TRANSFERENCIA GÉNICA EN ANIMALES

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1 TRANSFERENCIA GÉNICA EN ANIMALES Por: Patricia Narbón Fernández Trabajo Final Experto Universitario de Biotecnología Aplicada a los Alimentos UNED Profesoras Guía: Dra. Estrella Cortés Rubio. Profesora Titular de Universidad. Área: Bioquímica y Biología Molecular. Dra. Gloria Morcillo Ortega. Profesora Titular de Universidad. Área: Biología Celular. Junio, 14 del

2 INDICE 1. Introducción, pag.3 2. Transferencia de ADN a células animales, pag.5 3. Vectores de transferencia génica, pag.5 4. Transfección de células somáticas animales, pag.8 5. Transgénesis en animales, pag.9 6. Transferencia génica por microinyección, pag Transferencia génica con trasposones, pag Transferencia génica con vectores virales, pag Transferencia génica mediada por semen, pag Transplante de núcleos y clones, pag Clonación, pag Métodos de clonación, pag Clonación de la oveja Dolly, pag Transferencia nuclear de células trasfectadas diploides fetales, pag Transferencia nuclear Honolulu, pag Aplicaciones de la clonación mediante la técnica de transferencia nuclear, pag Generación de animales knockout, pag Generación de ratones knockout, pag Condicional knockout, pag Aplicaciones de las técnicas knockout, pag Modelos de animales transgénicos, pag Animales transgénicos como fábricas de proteínas: Vaca transgéncia productora de hormona del crecimiento, pag Animales transgénicos resistentes a mastitis: Vaca resistente a la infección intramamaria, pag Bibliografía, pag.52 2

3 Introducción Después de algunos problemas iniciales, el desarrollo y comercialización de cultivos modificados genéticamente registró un crecimiento considerable, pero los productos derivados de animales de granja modificados genéticamente no han llegado a los principales sistemas de producción de alimentos. Aunque se han insertado experimentalmente más de 50 transgenes diferentes en animales de granja, estas iniciativas requieren todavía unos conocimientos técnicos considerables y no son tan habituales como en el caso de las plantas. Las investigaciones iniciales en la obtención de animales transgénicos de granja han ido acompañadas también de perturbaciones manifiestas en la fisiología, incluidas deficiencias en el proceso reproductivo. Estas experiencias han suscitado problemas éticos en cuanto al bienestar de los animales y han reducido ulteriormente el interés de los consumidores. Hasta el momento, la perspectiva de alimentos obtenidos de animales transgénicos de granja no ha sido bien recibida por los consumidores. Las encuestas indican sistemáticamente que el público acepta de mejor grado las plantas transgénicas que los animales transgénicos. La experimentación con animales y su alteración es menos aceptable y tiene repercusiones más amplias. Diversas culturas y religiones limitan o prohíben el consumo de ciertos alimentos derivados de animales. Sin embargo, la ingestión o inyección de ciertos productos farmacéuticos derivados de animales transgénicos parece más aceptable para el público. Se han llevado a cabo investigaciones con resultados muy satisfactorios sobre peces modificados genéticamente, pero ninguno de estos peces es objeto de comercio. En la mayoría de los casos se trata de especies utilizadas en acuicultura en las que se han insertado los genes que regulan la producción de hormonas del crecimiento con objeto de aumentar la tasa de crecimiento y el rendimiento de los peces cultivados. Se han planteado cuestiones éticas relativas al bienestar y a los efectos ambientales de estos peces modificados genéticamente, pero también se ha sostenido que los peces modificados genéticamente comparten muchos atributos de especies y genotipos de peces exóticos seleccionados por medios convencionales, y que ambos casos constituyen medios comprobados y aceptados de aumentar la producción en el entorno acuático. Dado que uno de los principales problemas para la obtención de animales manipulados genéticamente viables y seguros radica en las técnicas de transformación génica empleadas, este trabajo se ha centrado en el estudio de las técnicas disponibles y su aplicación. Actualmente siguen presentándose problemas en los animales manipulados genéticamente, algunos de los cuales se citan a continuación: - Integración múltiple del transgen - Lugar de integración indeterminado - Mutilación y falta de expresión 3

