PROCEDIMIENTO DETECCION Vibrio cholerae EN AGUAS POR TECNICA DE MEMBRANA FILTRANTE. PRT Página 1 de 8

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1 PRT Página 1 de 8 1. OBJETIVO Detectar la presencia de Vibrio cholerae en aguas. 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE Aplicar este procedimiento a muestras de aguas claras que no contengan residuos, lodo o limo. 3. FUNDAMENTO El aislamiento e identificación de V. cholerae en agua se basa en su rápido crecimiento en condiciones alcalinas en presencia de oxígeno. Normalmente en matrices de agua este microorganismo se encuentra en bajos niveles por lo que se recomienda utilizar técnicas de concentración. Vibrio cholerae serogrupo O1 está asociado a los brotes epidémicos. Los serogrupos no O1 y O139 no producen toxina y se aislan normalmente de agua de estuarios y en muestras de mariscos y pescados. La selección del método depende de la naturaleza de la muestra. Muestras de origen marino y estuario que contienen numerosos otros Vibrios se recomienda diluir y utilizar la técnica del Número Más Probable incubándose la muestra a 42ºC. Para muestras de agua claras, sin lodo o sedimento y que contienen una baja densidad de Vibrios se recomienda la técnica de Filtración por Membrana. 4. REFERENCIAS 4.1 Standard Methods for Examination of Water and Wastewater, 21 Ed Bacteriological Analytical Manual Online, BAM Chapter 9 January Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Food, 4 Ed Examination of food and environmental samples.laboratory methods for the diagnosis of Vibrio cholerae. 5. TERMINOLOGÍA No Aplica

2 PRT Página 2 de 8 6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1 Equipos e insumos Equipo manifold de acero inoxidable Bomba vacío Frasco de succión Embudo graduado Tapa de embudo Abrazadera Soporte de vidrio con base Aro o anillo de silicona Manguera para conector o anillo conector Tapón de goma de 60 mm de diâmetro para frasco de succión de 2 litros Membrana filtrante 0,45 µm o 0,22 µm Incubadora entre 35º C a 37 ºC Incubadora a 42ºC (optatitivo) 6.2 Medios de cultivos y reactivos Agua peptonada Alcalina (APA) ph 8,5 ± 0, Agar TCBS Agar triptona o soya tripticasa con 1% NaCl (T 1 N 1 ) Caldo soya tripticasa (T 1 N 0 ) Agar infusión cerebro- corazón Agar glucosa- arginina tendido (AGS) Caldo triptona 0% NaCl Agar MIO Agar TSI o KIA Desoxicolato de sodio al 0,5%

3 PRT Página 3 de Antisuero polivalente O Antisuero Inaba, Ogawa y Hikojima (Optativo) Agar mcpc (Optativo) Agar sangre de cordero (Optativo) Discos de polimixina B de 50 UI (Optativo) 7. DESARROLLO 7.1 Recomendaciones generales Enviar la muestra al laboratorio lo más pronto posible, bajo condiciones de refrigeración (<10ºC) hasta 6 horas después de tomada la muestra. 7.2 Técnica de concentración: La técnica de membrana filtrante es la más apropiada para el agua clara que no contiene residuos, lodos o limo Si se utiliza agua turbia, se requerirá un agente clarificante para ayudar a remover los materiales suspendidos en filtro o prefiltro Filtrar a través de una membrana (Millipore) de poro 0,22 a 0,45 µm de diámetro, 100 ml a 300 ml de muestra (o una cantidad mayor si es posible) Una vez realizada la filtración, colocar el filtro en un frasco con 100 ml de APA (agua peptonada alcalina) Incubar entre 35 ºC a 37ºC por 6 a 8 horas Una vez finalizada la incubación de 6-8 h, traspasar el cultivo con asa de 3mm a una placa de agar TCBS para obtener colonias aisladas Incubar la placa de TCBS entre 35 ºC a 37ºC por 18 a 24 horas Si el laboratorio cuenta con recursos necesarios, un duplicado de la muestra puede ser preparado para ser incubado a 42ºC Alternativamente, el filtro puede ser ubicado directamente sobre la superficie de un agar no selectivo en placa (ejemplo T 1 N 1, agar infusión cerebro corazón). Incubar por 3 horas entre 35º C a 37ºC, luego transferir el filtro a una placa de agar TCBS Incubar la placa de TCBS por 18 a 24 horas entre 35º C a 37º C.

