psiquiátricos, geriátricos, campamentos y a bordo de embarcaciones. Shigella tiene como únicos huéspedes al ser humano y a los primates. La enfermedad se transmite de persona a persona por la vía fecal-oral, por alimentos contaminados donde el vector de transmisión son las moscas, o por el uso de aguas contaminadas para la preparación de los mismos. La bacteria es altamente infecciosa por la ruta oral, la ingestión de tan sólo 10 a 100 organismos produce infección en voluntarios. La gravedad y la letalidad de la infección dependen de la edad de la persona, del estado nutricional, de la magnitud de la dosis infectante y del serotipo del microorganismo. Shigella dysenteriae produce la forma más severa de la enfermedad, con una tasa de letalidad del 20%. En cambio las infecciones por otras especies de Shigella se autolimitan y rara vez son fatales, excepto en huéspedes inmunocomprometidos, ancianos y niños pequeños. Shigella flexneri también puede producir disentería. Shigella sonnei puede 3

4 producir brotes esporádicos por alimentos semi-cocidos o mal cocidos y aguas contaminadas. Shigella boydii se aísla con menor frecuencia que las otras tres. TABLA 1. Propiedades Bioquímicas de Shigella spp. Ensayo o Sustrato Resultado Sulfuro de hidrógeno - Glucosa (gas) - Glucosa (ácido) + Movilidad - Citrato de Simmons - Adonitol - Mucato - Rojo de metilo + Voges-Proskauer - Arginina dihidrolasa - Lisine decarboxilasa - Ornitina decarboxilasa Sh. sonnei +; otras Shigella Urea (hidrólisis) - Fenilalanina deaminasa - Salicina - Lactosa - Sacarosa - Xilosa - Bioseguridad Los procedimientos de laboratorio se realizan de acuerdo con las recomendaciones establecidas en Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 4 th. CDC/NIH. 4

5 CAPÍTULO II AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE SHIGELLA spp ESPECÍMENES Las muestras se deben obtener en el período agudo de la enfermedad, antes de iniciar el tratamiento con antimicrobianos. Para muestras humanas se puede utilizar un hisopo de algodón para recoger material mucoso o sanguinolento de la materia fecal. Las muestras que no se van a procesar en dos horas se deben mantener en medio de transporte Cary- Blair con tioglicolato que reduce la tensión de oxígeno. Este medio tiene la ventaja de ser estable hasta 18 meses después de su preparación, cuando las condiciones de almacenamiento son correctas y las muestras se pueden conservar hasta 5 días, siempre en refrigeración. 2.- PROCESAMIENTO AISLAMIENTO Materiales y equipamiento Ansas descartables (10µl) Placas de Petri (9 cm diámetro) Balanza Estufa de incubación a 37ºC Mechero Bunsen Pipetas para 0.1 ml (pipetas de 1 ml) Hisopos de algodón Medios TSA agar (estrías) TSI agar (estrías) LIA agar (estrías) MacConkey agar (placas) EMB agar (placas) SS agar (placas) XLD agar (placas) Hektoen agar (placas) 5

6 Procedimiento Comentarios No hay un medio de enriquecimiento específico para el cultivo y aislamiento de Shigella spp. de materia fecal. Día 1 Realizar la siembra en los medios SS, XLD, McConkey, Hektoen, EMB, con heces frescas suspendidas en solución salina o directamente a partir del hisopo. Incubar las placas por horas a 37º C Seleccionar uno o dos de los medios de aislamiento. Día 2 Seleccionar colonias convexas de 2 a 4 mm de diámetro. Leer placas de SS: colonias translúcidas, ligeramente rosadas, a veces con un centro más oscuro. Leer placas de XLD: colonias translúcidas con un tono rojizo. Leer placas de McConkey: colonias translúcidas, ligeramente rosadas. Leer placas de Hektoen: colonias verdes, elevadas y húmedas. Leer placas de EMB: colonias translúcidas de color ambar. Sembrar las colonias sospechosas en agar TSI, agar LIA y agar TSA. A partir de la estría en TSA se realiza la confirmación bioquímica y la serotipificación (ver día 3). 6

7 2.2 IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE SHIGELLA spp. Materiales y equipamiento Ansas descartables Mechero Bunsen Estufa a 37ºC Medios Manitol 1% Sacarosa 1% Xilosa 1% Dulcita 0.5% Medio base con arginina, lisina y ornitina y medio base sin agregados para control Vaselina estéril Discos de ONPG para ensayo de ß- galactosidasa Procedimiento Día 3 Leer los tubos de agar TSI y LIA de acuerdo a la Tabla 2 y realizar la prueba de ONPG a partir del TSI. Del cultivo en agar TSA inocular: medio SIM; medios con arginina, lisina y ornitina y control; medios base con manita, sacarosa, xilosa y dulcita; agar acetato de sodio, agar Christensen, caldo mucato. Incubar todas las pruebas por 18 a 24 horas a 37ºC. Realizar la serotipificación a partir del agar TSA (ver 2.3 Serotipificación) Comentarios Colocar una capa de vaselina líquida sobre los medios con aminoácidos y el tubo control. La confirmación bioquímica y la serotipificación se pueden realizar al mismo tiempo. Dia 4 Leer los resultados de las pruebas bioquímicas de acuerdo a la Tabla 2 y anotar los mismos en la Planilla de Resultados. 7

8 Realizar la prueba de ONPG utilizando discos de ONPG según lo indicado por el fabricante. Realizar la prueba de indol agregando 1 ml de reactivo de Erlich al medio. TABLA 2. Pruebas Bioquímicas para identificación de Shigella spp. Interpretación de Resultados TSI TSI Medio Reacciones Producción de ácido (si la base es amarilla y la estría roja, la producción de ácido se debe a la glucosa) Producción de ácido de lactosa y/o sacarosa Resultados Negativo Positivo Base roja Base amarilla Estría roja Estría amarilla TSI Producción de gas No hay burbujas de gas en la base TSI Producción de H 2 S Sin color negro Color negro LIA Producción de H 2 S Sin color negro Color negro LIA Reacción alcalina, color violeta Botón púrpura a través del medio. Organismos Superficie amarilla que no descarboxilan la lisina producen una estría alcalina y un fondo ácido Burbujas de gas en la base Botón púrpura Superficie púrpura Ensayo de Lisina/ornitina decarboxilasa, Color amarillo Color púrpura Aminoácidos arginina dehidrolasa ONPG Β-galactosidasa Sin color amarillo Medio base con Fermentación Azul Rosa azúcares Indol Producción de indol Anillo amarillo Anillo rojo-rosado Las siguientes características pueden ayudar en la identificación de Shigella spp.: a) Los aislamientos son siempre inmóviles y lisina negativo. b) La producción de gas es rara aunque se puede observar ocasionalmente en cepas de Sh.flexneri, Sh. boydii y Sh. dysenteriae. 8