4 - Mosaicismo (germinal y somático) - Expresión específica/ectópica - Expresión variable - Expresión variable dentro de líneas (variegación) - Elevada mortalidad durante el desarrollo embrional inicial y tasas de éxito de sólo el 1-3 por ciento. - De los animales transgénicos nacidos, es posible que los genes insertados no funcionen como se esperaba, lo que frecuentemente da lugar a anormalidades anatómicas, fisiológicas y de comportamiento. En la medida en que se vayan perfeccionando las técnicas de transferencia génica en animales, junto con otras técnicas del proceso igualmente importantes (mejoramiento de los constructos), se podrán obtener mayores y más seguras aplicaciones en las diferentes áreas en las que se ha venido trabajando los últimos años: - Mejora de caracteres productivos - Resistencia a enfermedades - Modelos animales de enfermedades humanas (ratones knockout) - Animales transgénicos como biorreactores para la síntesis de las proteínas de alto valor (proteínas terapéuticas): granjas farmacéuticas o granjas moleculares - Donación de órganos a partir de animales transgénicos: Xenotransplantes - Producción de alimentos más saludables a partir de animales transgénicos en los que se varía la composición nutricional de los animales y/o los productos que generan - Modificación genética de insectos vectores de enfermedades - Producción animal más limpia para el medioambiente: que puedan digerir ciertas formas de fósforo vegetal (fitatos) que les permite crecer más con raciones de menor calidad y con una eliminación menor de fósforo en sus excretas (lo que representa menor contaminación hídrica). - Controladores biológicos modificados: consiste en la mejora mediante ingeniería genética de invertebrados depredadores o parasitoides que han sido tradicionalmente usados como agentes de control biológico. - Otras aplicaciones: Corresponden a propósitos ornamentales o estéticos. Se han incorporado proteínas fluorescentes de medusa en peces de acuario o incluso en conejos, para hacerlos más atractivos o generar hechos artísticos ( arte transgénico ). 4

5 Transferencia de ADN a células animales Las células animales pueden incorporar ADN por distintos métodos como microinyección directa, electroporación, encapsulación de ADN en membranas artificiales (liposomas) seguido de su fusión con membranas celulares, vectores basados en virus, YAC o mediada por células germinales. En general, el ADN introducido por cualquiera de estos métodos se integra en el genoma del hospedador. La transferencia de genes depende de la introducción de secuencias de ADN en el núcleo de una célula somática, germinal, célula huevo fecundada o una célula madre embrionaria, seguido de la integración del ADN en un sitio del cromosoma. Vectores de transferencia génica Un vector de transferencia génica es el vehículo empleado para introducir ADN en una célula u organismo. Existen dos grandes grupos de vectores, virales y no virales. Los primeros incluyen todos aquellos que se han obtenido a partir de un virus tratando de eliminar sus características patológicas y de adaptarlos a su nueva función como transportadores de material genético heterólogo. Pretenden aprovechar la ventaja que aportan los virus como vectores naturales que han sufrido procesos de evolución complejos a lo largo de millones de años para optimizar la función de introductores de material genético en las células que invaden. Los vectores no virales siguen una estrategia de síntesis en lugar de modificación. Parten de estructuras sencillas conocidas e intentan reconstruir desde la base un sistema completamente artificial que posibilite el transporte efectivo de genes en el interior de la célula. Existen también vectores biológicos no virales (bacterianos) como portadores de genes terapéuticos, pero son los menos estudiados. Fig1. Tipo de vectores y proceso esquematizado de obtención. 5

6 Las características de un vector ideal para poder adaptarlo luego a situaciones concretas serían las siguientes: - Que sea reproducible - Que sea estable - Que permita la inserción de material genético sin restricción de tamaño - Que alcance concentraciones elevadas (> 10 8 partículas/ml) - Que permita la transducción tanto de células en división como quiescentes - Que posibilite la integración específica de gen - Que reconozca y actúe sobre células específicas - Que la expresión del gen pueda ser regulada - Que carezca de elementos que induzcan una respuesta inmune - Que pueda ser caracterizado completamente - Que sea inocuo y minimice sus posibles efectos secundarios - Que sea fácil de producir y almacenar a coste razonable El vector es una parte importante en el sistema de transferencia génica, pero el sistema consta de dos componentes: el vector (vehículo de transporte) y el cargo (material a ser transportado). El cargo a su vez se subdivide en: el efector (gen a introducir) y el soporte (los elementos que condicionan su expresión). El cargo suele ser una estructura de tipo plasmídico (ADN bicatenario y circular), aunque puede ser de diversa naturaleza y complejidad, desde un simple oligonucleótido hasta un cromosoma artificial, que permite incorporar una cantidad elevada de material genético con capacidad de perpetuación en el tiempo. El efector que se utilice dependerá del efecto que se persiga. Si se pretende compensar, sustituir o reparar un gen dañado, el efector debe ser una copia del gen intacto o un elemento que permita su reparación. Si se pretende inducir un efecto biológico concreto (eliminar específicamente un tipo de células, bloquear la expresión de un virus, inducir una respuesta inmune ), se pueden introducir genes naturales que potencien dicho efecto o genes que originen nuevas actividades que den lugar al efecto perseguido. El soporte es la base para el control de la expresión del transgen e incluye distintos tipos de elementos reguladores. El primero y fundamental es el promotor, la zona de ADN anterior al gen donde se recluta la maquinaria de transcripción. La naturaleza del promotor condiciona el tipo de regulación de la expresión génica. Se pueden utilizar promotores constitutivamente activos o promotores específicos, que sólo son activos en un tipo celular concreto. De la misma manera se pueden emplear promotores inducibles, que requieren la presencia de un elemento concreto para ejercer su función. Éste puede ser un agente de adicción exógena (control externo) o un agente determinado por características fisiológicas especiales (como por ejemplo promotores activos ante situaciones de hipoxia). Otros elementos del soporte que pueden ser importantes dependiendo de la funcionalidad perseguida son los potenciadotes y represores de los promotores, secuencias de aislamiento (insulators) que impiden las influencias de secuencias reguladoras próximas, secuencias de 6