4 PRT Página 4 de Si se requiere cultivar muestras de origen marino o de estuario, pequeños volúmenes deben ser filtradas o los filtros deben ser puestos en un gran volumen de APA (agua peptonada alcalina) para diluir las muestras adecuadamente. 7.3 Aislamiento de Vibrio cholerae Examinar las placas de TCBS después de su período de incubación Las colonias de V. cholerae son lisas, amarillas producto de la fermentación de la sacarosa, ligeramente aplanadas en el centro y translúcida en la periferia También otros miembros de la familia Vibrionaceae pueden fermentar la sacarosa: V. fluvialis; V. furnissi; V. alginolyticus; V. wetschnikovii; V. cincinnatiensis y V. carchariae Registrar las características de las colonias observadas. 7.4 Caracterización bioquímica Después del aislamiento en agar TCBS, seleccionar por lo menos 3 colonias presuntivas para realizar las pruebas bioquímicas y traspasar a un medio no selectivo como agar soya tripticasa conteniendo un 1% de NaCl (T 1 N 1 ) Incubar los tubos sembrados de agar soya tripticasa a 35ºC por 24 horas A partir del agar soya tripticasa con 1% NaCl o T 1 N 1 realizar prueba de: Test de Oxidasa: utilizar una asa de platino o bien un asa desechable con cultivo puro a partir del agar T 1 N 1 y depositar sobre un papel filtro saturado del reactivo de oxidasa. El desarrollo de un color púrpura oscuro que se forma dentro de los 10 segundos indica un resultado positivo. V. cholerae es oxidasa positiva Realizar prueba tolerancia de sal sembrando en un tubo de caldo soya tripticasa o triptona al 0% NaCl (T 1 N 0 ). Incubar a 35ºC por 24 horas. V. cholerae y V. mimicus presentan desarrollo sin NaCl. (Optativo) Sembrar en tubo de agar AGS en tendido y en profundidad. Incubar con tapa suelta por 24 horas a 35ºC. V cholerae y V. mimicus en tendido resultan alcalino (púrpura) y en profundidad amarillo (ácido), como la arginina no es hidrolizada no se produce gas y tampoco H 2 S. (Optativo) Sembrar en agar MIO. Incubar por 24 horas a 35ºC. V. cholerae es móvil, indol y ornitina positiva.

5 PRT Página 5 de Sembrar en agar TSI o KIA en tendido y profundidad para la utilización de carbohidratos. Incubar a 35ºC por 24 horas. V. cholerae en tendido puede ser alcalino (K) o ácido (A); sacarosa positiva, lactosa negativo, el fondo del tubo es ácido (A); glucosa positivo, gas negativo y H 2 S negativo Sembrar en caldo triptona al 0% NaCl. Incubar a 35ºC por 24 horas. V. cholerae presenta desarrollo y resulta positivo al indol al agregar gotas del reactivo de Kovacs Realizar string test a las cepas que resulten positivas para caldo triptona al 0% NaCl y movilidad, indol y ornitina positivo y en agar TSI lectura: K o A/A-,-. Sobre un portaobjeto con una gota de desoxicolato de sodio al 0,5% poner en contacto el asa con cultivo. En 60 segundos se forma una masa mucoide que forma hilos cuando se separa del portaobjetos. V. cholerae resulta positivo al string test. 7.5 Caracterización serológica Realizar la prueba serólogica con el antisuero polivalente O1. Sobre un portaobjeto añadir un agota del antisuero polivalente y con un asa con cultivo a partir del agar T 1 N 1 emulsionar. Una aglutinación positiva corresponde a V. cholerae O1. Una aglutinación negativa corresponde a V. cholerae no O Realizar en paralelo control de la aglutinación de la cepa en estudio con suero fisiológico en un portaojeto para observar si se trata de una cepa autoaglutinante La determinación de los serotipos (Optativo) a la cepa resultante V. cholerae O1, se realiza con la aglutinación de los antisueros Inaba, Ogawa y Hikojima. 7.6 Diferenciación del biotipo El Tor y el Clásico (Optativo) Realizar prueba para β- hemólisis en agar sangre de cordero. Sembrar en cuña de agar sangre un cultivo puro de la cepa V. cholerae O1. Incubar a 35ºC por 18 a 24 horas. La beta hemólisis se observa por una clara zona alrededor de la siembra. El biotipo El Tor es β - hemolítico Realizar estudio de sensibilidad a la polimixina. Sembrar profusamente en una placa de agar T 1 N 1 bien seca y ubicar discos de 50 unidades de polimixina B sobre la superficie. Invertir la placa e incubar a 35ºC por 24 horas. El biotipo Clásico es sensible a la polimixina-b con halos de inhibición > 12 mm; El Tor es resistente. Si un cultivo en estudio crece sobre agar mcpc, el cual contiene polimixina B este cultivo es considerado como biotipo El Tor.

6 PRT Página 6 de Confirmación Enviar al Centro de Referencia las cepas que resulten bioquímicamente compatibles con V. cholerae y aglutinen con el antisuero polivalente. 8. REGISTROS Registro Detección de Vibrio cholerae en aguas por técnica de membrana filtrante 9. ANEXOS Anexo Nº1: Imagen Sistema Filtración por Membrana. Anexo Nº 2: Recomendaciones de Bioseguridad y Buenas Prácticas de Laboratorio.

7 PRT Página 7 de 8 ANEXO Nº 1 Imagen Sistema Filtración por Membrana

8 PRT Página 8 de 8 Anexo Nº 2 Recomendaciones de Bioseguridad y Buenas Prácticas de Laboratorio 1. Utilizar equipo de protección personal: delantal bioseguridad, pechera, guantes, mascarilla, cubrecalzado, lentes de protección. 2. Disponer de un programa definido para la descontaminación y eliminación de muestras y medios de cultivo. 3. Descontaminar todos los desechos líquidos o sólidos contaminados antes de su eliminación. 4. Disponer de cepas controles para la verificación de las pruebas de desempeño de los medios de cultivo. 5. Utilizar en la preparación de medios de cultivo equipo materiales, reactivos que cumplan con los requisitos de calidad. 6. Practicar cuidadosamente todos los procedimientos a fin de evitar la formación de aerosoles. 7. Registrar los resultados de las pruebas de control. 8. Limpiar y descontaminar los mesones de trabajo antes y después del trabajo. 9. Lavar las manos después de los procedimientos de siembra y antes de abandonar el laboratorio. 10. Usar recipientes adecuados para depositar el material contaminado. 11. Notificar de inmediato al jefe del laboratorio cualquier derrame peligroso, accidente o exposición del material contaminado.