9 PRUEBAS BIOQUÍMICAS DIFERENCIALES a) Entre especies de Shigella En la diferenciación de los cuatro miembros del género se deben tener en cuenta algunas propiedades bioquímicas: - Shigella dysenteriae: manitol negativo y ornitina descarboxilasa negativa. Particularmente, Sh dysenteriae 1 es arabinosa e indol negativo y ONPG positivo muy rápido. - Shigella flexneri: la gran mayoría de las cepas fermentan manitol y son ornitina descarboxilasa negativo. - Shigella boydii: la gran mayoría de las cepas fermentan manitol y son ornitina descarboxilasa negativo y tienen propiedades bioquímicas diferenciales entre los serotipos. - Shigella sonnei: indol negativo, ornitina descarboxilasa positivo, ONPG positivo, xilosa negativo y ramnosa y manitol positivo. Los caracteres diferenciales se resumen en TABLA 3. TABLA 3. Reacciones Bioquímicas de Shigella spp. Especie Sh. dysenteriae Sh. flexneri Sh. sonnei Sh. boydii D-Manitol ONPG Ornitina decarboxilasa Sacarosa D-Xilosa Dulcitol b) Entre Shigella spp. y Escherichia coli La diferenciación de Shigella respecto a E. coli es uno de los problemas con que se enfrenta el laboratorio de microbiología y refleja el hecho que E. coli y las cuatro especies de Shigella están estrechamente relacionadas sobre la base de estudios de hibridación DNA-DNA. 9

10 La mejor aproximación es realizar un conjunto de pruebas bioquímicas. En Edwards and Ewing s Identification of Enterobacteriaceae, 4 th Ed., se sugiere realizar los ensayos que se indican en TABLA 4. TABLA 4. Diferenciación de Shigella spp. y E. coli. Ensayo Shigella E. coli Mucato - + Acetato - + o (+) Cit. Christensen - +, (+), - Indol (producción) - o + + Lisina decarboxilasa - +, (+), - Ornitina decarboxilasa - o + +, (+),- Arginina dehidrolasa +, (+), - +, (+), - Glucosa (gas) - + Sacarosa +, (+), - +, (+), - Salicina - +, (+), - Movilidad - + ó % o más positivo en 1-2 días; (+) positivo tardío; - 90% o más negativo. Las pruebas citrato de Christensen, acetato de sodio y mucato de sodio son de valor en la diferenciación de los miembros del género Shigella y Escherichia, particularmente de biotipos anaerogénicos, no móviles, porque los aislamientos que fermentan mucato o son alcalinos en agar acetato o citrato de Christensen es muy probable que sean E.coli. PRUEBAS BIOQUÍMICAS Agar Hierro Tres Azúcares (TSI) y Agar Kligler I. Principio El medio fue diseñado para determinar la habilidad de las bacterias de fermentar hidratos de carbono y producir sulfuro de hidrógeno (SH 2 ). El medio contiene 1 parte (0.1%) de glucosa y 10 partes (1.0%) de lactosa y sacarosa. El indicador de ph es el rojo fenol y el sulfato ferroso pone en evidencia la formación de SH 2. Si el microorganismo fermenta glucosa, tanto la punción como la estría aparecerán de color amarillo. Si el organismo fermenta lactosa y/o sacarosa, la estría permanecerá ácida (amarilla). Si no fermenta 10

11 lactosa, la estría se vuelve alcalina (roja). Los organismos que no fermentan glucosa no producen cambios en el ph del medio o producirán productos alcalinos y el medio TSI permanecerá rojo. La producción de SH 2 se manifiesta por un ennegrecimiento del medio. El agar de Kligler contiene dos azúcares: lactosa (1%) y glucosa (0.1%). Este medio puede reemplazar al TSI, la diferencia entre ambos es la ausencia de sacarosa. Los fundamentos bioquímicos y la interpretación de los resultados son los mismos para ambos medios. II. Materiales El medio está disponible comercialmente. Disolver en agua destilada y dispensar volúmenes de 5.0 ml en tubos con tapa a rosca; autoclavar a 121º C por 15 minutos y enfriar inclinado dejando un fondo de 5 a 10 mm. El sustrato es estable por 3 meses. Rotular indicando fecha de preparación y de expiración. Guardar en heladera; si hay cambio de color no usar. III. Procedimiento A. Con un ansa estéril tomar material. B. Punzar el fondo en el centro. C. Retirar el ansa y estriar sobre la superficie del agar. D. Dejar la tapa floja para permitir intercambio de aire. E. Incubar a 37º C por 18 a 24 horas. IV. Resultados A. Estría ácida/fondo ácido (amarillo/amarillo): fermentación de glucosa, sacarosa y/o lactosa (E. coli). B. Estría alcalina/fondo ácido (rojo/amarillo): fermentación de glucosa solamente (Shigella spp.). C. Estría alcalina/fondo alcalino (rojo/rojo): no fermentador (Pseudomonas aeruginosa). D. Precipitado negro en el fondo: producción de SH 2 (Salmonella spp). E. Burbujas o roturas: producción de gas (E. coli, Salmonella spp.). 11