7 integración (para permitir la inclusión del material exógeno dentro del genoma de la célula hospedadora), secuencias de recombinación homóloga (para permitir el intercambio de material genético con el genoma hospedador con una región específica), secuencias de empaquetamiento (para introducir el material genético en el interior de un vector viral), secuencias inmunoestimulantes (secuencias bacterianas del tipo islas CpG no metiladas que sirven como coadyuvantes en las vacunas de ADN) Los vectores son los encargados de asegurar la estabilidad del material genético transportado y de vencer todas las barreras biológicas hasta alcanzar su destino final, el núcleo de la célula diana, donde tiene lugar la regulación génica. También de ellos va a depender la vía de administración a utilizar. En los casos de transferencia génica en individuos postnatales, el vector ha de solventar barreras en su camino hacia su destino funcional. Entre estas barreras se incluyen: la estabilidad en el medio extracelular (para evitar su degradación y eliminación), el reconocimiento de la célula diana (generalmente mediante un receptor específico), su unión a la membrana, su internalización en la célula (normalmente utilizando un sistema de transporte vesicular como la endocitosis), el escape de los sistemas de degradación intracelular (lisosomas) y su entrada final al núcleo, donde debe desmantelarse para permitir que el material genético que transporta gane acceso a su ubicación final y a la maquinaria de transcripción. Fig2. Puntos clave para regular la eficacia de un vector de transferencia génica que se introduce en el individuo 7

8 Transfección de células somáticas animales La transfección de células somáticas es útil para el cuidado medico y veterinario de enfermedades genéticas, y para otros propósitos terapéuticos o de mejoramiento de animales. La transferencia de genes a células somáticas puede hacerse en el laboratorio (ex vivo) o directamente a las células en el cuerpo (in vivo). En la forma ex vivo, se extraen células del individuo para ser transformadas (proceso por el cual se transfiere exitosamente un gen a una célula) con el vector que contiene la versión normal del gen. Este método tiene la ventaja de que la transferencia de genes es más eficiente y permite la propagación de las células transformadas para generar grandes cantidades. La desventaja es que sólo es utilizable para el individuo específico del cual se extrajeron esas células, además de ser costoso por la gran manipulación y control de calidad requeridos. En el método in vivo se administra el vector (que contiene el gen normal) a los individuos. Este método puede utilizarse con muchos individuos, lo que disminuye su costo y la infraestructura necesaria, pero resulta complicado de controlar y la eficiencia es mucho menor. Fig. 1. Sistemas para transferir genes a células somáticas en individuos Los vectores son los vehículos microscópicos que se utilizan para transferir genes a las células, a continuación se exponen sus características y su relevancia. Hay tres principales tipos de vectores: virales, no virales y físicos. Virales: El método más eficaz para llevar genes sanos a las células dañadas es por medio de virus que han sido adaptados como vectores. Los virus son útiles ya que pueden penetrar naturalmente las células, insertando en ellas su material genético. 8