12 V. Control de Calidad Bacteria Estría Punción SH 2 Salmonella Typhi K A + (*) Salmonella Paratyphi A K Ac/g - Salmonella spp. K A + Shigella spp. K A - Enterobacter aerogenes A Ac/g - Enterobacter cloacae A Ac/g - Escherichia coli A Ac/g - Citrobacter A Ac/g + Klebsiella A Ac/g - Proteus vulgaris A A oac/g +(sucio) Proteus mirabilis K Ac/g o A + (sucio) Klebsiella pneumoniae A Ac/g o A - (*) sólo en la parte superior de la punción o formación de un anillo. A:ácido; K:alcalino; c/g: cn gas VI. Consideraciones A. Cuando se agrupan los miembros de la familia Enterobacteriaceae, las reacciones del TSI y KIA pueden variar ligeramente. Algunos no fermentadores de lactosa pueden fermentar sacarosa. B. El test se debe leer entre las 18 y 24 horas. Lecturas tempranas pueden dar falsos resultados ácido/ácido, mientras que lecturas tardías pueden dar falsos resultados alcalino/alcalino. C. Una gran producción de SH 2 enmascara la reacción de la glucosa. Sin embargo la glucosa fue fermentada aunque no se vea el cambio de color. Observar si hay producción de gas. D. En el TSI, la utilización de sacarosa puede suprimir el mecanismo enzimático que resulta en la producción de SH 2. Por esta razón, algunos organismos pueden demostrar producción de SH 2 en KIA pero no en TSI. 12

13 Agar Lisina Hierro (LIA) I. Principio La decarboxilación de la lisina a cadaverina produce una alcalinización del medio y un viraje al violeta del indicador púrpura de bromocresol. Como la reacción tiene lugar en medio ácido, es necesaria la fermentación previa de la glucosa. Los microorganismos que no decarboxilan lisina, pero fermentan la glucosa producen un viraje al amarillo en todo el medio. La formación de SH 2 produce una coloración negra debido al sulfuro de hierro producido. Las bacterias del grupo Proteus-Providencia, con excepción de Morganella morganii, desaminan la lisina a ácido α-cetocarbónico que forma compuestos pardo-rojizos en el medio de cultivo con la sal de hierro y en aerobiosis. II. Materiales El medio está disponible comercialmente. Disolver el polvo en agua destilada y dispensar en volúmenes de 3 ml en tubos con tapa a rosca. Esterilizar a 121º C por 15 minutos. Enfriar de manera de tener estría y fondo. Guardar en heladera. III. Procedimiento A. Inocular punzando el fondo y luego estriar la superficie del agar. Incubar a 37º C por 18 a 24 horas (a veces pueden ser necesarias 48 horas). IV. Resultados Los microorganismos que descarboxilan la lisina producen un viraje al violeta. Los microorganismos que no descarboxilan la lisina y fermentan glucosa producen un viraje al amarillo. La formación de SH 2 se indica por la aparición de una coloración negra. 13

14 V. Control de Calidad Bacteria Estría Punción SH 2 Salmonella sp. K K + Proteus mirabilis R A + Proteus vulgaris R A + Morganella morganii K A - Prov. rettgeri R A - Providencia spp. R A - Citrobacter spp. K A + Escherichia coli K A - Shigella spp. K A - Klebsiella spp. K A - A.ácido; K.alcalino; R: desaminación de la lisina Este medio no es un sustituto del método estándar de Moeller. VI. Consideraciones Dado que decarboxilación de la lisina ocurre únicamente a ph ácido, este medio sólo puede utilizarse para diferenciar cultivos que fermenten glucosa. Prueba Del Indol I. Principio El indol es uno de los productos del metabolismo del aminoácido triptofano. Con un medio rico en triptofano, el indol se puede detectar por su habilidad para combinarse con ciertos aldehídos para formar un compuesto coloreado. El ensayo constituye un método rápido para detectar organismos productores de indol. Como indicador de la presencia del aldehído se usa el reactivo de Erlich. Es especialmente útil en la identificación preliminar de Escherichia coli, y para diferenciar Edwardsiella (+) de Salmonella (-). 14

15 II. Materiales A. Caldo triptofano Peptona 20.0 g Cloruro de sodio 5.0 g Agua destilada 1000 ml A este caldo se le incorpora triptofano en una concentración del 1%. El medio se esteriliza a 121º C durante 15 minutos. Dejar enfriar antes de su empleo y guardar a 4-10ºC para su conservación. B. Reactivo de Erlich p-dimetilaminobenzaldehido 1.0 g alcohol etílico, 95% 95.0 ml ácido clorhidríco, concentrado 20.0 ml Se disuelve el aldehído en el alcohol (puede requerir un calentamiento suave), luego se agrega lentamente el ácido. El reactivo de color amarillo es estable por un año. Identificar el reactivo con una etiqueta y guardar refrigerado en botellas color caramelo. III. Procedimiento A. Con un ansa tomar material de una colonia aislada e inocular el caldo que contiene triptofano. B. Incubar a 37º C por 18 a 24 horas. C. Transferir 2 ml de la suspensión de caldo a un segundo tubo. D. Agregar 5 gotas del reactivo de Erlich por la pared del tubo. E. Agitar el tubo y observar un color rosado en la interfase entre el caldo y el reactivo. F. Si el ensayo es negativo, el cultivo se debe reincubar otras 24 horas. IV. Resultados Ensayo positivo: desarrollo de un color rojo en la interfase del reactivo y el caldo, segundos después de agregar el reactivo. Ensayo negativo: no hay cambio de color o hay un color amarillo en la interfase. 15

16 V. Control de Calidad Cualquiera de los reactivos debe ser controlado con cultivos positivos y negativos conocidos, antes de su empleo general. Como controles resultan convenientes cepas de fácil obtención y que su conservación en cultivos madre no ofrezca problemas. Escherichia coli +; Enterobacter aerogenes -; Klebsiella pneumoniae VI. Consideraciones A. El ph óptimo para la actividad de la triptofanasa es ligeramente alcalino ( ). La disminución del ph provoca una reducción en la producción de indol y una reacción falsamente negativa o débilmente positiva. B. Los cultivos a los cuales se les efectúa la prueba del indol deben ser incubados aeróbicamente. El descenso en la tensión de oxígeno disminuye la producción de indol. C. No debe emplearse un medio de peptona que contenga glucosa porque la elevada acidez producida por la fermentación del azúcar puede inhibir la actividad de la triptofanasa. El agregado de triptofano estimula la producción de indol, mientras que la glucosa la inhibe. Prueba de la β-galactosidasa I. Principio La fermentación de la lactosa requiere dos enzimas; mientras que la permeasa facilita la penetración de la molécula de lactosa dentro de la célula bacteriana, la β-galactosidasa hidroliza la lactosa para formar galactosa y glucosa. Las bacterias no fermentadoras de lactosa carecen de ambas enzimas; sin embargo hay bacterias que tienen β-galactosidasa pero no permeasa. El o-nitrofenil-β-d-galactósido (ONPG) es un compuesto incoloro estructuralmente similar a la lactosa. En presencia de β-galactosidasa, ONPG se rompe en galactosa y o-nitrofenil, un compuesto color amarillo. Como la familia Enterobacteriaceae se agrupa de acuerdo a su habilidad de fermentar lactosa, este test es útil en la identificación de fermentadores de lactosa. 16

17 II.Materiales A. Solución de ONPG Disolver 80.0 mg de ONPG en 15.0 ml de agua destilada a 37º C, agregar 5.0 ml del buffer fosfato, ajustar a ph 7.0 y esterilizar por filtración. La solución es estable por 6 meses. Rotular la solución y guardar refrigerada (4 a 8º C), en recipientes de color caramelo o envueltos en papel de aluminio. B. Buffer fosfato de sodio 1M (ph 7.0) Disolver 6,9 g de NaHPO 4.H 2 O en 45.0 ml de agua destilada. Agregar 3.0 ml de una solución de NaOH al 30% (w/v) y ajustar el ph a 7.0. Llevar el volumen a 50.0 ml con agua destilada y guardar a 4º C. III. Procedimiento A. A partir de un cultivo en TSI, hacer una suspensión espesa del organismo a ensayar en 0.5 ml de solución salina. El volumen no tiene mayor importancia porque es una prueba basada en la observación de un cambio de color. B. Agregar un disco o dos gotas de solución de ONPG. C. Incubar la mezcla a 37º C y examinar cambio de color hasta 24 horas. IV. Resultados Ensayo positivo: desarrollo de color amarillo. Ensayo negativo: no hay desarrollo de color. V. Control de calidad Escherichia coli + Salmonella (-) VI. Consideraciones A. Se puede partir de estrías de agar nutritivo con 1% de lactosa, cuando no se dispone de TSI. B. La solución de ONPG preparada debe ser incolora antes de su empleo. C. A veces se puede favorecer la liberación de la enzima agregando una gota de tolueno, se deja reposar unos minutos a 37º C y se agrega luego el ONPG. 17

18 Test de Utilización de Azúcares I. Principio Es un ensayo para determinar la capacidad de un microorganismo de fermentar un hidrato de carbono con producción de ácido o ácido y gas. El patrón de utilización de azúcares ayuda en la diferenciación e identificación de muchas bacterias. En este ensayo, determinados azúcares se agregan a un medio basal estéril. La producción de ácido se manifiesta por un cambio de color del indicador. La elección del medio y del indicador depende del camino metabólico del organismo y de la claridad visual del cambio de ph. II. Materiales A. Medio base Peptona 10.0 g Extracto de carne 1.0 g Cloruro de sodio 5.0 g Azul de bromotimol 10.0 ml Indicador de Andrade 5.0 ml Agua destilada 1000 ml Rehidratar los ingredientes con agua destilada, calentando suavemente si es necesario; ajustar el ph a (7.4). Autoclavar a 121º C por 15 minutos y enfriar en baño de agua a 50º C. Fraccionar el medio base en alícuotas y agregar los azúcares esterilizados por filtración en concentraciones de: 0.5% para dulcita y salicina y 1.0% para los otros azúcares. Dispensar en volúmenes de 4-5 ml en tubos con tapa a rosca, estériles. El medio se guarda en heladera y es estable por 3 meses. Para la glucosa y glicerol, el medio base se dispensa en tubos con campanita de Durham antes de autoclavar. La campanita se llenará con el medio y luego se agrega el azúcar estérilmente después de enfriar a 50º C. B. Indicador de Andrade Disolver 0.5 g de fucsina ácida en 100 ml de agua destilada, agregar 15.0 ml de NaOH 1N (4%); mezclar bien y dejar reposar a temperatura ambiente durante 24 horas, agitando 18

19 frecuentemente. El color rojo se debe transformar en un color castaño. Si no se produce una decoloración suficiente agregar 1.0 ml de NaOH 1N (4%). C. Solución de azul de bromotimol Mezclar 47.5 ml de agua destilada con 2.5 ml de NaOH 0,1N y luego agregar 0.1 g de indicador. III. Procedimiento A. Con un ansa estéril tomar material de un cultivo en medio sólido. B. Sumergir el ansa en cada tubo de hidrato de carbono. Para una batería de 8 a 10 azúcares, es suficiente un único inóculo, no hay necesidad de flamear el ansa entre tubo y tubo. La posibilidad de transportar el hidrato de carbono de tubo a tubo es infinitesimal y no afectará los resultados. Para una batería grande (15 a 20) de azúcares, puede ser necesario emplear 2 a 3 inóculos, flameando el ansa antes de tomar nueva muestra. C. Incubar a 37º C y examinar día por día por 4 a 5 días. Para algunos microorganismos puede ser necesario una incubación más prolongada (7 días), registrando los resultados día por día. D. En laboratorios de referencia las lecturas se deben prolongar hasta 30 días. IV. Resultados Ensayo positivo: viraje del indicador al rojo-rosado por acidificación del medio. Ensayo negativo: no hay cambio de color. V. Control de calidad Con distintos microorganismos que fermenten los azúcares, como por ejemplo: Escherichia coli: glucosa + Klebsiella: lactosa + Yersinia enterocolitica: sacarosa + 19

20 VI. Consideraciones A. Inocular un medio basal sin azúcar para cada microorganismo. B. La campanita de Durham se usa en el tubo con glucosa. C. Como cualquier indicio de gas, aún una burbuja pequeña, es evidencia de producción de gas, observar cuidadosamente la campanita antes de inocular. D. La campanita de Durham se agrega únicamente al medio con glucosa porque si el microorganismo produce gas con glucosa producirá gas con los otros azúcares. No obstante, si se sabe que el microorganismo en estudio no fermenta glucosa, es aconsejable agregar campanita a otros azúcares, pero hay que tener en cuenta que todas las enterobacterias son fermentadoras de glucosa por definición, entonces sólo se pone campanita al medio con glucosa. Test de Decarboxilasa-Dehidrolasa I. Principio La decarboxilación es un proceso en el cual las decarboxilasas atacan el extremo carboxilo de los aminoácidos, formando la correspondiente amina. Los tres aminoácidos que se ensayan en la identificación de enterobacterias son arginina, lisina y ornitina. La decarboxilación de lisina y ornitina da cadaverina y putrescina (diaminas), mientras que arginina da citrulina por acción de una dehidrolasa. El test se debe acompañar con un tubo control que contiene el medio base sin aminoácido. Como la decarboxilación es una reacción anaeróbica, se debe cubrir el medio con una capa de aceite mineral estéril. El proceso ocurre en dos etapas: por fermentación de la glucosa se produce una acidificación del medio (ph < 6.0), apareciendo color amarillo. La acidificación es necesaria para que ocurra la decarboxilación. Este último proceso de lugar a la formación de las aminas que elevan el ph con el consiguiente viraje del indicador al color violeta. La prueba de la lisina ayuda en la diferenciación de Edwardsiella (+), y Salmonella (+) de Citrobacter (-); de Enterobacter aerogenes (+) de Enterobacter cloacae (-) y Enterobacter agglomerans (-) 20