9 Sin embargo, antes de poder usarlos como vectores deben modificarse para eliminar los genes virales que les permiten replicarse y causar enfermedad. A estos virus se les llama virus modificados o atenuados, y entre los más utilizados como vectores se encuentran los retrovirus, adenovirus y virus adeno-asociados. También se han desarrollado poxvirus (especialmente el virus de la vaccinia) para vacunas y terapias génicas. Actualmente, los vectores virales son los más eficientes para transformar células, aunque no carecen de desventajas: son de manufactura costosa, hay límites a la cantidad de genes (es decir, la longitud de los fragmentos de ADN) que pueden ser insertados en los vectores y que pueden llegar a desencadenar una respuesta inmune (inmunogenicidad). No virales: Básicamente se trata de inyectar el fragmento de ADN que contiene el gen de interés directamente a las células o empacado dentro de otras moléculas como son los liposomas (pequeñas vesículas de grasa que pueden transportar sustancias al interior de las células). Los vectores no virales son menos eficientes para transformar células, pero no tienen limites para el tamaño del inserto (el tamaño del ADN que se va a inyectar), son menos inmunogénicos y más fáciles de elaborar. Físicos: Involucran sobre todo inyectores sin aguja y electroporación. Los inyectores sin aguja utilizan alta presión para insertar el ADN en células de la piel o en células en cultivo, mientras que la electroporación utiliza pulsos eléctricos que abren temporalmente agujeros en las membranas de las células, permitiendo insertar el ADN. Los métodos físicos aún son ineficientes en la transformación y tienen un rango limitado de aplicación. Los riesgos de la terapia génica continúan siendo difíciles de cuantificar. Por ello cada ensayo debe comenzar lentamente, con un control muy cuidadoso de la dosis de vectores que contengan los genes que se pretende insertar. Estos riesgos tomaron una nueva dimensión en el otoño de 1999, cuando un joven de 18 años murió cuatro días después de haber iniciado un tratamiento con terapia génica. Los mismos riesgos podemos asumir para el resto de especies animales manipuladas genéticamente. Transgénesis La transgénesis se puede definir como la introducción de ADN extraño en un genoma, de modo que se mantenga estable de forma hereditaria y afecte a todas las células en los organismos multicelulares. Generalmente, en animales, el ADN extraño, llamado transgen, se introduce en zigotos, y los embriones que hayan integrado el ADN extraño en su genoma, previamente a la primera división, producirán un organismo transgénico; de modo que el transgén pasará a las siguientes generaciones a través de la línea germinal (gametos). Entre las aplicaciones de los animales transgénicos se pueden destacar: La posibilidad de estudiar a nivel molecular el desarrollo embrionario y su regulación. Manipular de forma específica la expresión génica in vivo. Estudiar la función de genes específicos. 9

10 Poder utilizar a mamíferos como biorreactores para la producción de proteínas humanas. La corrección de errores innatos de metabolismo mediante terapia génica. La transgénesis se puede efectuar siguiendo dos estrategias comunes, microinyección de zigotos y la manipulación de células embrionarias, las cuales se describen brevemente a continuación: 1. Transgénesis por microinyección de zigotos Desde que en 1982 se obtuviera un ratón transgénico, la producción de animales transgénicas es cada vez más cotidiana, existiendo ya animales transgénicos de las siguientes especies: ratón, rata, conejo, cerdo, vaca, cabra y oveja. La técnica se realiza, fundamentalmente por microinyección y se realiza de la siguiente forma: o En la primera fase, se aíslan un número grande de óvulos fertilizados. Se consigue sometiendo a las hembras a un tratamiento hormonal para provocar una superovulación. La fertilización puede hacerse in vitro o in vivo. o En la segunda fase, los zigotos obtenidos se manipulan uno a uno y con una micropipeta a modo de aguja, se introduce una solución que contiene ADN. o En la tercera fase, estos óvulos son reimplantados en hembras que actuarán como nodrizas permitiendo la gestación hasta término. Por último, tras el destete de los recién nacidos, éstos se chequean, para ver si ha ocurrido la incorporación del transgén. 2. Transgénesis por manipulación de células embrionarias. Una estrategia más poderosa para la transgénesis implica la introducción de ADN extraño en células embrionarias totipotentes (células ES) o células embrionarias madres (células EM). Estas células se toman del interior de la blástula en desarrollo y se pasan a un medio donde se tratan con distintos productos con lo que se conseguirá que las células no se diferencien, y se mantiene su estado embrionario. El ADN extraño se introduce en las células ES mediante diversas técnicas, posteriormente las células transfectadas son reintroducidas en una blástula y ésta reimplantada en una hembra. Con esta técnica los neonatos son quimeras; pero mediante el cruce de éstas se consiguen animales transgénicos con aquellas quimeras que hayan incorporado el transgén en su línea germinal 10