21 La prueba de ornitina ayuda a diferenciar Klebsiella (-), Proteus mirabilis (+) de Proteus vulgaris (-); Morganella morganii (+) de Providencia rettgeri (-); Yersinia enterocolitica (+) de Yersinia pestis y Yersinia pseutuberculosis (-). II. Materiales El medio base más comúnmente utilizado es el medio de decarboxilasa de Moeller. El medio está disponible comercialmente. Las concentraciones de aminoácidos a usar son: 1% para la forma L y 2% para la forma D, porque los microorganismos son activos sólo frente a la forma L. Fraccionar el medio base en 4 porciones de 250 ml cada una. Agregar los aminoácidos a 3 porciones del medio. El ph se debe ajustar después de agregar el aminoácido y antes de esterilizar a 6 6,2. Fraccionar en volúmenes de 3 a 4 ml en tubos con tapa a rosca y autoclavar a 121º C por 10 minutos. El sustrato es estable por 3 meses. Rotular los tubos y guardar en heladera. III. Procedimiento A. Tomar material con un ansa e inocular el tubo control y los tubos con los aminoácidos. B. Cubrir todos los tubos con una capa de vaselina estéril. C. Incubar a 37ºC D. Efectuar las lecturas día por día hasta 4 días, registrando los resultados día por día. IV. Resultados Ensayo positivo: medio turbio y púrpura a púrpura amarillento. Ensayo negativo: color amarillo Tubo control: permanece con su color original o se vuelve amarillo si el organismo es un fermentador de glucosa (se debe ver turbidez en el tubo). 21

22 V. Control de calidad Bacteria Arginina Lisina Ornitina Proteus vulgaris Morganella morganii Enterobacter cloacae Enterobacter aerogenes Salmonella Typhimurium Klebsiella spp. VI. Consideraciones A. Inocular siempre un tubo control. B. Debe haber desarrollo para que el resultado sea válido. C. Si se observan capas de color amarillo y violeta, agitar suavemente el tubo antes de interpretar la reacción. D. Comparar todos los tubos positivos con el tubo control. Un color grisáceo puede indicar reducción del indicador más que formación de productos alcalinos. Se debe agregar más indicador antes de interpretar el resultado E. Si la reacción es difícil de interpretar, comparar el tubo con un tubo sin inocular. Luego de 24 horas cualquier traza de color púrpura indica un resultado positivo. F. Si se usa el medio de Moeller, se debe incubar por lo menos 18 horas ante de interpretar los resultados. G. Si no se agrega el aceite mineral, las reacciones se deben leer sólo a las 24 horas. H. Un pequeño precipitado floculento en la ornitina no interfiere con su uso. Prueba del Acetato I. Principio El medio permite determinar la capacidad de las bacterias de utilizar acetato como única fuente de carbono y de energía. Sirve para diferenciar E. coli de Shigella. 22

23 II. Materiales El medio es igual al agar citrato de Simmons, con la diferencia que lleva 0.25 gr de acetato de sodio en lugar de citrato. Disolver en agua destilada, dispensar en volúmenes de 3 ml y autoclavar a 121º C por 15 minutos. Enfriar en forma de estría y guardar en heladera. III. Procedimiento A. Tomar material con un ansa estéril e inocular el agar por punción. B. Incubar a 37º C durante 7 días, registrando los resultados día por día. IV. Resultados Ensayo positivo: viraje del medio al azul. Ensayo negativo: no hay cambio de color. V. Control de Calidad E. coli + Shigella VI. Consideraciones No hay. Prueba del Mucato I.Principio Se utiliza para determinar la capacidad de los microorganismos de metabolizar el ácido múcico. Es útil para diferenciar Escherichia coli de Shigella. II. Materiales Bactopeptona Acido múcico Azul de bromotimol 1/500 NaOH 4N 1.0 g 1.0 g 1.8 ml 1.2 ml 23

24 Pesar el ácido múcico y disolver en 80 ml de agua destilada Colocar el recipiente sobre un agitador magnético y agregar 1.2 ml de NaOH 4N aproximadamente (para 100 ml de solución se debe agregar ml de NaOH 4N gota a gota), hasta virar el color amarillo de la solución al azul-verdoso; este color debe persistir durante 5 minutos de agitación. El agregado del álcali es para transformar el ácido múcico poco soluble en la sal soluble, mucato de sodio. A continuación agregar 1.0 g de bactopeptona, 1.8 ml de azul de bromotimol. y 15.0 ml de agua destilada. Ajustar el ph a 7.4 por medio de NaOH 0.1N o HCl 0.1N, si se ha pasado el ph. Esterilizar por filtración y fraccionar en forma estéril en volúmenes de 3 ml por tubo. Guardar en heladera. III. Procedimiento Tomar material con un ansa estéril e inocular un tubo con mucato. Incubar a 37º C durante 48 horas, realizando lecturas a las 24 horas. IV. Resultados Ensayo positivo: viraje del color al amarillo o amarillo verdoso. Ensayo negativo: no hay cambio de color el medio permanece azul verdoso. V. Control de Calidad Cepas mucato (+): E. coli, Salmonella Paratyphi B Cepas mucato (-): Proteus vulgaris, Shigella sp., Salmonella Paratyphi A VI. Consideraciones No hay. Citrato de Christensen I. Principio Este medio pone en evidencia la utilización del citrato en presencia de nitrógeno orgánico (monoclorhidrato de cisteína). Es igual al de citrato de Simmons con la única diferencia que la fuente de nitrógeno es orgánica. Es útil en la diferenciación entre Escherichia coli y Shigella. 24