11 El ganado transgénico que se emplea para producir proteínas terapéuticas, debe contener en el ADN extraño de sus células, además del gen codificante de la proteína, una secuencia o promotor que haga que se exprese dicho gen en unas determinadas células solamente. Por ejemplo, si se quiere que la proteína se produzca junto con la leche, el transgén se fusiona con una secuencia reguladora de una proteína de la leche, con lo que la proteína sólo se formará en las células de glándulas mamarias. Esto es lo que se hizo con la oveja Tracy en 1992, la primera oveja que produjo una proteína humana, la alfa-antitripsina bajo la dirección del promotor ovino de la beta-lactoglobulina. Dicha proteína se produce en una cantidad de 35 g/l, la cual se emplea para curar el edema pulmonar. Lo mismo se ha hecho para la famosa cerda Genie, que fabrica en su leche la proteína C humana que controla la coagulación sanguínea y es necesaria para los hemofílicos. Además de estas técnicas existen otras alternativas que se describirán más adelante, y algunas de las cuales son una combinación. Transferencia génica por microinyección Microinyección pronuclear: pequeñas cantidades del ADN de interés (transgen) eran inyectadas en el pronúcleo de un embrión al estado de dos células. Aunque ampliamente aceptada y utilizada en forma rutinaria en muchos laboratorios, ha habido muy poco progreso para mejorar su eficiencia, la que se mantiene en el orden 0.1-5%, dependiendo de la especie considerada. En la década del 80 ocurrió un importante avance en la tecnología de animales transgénicos que marcó el curso de la investigación en este campo por al menos dos décadas. Gordon y colaboradores describieron una técnica donde el ADN desnudo fue inyectado en el pronúcleo de un ovocito de ratón recientemente fertilizado, el que posteriormente se transfirió a hembras receptoras sincronizadas. Este experimento demostró que era posible usar un plásmido recombinante como vector para transferir genes foráneos directamente hacia el embrión. El ADN inyectado de esta forma se integró en el genoma y pudo ser heredado por la descendencia de los animales transgénicos fundadores. La inyección de embriones al estado de una célula fue clave para obtener una integración temprana del transgen, permitiendo al ADN foráneo contribuir en el genoma de todas las células somáticas y la línea germinal. Generación de los ratones transgénicos: En una primera fase se aíslan un número grande de ovocitos fertilizados, los que se consiguen sometiendo a la hembras a un tratamiento hormonal para provocar una mayor ovulación. En una segunda fase los ovocitos recién fertilizados se manipulan uno a uno, y con una micropipeta a modo de aguja se introduce una solución que contiene ADN. El ADN purificado es inyectado directamente en el pronucleo 11

12 masculino de un zigoto, utilizando para ello un micromanipulador acoplado a una pipeta con presión negativa y otro manipulador a acoplado a una aguja de inyección Fig3. Instrumental para microinyección pronuclear Fig.4 Fig.5 Fig. 4 y 5. La figura de la izquierda (4) representa un dibujo esquemático de cómo se introduce el ADN por microinyección en el pronucleo del zigoto. A la derecha (5) hay una foto tomada en tiempo real es la que se observa lo descrito anteriormente. En la tercera fase estos óvulos son reimplantados en hembras que actuarán como nodrizas permitiendo el término de la gestación. Se implantan de zigotos en el oviducto de una hembra semipreñada (recientemente apareada con un macho vasectomizado. Alrededor de 19 días más tarde se nacen de 5-8 crías. Los animales transgénicos se identifican mediante análisis de PCR a partir de ADN extraído de las colas de los ratones de tres semanas de vida. Los transgénicos son verificados posteriormente por Southernblots. 12

13 Fig.6. Implantación de óvulos transfectados e Identificación de ratones transgénicos nacidos mediante la técnica de PCR Los ratones positivos para la prueba PCR son cruzados con animales controles para identificar a los fundadores, es decir, aquellos que tienen el transgen insertado en su línea germinal. La eficiencia de transgénesis con este método es menor al 5%. La integración del transgen en el genoma del ratón es al azar y los niveles de expresión son variables. En ciertos casos la integración del transgen también ocurrió después de la primera división del zigoto, lo que resultó en animales fundadores mosaicos. Estos animales mosaicos aún transmiten el transgen a la descendencia pero lo hacen a una frecuencia menor al 50%. Desgraciadamente, la eficiencia para generar animales transgénicos utilizando esta tecnología es baja, particularmente en animales de granja. La eficiencia de la inyección pronuclear está controlada por una serie de factores como quedara demostrado por los trabajos de Brinster y colaboradores en 1985, quienes entregaron valiosa información sobre la integración de los transgenes y permitieron establecer que la concentración y la forma (circular o linear) del ADN eran los factores más críticos para una eficiente integración. No se encontraron diferencias significativas cuando el pronúcleo femenino o masculino era utilizado para la inyección, aunque este último es preferido por ser más grande. Por otro lado, el cruzamiento de ratones híbridos (por ejemplo C57BL x SJL) fue más exitoso en la producción de animales transgénicos que las líneas consanguíneas (C57Bl x C57Bl). El descubrimiento de la inyección de pronúcleos como un nuevo método para modificar el genoma de los animales revolucionó la forma en que los investigadores pudieron analizar la expresión de los transgenes y pavimentó el camino para la generación de los primeros animales transgénicos de granja en Desde entonces, la tecnología ha sido implementada con éxito en la mayoría de los animales domésticos como en conejos, por Buhler y colaboradores en 1990, ovejas, por Wright y colaboradores en 1991, cabras por Ebert y colaboradores en 1991, vacas por Krimpenfort y colaboradores en 1991 y cerdos por Wall y colaboradores en Sin embargo, además de los problemas asociados con la integración de los transgenes hay ineficiencias asociadas con la recolección, cultivo de los huevos fertilizados y transferencia 13

14 de los embriones hacia las hembras receptoras. Otros factores como el largo período de gestación y el bajo número de animales por generación, sumado al costo extra de cuidado de los animales, han contribuido a la lenta adopción de estas tecnologías, especialmente en los países menos desarrollados. Los primeros estudios realizados en animales de granja se enfocaron hacia el uso de genes que controlan la productividad del animal, por ejemplo genes de la hormona del crecimiento para incrementar la tasa de crecimiento y la eficiencia de conversión por Pursel y Rexroad en Estos estudios mostraron los problemas de la inyección pronuclear con relación al control de los niveles de expresión del transgen. Se encontró una gran variación de expresión en las líneas de animales transgénicos generados, siendo ésta en general muy pobre, especialmente si no todos los elementos reguladores del transgen eran incluidos en la construcción genética (plásmido). Esto llevó a que muchos investigadores dedicaran mayores esfuerzos a entender la forma en que los transgenes se insertan en el genoma del animal y los factores que afectan la expresión de los mismos. Esto explica por qué la mayoría de los experimentos dirigidos a alterar la composición de la leche han sido realizados principalmente en el ratón, aunque existen algunas notables excepciones tales como la secreción de proteínas de valor terapéutico como el factor IX de la coagulación en la leche de ovejas por Wright y colaboradores en 1991, el activador de plasminógeno de tejido en la leche de cabras por Ebert y colaboradores en 1991 y la lisozima humana en la leche de bovinos por Krimpenfort y colaboradores en Sin embargo, dada la baja eficiencia de esta tecnología, sumado a los costos involucrados, es que ha habido una búsqueda constante por nuevas alternativas. En términos generales, a continuación se presenta una gráfica con los niveles de eficiencia de la técnica para diferentes especies de animales: Fig.7. Niveles de eficiencia de la microinyección pronuclear para diferentes especies de animales. 14

15 - Microinyección de ADN en células embrionarias: manipulación de las células madre embrionarias de ratón (ES cells) apareció como una potencial solución para muchos de los problemas encontrados con la técnica de microinyección pronuclear. Transformación genética mediante recombinación homóloga en células madre embrionarias (ES cells). El aislamiento de células madre embrionarias de ratón, en 1989 por Thompson y colaboradores, abrió nuevas posibilidades para estudiar la función génica en animales transgénicos. Las células madre embrionarias se obtienen desde el macizo celular interno de blastocistos y se pueden mantener en cultivos sin perder su estado indiferenciado gracias a la presencia en el medio de cultivo de factores inhibitorios de la diferenciación. Estas células pueden ser manipuladas in vitro vía recombinación homóloga, permitiendo así alterar la función de genes endógenos. Las células así modificadas pueden ser entonces reintroducidas en blastocistos receptores contribuyendo eficientemente a la formación de todos los tejidos en un animal quimérico incluyendo la línea germinal. Esta tecnología posibilita modificaciones genéticas muy finas en el genoma del animal, tal como la introducción de copias únicas de un gen. La incorporación de una copia única de un gen en un sitio predeterminado del cromosoma tiene las ventajas de permitir controlar el número de copias del transgen y se puede controlar la inserción de este en un sitio favorable (transcripcionalmente activo) para su expresión tejido-específica. Utilizando esta tecnología ha sido posible anular la función de genes endógenos del ratón mediante la integración de un marcador de selección, lo que ha permitido la generación de varios cientos de ratones llamados knock out que han servido como modelos de enfermedades genéticas en humanos y como modelos para analizar la función de genes endógenos (Melton, 1994; Shastry, 1998; Kolb y col., 1999; Wallace y col., 2000). Fig.8. Representación de las técnicas de microinyección pronuclear y microinyección de células embrionarias 15