25 II. Materiales El medio está disponible comercialmente. Se disuelve el polvo con agua destilada, se caliente suavemente y se fracciona en volúmenes de 3 ml en tubos con tapa a rosca. Se esteriliza a 121º C durante 15 minutos y se enfría en pico de flauta. El medio se guarda en heladera. III. Procedimiento Se repite todo exactamente igual que lo indicado para el citrato de Simmons, pero las lecturas se realizan durante 7 días, registrando los resultados día por día. IV. Resultados Ensayo positivo: color rojo rosado en el pico de flauta. Ensayo negativo: no se observa cambio de color. V. Control de Calidad Enterobacter aerogenes + Escherichia coli + Shigella VI. Consideraciones No hay SEROTIPIFICACIÓN DE SHIGELLA spp. El uso de métodos de serotipificación con propósitos de vigilancia epidemiológica se basa en el hecho que los microorganismos muestran variaciones en su composición antigénica. Los microorganismos producen una variedad de antígenos: componentes estructurales de la célula (constituyentes de la pared celular, cápsulas, flagelos, fimbrias); productos de secreción de las células (toxinas, enzimas extracelulares) o antígenos contenidos en el interior de las células. Químicamente, los antígenos usados con este propósito pueden ser proteínas, carbohidratos, o mezclas de ambos componentes. Debido a las características del género Shigella de ser inmóviles, solamente se ponen en evidencia los antígenos (denominados somáticos) compuestos por cadenas polisacarídicas del lipopolisacárido (LPS) de la membrana externa, integrante de la pared celular. 25

26 Cuando un antisuero específico se mezcla con una suspensión de un cultivo puro de Shigella se observa una reacción de aglutinación. Luego del aislamiento e identificación, se realiza la aglutinación en lámina: los anticuerpos en el suero aglutinarán con la bacteria cuando los antígenos correspondientes estén presentes. Materiales y equipamiento Ansa descartable Láminas de vidrio Reactivos Solución salina 2% Antisueros polivalentes y monovalentes de Shigella para la serotipificación de miembros del género Shigella. Se necesita el siguiente conjunto de antisueros: a) Tres antisueros de Shigella dysenteriae. - A(I -) que aglutina los serotipos indol negativos (1,3,4,5,6,9 y 10) - A(I +) que aglutina los serotipos indol positivos (2,7 y 8) - Un antisuero monovalente anti Sh. dysenteriae 1. b) Antisueros polivalentes de Shigella flexneri para aglutinar los 6 serogrupos y antisueros monovalentes para diferenciar los serotipos dentro de cada serogrupo.. c) Un antisuero de Shigella sonnei. d) Dos antisueros de Shigella boydii - C(I-) para aglutinar serotipos indol negativo (1,2,3,4,6,8,10,12 y 14). - C(I+) para aglutinar serotipos indol positivo (5,7,9,11,13 y 15. La nomenclatura de los antisueros mencionados corresponde a los nombres dados por el Instituto Nacional de Producción de Biológicos - ANLIS Carlos G. Malbrán, Argentina. 26

27 Procedimiento Comentarios Mezclar cuidadosamente, con un palillo sobre una lámina de vidrio, un ansa del cultivo en TSA y una gota de solución salina 2% (control de autoaglutinación). Mezclar cuidadosamente, con un palillo sobre una lámina de vidrio, un ansa del cultivo en TSA y una gota de antisuero polivalente. Mover la lámina suavemente por 2 minutos. La aglutinación positiva con los antisueros polivalentes continúa con la aglutinación con algunos de los antisueros monovalentes correspondientes, para determinar el serotipo del cultivo. Si no hay aglutinación el cultivo no está rugoso y se procede al segundo paso. La selección de los antisueros polivalentes se debe hacer en base a la historia de la región o país y a las pruebas bioquímicas diferenciales indicadoras de especie Una suspensión homogénea indica una reacción negativa. Una aglutinación indica una reacción positiva. Cuando un cultivo que presenta características bioquímicas de Shigella aglutina pobremente o no aglutina, se puede estar en presencia de un aislamiento capsulado. Estos cultivos se deben calentar en un baño de agua a 100ºC por 15 a 30 minutos y luego se repite el ensayo de aglutinación. Comentarios Situaciones atípicas que se pueden presentar: a) TSI alcalino/ácido sin gas, SIM (-v-), acetato de sodio negativo, ureasa negativa y aglutinación con el antisuero específico pobre o negativa: estos cultivos se deben calentar a 100º C. b) TSI alcalino/ácido con gas, SIM (---), acetato de sodio negativo, ureasa negativa: a estos cultivos se les debe probar aglutinación porque algunos serotipos de Sh. dysenteriae, Sh. flexneri y Sh. boydii fermentan glucosa con producción de gas. 27

28 FLUJOGRAMA PARA SEROTIPIFICACIÓN DE SHIGELLA spp. Cultivo con propiedades bioquímicas de Shigella Aglutinación con solución salina 2% Negativo Positivo Aglutinación con OShB Cepa rugosa Positivo Sh. flexneri (probar serotipos 1a 6) Negativo Aglutinación con OShD Positivo Sh. sonnei Negativo Aglutinación con OShC Negativo Positivo Sh. boydii (probar serotipos indol + y -) Aglutinación con OShA Negativo Positivo Sh. dysenteriae (probar serotipos indol + y -, y serotipo 1) Calentar y repetir el procedimiento 28

29 Referencias Bopp, Ch., Brenner, F., Wells, J., Strockbine N Escherichia, Salmonella, Shigella,. In Manual of Clinical Microbiology. Murray, P. (Ed.). Cap. 28, pp Ewing, W Edwards and Ewing s Identification of Enterobacteriaceae. 4 th edition. Elsevier Science Publishers. Le Minor, L., Richard, C Méthodes de Laboratoire pour l Identification des Entérobactéries. Institut Pasteur. 29