16 Transferencia génica con transposones Los transposones se definen como elementos transponibles que contienen genes adicionales a parte de los necesarios para la transposición y están dentro de secuencias repetidas. Dentro de esta categoría se encuentran los trasposones compuestos de procariotas, familia Tn3, elemento P de Drosophila, secuencias Alu de mamíferos, retrotrasposones CLASE I: MEDIANTE DNA I.I PROCARIOTAS Elementos IS (Is1, IS2, IS3, IS30, IS200, etc) Transposones compuestos (Tn5, Tn10, etc) Transposones de la familia Tn3 Bacteriófagos (Mu, lambda, P22, etc) I.II. EUCARIOTAS CLASE II: MEDIANTE RNA Sistemas de inversión Elementos controladores del Zea mays (Ac, Mu, Sm, etc) Elementos P de Drosophila Superfamilia vírica Retrovirus, LINE, Ty,... II.II EUCARIOTAS Superfamilia no vírica SINE Alu y B1 de mamíferos, pseudogenes procesados derivados de la polimerasa II Fig.9. Clasificación de los elementos transponibles 16

17 Fig.10. Estructura básica de los trasposones Los trasposones son secuencias de material genómico que tienen la capacidad del saltar fuera y dentro del genoma. Son capaces de autorreplicarse e integrarse aleatoriamente en nuevos sitios dentro del genoma (trasponerse o saltar ). Pueden entrar en plásmidos y ser propagados por ellos. Estas propiedades les confieren la capacidad de ser transferidos exitosamente en células y genomas extraños. La ingeniería genética puede manipular estos trasposones para llevar a cabo transferencia horizontal de genes. La transferencia horizontal de genes es la transferencia de material genético entre células y genomas que pertenecen a especies no relacionadas, por procesos distintos a la reproducción. Un ejemplo de ello es el uso de los trasposones de salmónidos para la transferencia génica en vertebrados. Los trasposones de vertebrados de la familia Tc1/mariner contienen como mínimo un gen único que codifica la enzima trasposasa flanqueada por dos repeticiones terminales invertidas (tir). Cada una de las tir posee uno o varios sitios de p.b. de interacción con la trasposasa. La trasposasa interacciona con estos sitios para cortar el trasposón, luego interacciona con secuencias presentes en el genoma en otro locus y pega el trasposón en el nuevo locus. En vertebrados todos los trasposones que se han detectado están inactivados por mutaciones. Sin embargo recientemente se ha obtenido un trasposón activo de salmónidos mediante múltiple mutagénesis dirigida. Dicho transposón denominado Bella durmiente o Sleeping beauty (SB) se puede usar en todos los vertebrados analizados hasta el momento como vehículo de incorporación de nuevos genes y para inactivar genes en el genoma por inserción. 17

18 Fig.11. Esquema de un procedimiento para integrar genes en células usando trasposones. 18

19 Transferencia génica con vectores virales Los vectores virales son todos aquellos que han sido obtenidos a partir de un virus, tratando de eliminar sus características patológicas y adaptarlos a una nueva función como transportadores de material genético heterólogo. Pretenden aprovechar las ventajas que aportan los virus como vectores naturales que han sufrido procesos de evolución complejos a lo largo de millones de años para optimizar su función de introductores de material genético en las células que invaden. Para modificar un virus y transformarlo en un vector de transferencia génica en animales, el primer paso es bloquear su capacidad de propagación eliminando los genes responsables de su replicación. El segundo paso es la eliminación de parte del genoma viral para crear espacio para introducir el material genético de interés (gen o genes, más los elementos de control). Se han de eliminar genes que no sean esenciales, y especialmente aquellos que puedan resultar tóxicos o perjudiciales para el individuo a manipular. La ventaja de los vectores virales en la gran eficacia de transferencia y la posibilidad, en algunos casos, de integrar el transgen en el genoma de la célula hospedadora. Por otro lado presentan desventajas como su falta de especificidad celular en la mayoría de los casos, la limitación del tamaño (debido a que han de empaquetarlo en la cápsida), su elevada inmunogenidad y el riesgo biológico que conllevan (reconstitución de partículas replicativas por recombinación, y oncogenidad inducida por integración inespecífica. Se han usado retrovirus y lentivirus como vectores para integrar transgenes en genomas animales. Esta técnica se ha usado en ratones con éxito y se ha extendido a gallinas, vacunos y suinos. - Vectores retrovirales Los retrovirus son virus de ARN con envuelta. Poseen una elevada eficacia de transducción en un gran número de tipos celulares, son capaces de integrarse de forma estable en el genoma de las células que infectan sin expresar ninguna proteína viral inmunogénica, y son relativamente poco patogénicos, con excepción de algunos como el VIH. La mayoría de ellos derivan del virus de la leucemia murina (MuLV). En general, su principal limitación es que sólo pueden transducir eficazmente células en división, ya que el acceso al núcleo del complejo de preintegración requiere la ruptura de la membrana nuclear. Hay un tipo de retrovirus, los lentivirus, que si que pueden infectar e integrarse en células quiescentes, como el VIH y SIV, pero el riesgo inherente al uso de los mismos limita su aplicación. Otro inconveniente que tiene el uso de retrovirus como vectores es la poca estabilidad de las partículas y su baja tasa relativa de producción. Esto ha sido parcialmente resuelto con la sustitución de la proteína de la envuelta por la glicoproteína G del virus de la estomatitis vesicular que posibilita la obtención de títulos de hasta 109 p.i. /ml y estabiliza las partículas. 19