30 CAPÍTULO III - IDENTIFICACIÓN DE SHIGELLA spp. Y DETECCIÓN DE FACTORES DE VIRULENCIA POR REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) 1.- INTRODUCCIÓN La técnica de PCR permite amplificar selectivamente un segmento de ácidos nucleicos que se encuentra entre dos regiones de secuencias conocidas, produciendo un gran número de copias a partir de pequeñas cantidades de ADN o ARN. Se utilizan dos oligonucleótidos como cebadores o primers. Estos son cadenas de nucleótidos, que se unen a secuencias complementarias en el extremo 5 de cada hebra de ADN, limitando el segmento de ADN que se quiere amplificar. La reacción de amplificación utiliza una ADN polimerasa termoestable, en ciclos repetidos. Cada ciclo de PCR consiste en tres etapas: 1) Desnaturalización: se produce la separación de las hebras de ADN por calentamiento a 90-96º C. El tiempo va a depender del tamaño del fragmento y el contenido de G+C. 2) Hibridación o "annealing": los primers se unen a los sitios complementarios en el ADN simple cadena a la temperatura óptima de hibridación (Ta). Esta depende de la composición de bases, el largo y la concentración de los primers. La Ta ideal se encuentra generalmente 5ºC por debajo de la verdadera temperatura de melting (Tm) de los primers (temperatura a la cual el 50% de las cadenas primers-target se encuentra separadas en solución). 3) Polimerización: luego del annealing de los primers se produce la extensión por acción de la polimerasa. Comenzando a partir del primer la enzima lee la hebra de templado e incorpora los nucleótidos complementarios. La DNA polimerasa utilizada es termoestable por lo tanto no se desnaturaliza por la alta temperatura en el inicio de la reacción. Se utiliza normalmente Taq polimerasa aislada de una bacteria termófila Thermus aquaticus, o recombinante, cuya temperatura óptima de extensión es 72º C. La enzima tiene una vida media de 40 minutos a 95º C, de manera que puede soportar aproximadamente hasta 30 ciclos repetitivos de PCR. 30

31 Precauciones a tener en cuenta en la realización de la PCR Uno de los inconvenientes más importantes de esta técnica es la contaminación, ya sea con ADN proveniente del entorno, contaminación cruzada entre muestras de una misma reacción, o por el producto amplificado. Existen medidas de control para minimizar estos inconvenientes, para ello es necesario contar con distintas áreas dentro del laboratorio: 1. Área de preparación de la mezcla de reacción (cabina de seguridad o área limpia) 2. Área de manipulación de muestras, cultivo y extracción del ADN 3. Área de amplificación y análisis del producto de la reacción Es necesario que los reactivos se almacenen en áreas libres de contaminación. En lo posible, cada área debe tener dos entradas, circulación de aire para recontaminación de aerosoles y lámparas de luz UV. El movimiento de las muestras y del personal tiene que ser de un área libre de amplicones hacia áreas contaminadas con ellos y nunca en sentido contrario. Equipos y materiales necesarios - Micropipetas automáticas (10 µl, 100µl y 200µl) - Bloque Térmico (o Baño de María) - Microcentrífuga - Ciclador térmico - Horno microondas (o Baño de María) - Cubas electroforéticas y accesorios - Fuente de poder - Transiluminador UV - Cámara fotográfica Materiales - Ansa aguja - Guantes de látex descartables - Tubos de microcentrífuga de 1.5 ml - Tubos para reacción de PCR de 0.2 ml (o 0.5 ml según requiera el ciclador) - Tips con barrera para aerosoles 31

32 - Bloque térmico refrigerado a 20º C ± 5 º C (o recipiente con hielo) Reactivos - Agua tridestilada o calidad molecular - Primers - Taq polimerasa - Buffer de la enzima 10X (origen comercial, provisto con la Taq) - Cloruro de magnesio 25 ó 50 mm (origen comercial, provisto con la Taq) - Desoxirribonucleótidos trifosfato (dntps) - Agarosa - Buffer Tris Acetato EDTA (TAE) 1 X - Buffer de siembra 6X (xilene-cyanol o azul de bromofenol) - Marcador de peso molecular de 100pb - Bromuro de etidio - Agua destilada Primers: se reconstituyen con agua tridestilada o buffer TE (Tris 10 mm-edta 1 mm) según indicaciones del fabricante para obtener una concentración de 100 mm. Se realiza una dilución 1/10 para obtener la solución de trabajo (10 mm), la cual debe guardarse en pequeñas alícuotas. Ambas soluciones se conservan a -20ºC. Desoxirribonucleótidos trifosfato (dntps): se prepara una solución de 2.5 mm mezclando 25µl de cada uno de los nucleótidos trifosfato de concentración 100mM en un volumen final de 1 ml (diluir con agua calidad molecular). Conservar a -20º en pequeñas alícuotas. Buffer TAE 1 X: se prepara diluyendo con agua destilada a partir de un stock 50X (20 ml de stock para 1 l de buffer). Para preparar el stock 50X pesar 242 g de Tris base, agregar 500 ml de agua destilada, 57.1 ml de ácido acético glacial, 100 ml de EDTA y llevar a volumen final de 1 litro con agua destilada. Buffer de siembra 6X (xilene-cyanol o azul de bromofenol): se prepara una solución con 30 ml de glicerol y 0.25 g de xilene cianol ó azul de bromofenol, llevando a volumen final de 100 ml con agua destilada. 32

33 Bromuro de etidio: diluir con agua destilada hasta concentración final de 1 µg/ml. Se recomienda utilizar una solución de 10 mg/ml como stock. Conservar el stock y la solución de trabajo en recipientes opacos. 33

34 2.- PROCEDIMIENTO GENERAL Procedimiento a) Preparación de ADN templado A partir de un aislamiento sospechoso de Shigella, tomar 4 a 5 colonias y suspender en 150 µl de agua calidad molecular estéril. Calentar a 100ºC durante 10 minutos en bloque térmico o baño de agua. Comentarios Utilizar el ansa aguja para preparar la suspensión bacteriana. En lugar de agua, esta suspensión puede realizarse en buffer TE/Tritón X-100 1% (Tris 1 mm, EDTA 0.1 mm, Tritón X %). Preparar los extractos de ADN de las cepas de referencia que se utilizarán como controles siguiendo el mismo protocolo. Centrifugar 1 minuto a rpm para decantar los restos celulares. Transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga rotulado. Consevar los templados a -20ºC. Conservar los extractos de ADN en estantes que no contengan reactivos de PCR b) Preparación de la mezcla de reacción Retirar los reactivos para PCR excepto la Taq polimerasa del freezer. Asegurarse que se descongelen completamente antes de utilizarlos. Mantenerlos en bloque frío o recipiente con hielo. Retirar la Taq Polimerasa en el momento de realizar la mezcla de reacción, poner en hielo o bloque frío. El procedimiento debe hacerse en una cabina de seguridad, flujo laminar o área limpia de amplicones. Es aconsejable utilizar tips con filtro para aerosoloes y trabajar con un juego de pipetas de uso exclusivo para la preparación de la mezcla de reacción. Estas pipetas deben ser guardadas en la cabina o flujo laminar y evitar el contacto de las mismas con cultivos bacterianos, extractos de ADN y amplicones (productos de PCR). Calcular el volumen total de cada reactivo para la mezcla de reacción según las muestras que se van a analizar, incluyendo las cepas controles y considerando dos tubos más, uno para el control de los reactivos y uno por el error en el pipeteo. Las concentraciones de los reactivos de trabajo y los volúmenes por determinación se indican en los protocolos específicos de cada PCR. Rotular los tubos de PCR. 34

35 Realizar la mezcla de los reactivos en un tubo de 1.5ml. Agregar primero los reactivos de mayor volumen (agua, buffer) y por último la Taq polimerasa. Fraccionar en tubos de PCR de 0.2 ml. Cerrar y trasladar los tubos al área de carga de templados. c) Carga de templados y amplificación Cargar el volumen correspondiente de ADN en cada tubo. Dejar un microtubo como control de reactivos sin ningún templado. El ciclador debe tener programado los ciclos con sus respectivas temperaturas según los protocolos. Introducir los tubos e iniciar el programa correspondiente. Asegurarse que los templados estén bien descongelados en el momento de cargarlos. Utilizar una pipeta exclusiva para manipular ADN y tips con filtro para aerosoles. Es importante mantener los tubos en hielo hasta el momento de introducirlos en el ciclador. Se recomienda hacerlo una vez que el bloque del ciclador alcanzó una temperatura de 95ºC (encender el equipo unos minutos antes y mantenerlo en pausa a 95ºC). d) Preparación del gel de agarosa y electroforesis Pesar la agarosa según el porcentaje y el tamaño del gel que se desea preparar, agregar al volumen de buffer TAE 1 X correspondiente y se funde en el horno microondas a 40% de potencia. La concentración de agarosa a utilizar depende del tamaño de los fragmentos de ADN amplificados. Colocar la agarosa fundida en la bandeja o molde para el gel y ubicar el peine en la posición adecuada. Una vez solidificada la agarosa, retirar el peine y colocar el gel en la cuba electroforética que deberá contener suficiente cantidad de buffer TAE 1 X para que el gel quede cubierto. Retirar los tubos de PCR del ciclador y llevar al área de detección del producto de amplificación. Agregar a cada tubo el volumen correspondiente de buffer de siembra en una proporción 1/5 El buffer de siembra 6 X contiene glicerol (30%) para darle densidad a la muestra y azul de bromofenol o xilene cianol (0.25%) para visualizar el frente o fondo de corrida respectivamente. La selección de uno de los dos colorantes 35

36 (buffer/muestra). Cargar 10µl de cada muestra por pocillo, comenzando por las muestras, el control positivo y por último el control negativo (sin templado). Sembrar en el mismo gel un marcador de peso molecular. depende del tamaño de los fragmentos a visualizar, de manera que los mismos no se superpongan a la banda del colorante. Para los protocolos de PCR de Shigella se recomienda utilizar como marcador de PM un ladder de 100 bp. Conectar la cuba a la fuente de poder teniendo la precaución de que la línea de siembra se encuentre en el polo negativo ya que las moléculas de ADN migran hacia el polo positivo. Realizar la corrida electroforética a voltaje constante de 100 volts durante minutos. Sumergir el gel en una solución de bromuro de etidio de 1µg/ml durante 30 minutos. Enjuagar en agua destilada por min. Observar el gel con luz UV y fotografiar. Comparando la distancia recorrida de los fragmentos de las muestras con el marcador de peso molecular se puede estimar el tamaño de los fragmentos. Se recomienda no incluir bromuro de etidio dentro del gel, a fin de minimizar la contaminación de materiales y equipos con esta droga, altamente tóxica. Mantener la solución de bromuro de etidio en un recipiente con tapa, opaco, ya que es sensible a la luz. Manipular con precaución, utilizando guantes. Para decontaminar la solución de bromuro de etidio sumar al recipiente el agua utilizada para enjuagar los geles e incorporar 1 g de carbón activado por litro de solución. Dejar en agitación durante 1 hora a temperatura ambiente. Filtrar y descartar el filtrado. Sellar el filtro en una bolsa plástica y descartar con los residuos peligrosos. 36

37 3.- PROTOCOLOS ESPECÍFICOS DE PCR PARA SHIGELLA spp PCR para identificación de Shigella spp. El gen ipah (antígeno plasmídico de invasión), codifica una proteína involucrada en el proceso de invasión a las células epiteliales, cuya secuencia está presente en múltiples sitios en el plásmido de 140 MDa de Shigella spp. y a nivel cromosomal. Esta secuencia ha sido propuesta por diferentes autores para la identificación de Shigella, aunque debe considerarse que también está presente en los aislamientos de Escherichia coli enteroinvasivo (EIEC). Por lo tanto, se propone la amplificación por PCR de este gen como screening para la detección rápida de Shigella spp., que deberá ser luego confirmado por pruebas bioquímicas y de serotipificación, a fin de diferenciar a este microorganismo de EIEC. El protocolo de PCR descripto corresponde al publicado por Hartman y col., que consiste en la amplificación de un fragmento de 619 pb del gen ipah. Primers Nombre Secuencia Tamaño del fragmento ipaf GTT CCT TGA CCG CCT TTC CGA TAC CGT ipar GCC GGT CAG CCA CCC TCT GAG AGT AC 619 pb PCR ipah Reactivos Concentración Final Volumen (ul) H 2 O Buffer 10X 1X 2.5 MgCl 2 (50 mm) 1.5 mm 0.75 dntps (2.5 mm) 0.2 mm 2 Primer set 1B F (10 um) 0.5 um 1.25 Primer set 1B R (10 um) 0.5 um 1.25 Taq DNA Polimerasa (5U/ul) 1 U 0.2 DNA 2 Volumen Final 25 37