20 Debido a que estos virus tienen un rango de infectividad muy amplio, cuando se quiere transducir selectivamente una población celular, se le incorporan ligandos heterólogos o anticuerpos monocatenarios que generan nuevas especificidades. Son vectores que poseen proteínas quiméricas en la envuelta. Contrario a la percepción de muchos, los primeros animales transgénicos fueron producidos hace ya casi 30 años mediante la microinyección de ADN viral (SV40) en la cavidad del blastocele de embriones de ratón (Jaenish y Mintz, 1974). Los próximos intentos involucraron embriones de ratón infectados con el retrovirus Moloney de la leucemia murina (MoMuLV), lo que resultó en la transmisión estable hacia la línea germinal (Jaenish, 1976). Esto se logró reemplazando genes que no son esenciales para el virus por genes heterólogos, aprovechando así la capacidad de los virus de infectar un amplio espectro de células y con una gran eficiencia. Una de las grandes desventajas de este método radica en que la integración del ADN se produce en diferentes etapas del embrión en desarrollo, lo que implica que el ADN no se integra en todas las células somáticas o en la línea germinal y por lo tanto no hay transmisión del transgen a la descendencia. Además, los animales generados por este método tienen a menudo más de un sitio de integración, lo cual ocurre cuando más de una célula del embrión es infectada por el virus (Palmiter y Brinster, 1985). Esto implica que las líneas de ratones transgénicos deben ser cruzadas para segregar los diferentes loci conteniendo el transgen y poder así aislar líneas con un sitio de inserción único. Finalmente, los vectores retrovirales poseen una limitada capacidad de ADN foráneo que puede ser acomodado, alrededor de 8 kb, lo cual imposibilita muchos experimentos especialmente con secuencias genómicas humanas que pueden superar ampliamente este tamaño. - Vectores Adenovirales Los adenovirus son virus de DNA sin envuelta con un genoma bicatenario hasta 36 kb. Se han seleccionado los serotipos 2 y 5 para la obtención de vectores por no estar asociados con ninguna enfermedad severa ni originar tumores en animales. Pueden transducir un número bastante amplio de tipos celulares distintos, tanto células en división como post-mitóticas, con una eficacia muy elevada. El genoma viral se mantiene episómico, lo que permite una expresión genética transitoria. Originalmente la capacidad del vector para incorporar ADN era de hasta 8 kb. Recientemente se ha conseguido eliminar casi todo el genoma viral, manteniendo las secuencias de empaquetamiento y las secuencias terminales, rindiendo vectores que pueden incorporar hasta 35 kb a los que se les ha denominado vectores sin tripas (gutless). La eliminación de material genómico viral además de aumentar la capacidad del vector de incorporar ADN, disminuye el riesgo de inducción de respuesta inmune. La mayoría de la población ha sido infectada en algún momento por adenovirus y presenta una respuesta inmune inicial. Una de las mayores ventajas de estos virus es su alta reproductividad con títulos de hasta p.i./ml, y su gran estabilidad, que les permiten ser concentrados adicionalmente para alcanzar valores de p.i./ml. Su falta de especificidad celular se compensa con el desarrollo de estrategias de redireccionalidad. Quimeras que introducen ligandos específicos en proteínas de la cápside y moléculas biespecíficas que reconocen tanto la cápside viral como el receptor seleccionado. 20

21 Vectores de virus adenoasociados Los virus adenoasociados son parvovirus humanos no patológicos. Son pequeños virus sin envuelta con un genoma de ADN monocatenario, capaces de infectar un gran número de células de origen diverso, tanto en división como en su estado quiescente. Pueden integrarse en la célula hospedadora en un lugar específico del genoma, eliminando la posibilidad de mutagénesis insercional. Otra ventaja en la carencia de respuesta inmune observada in vivo. Tiene una reducida capacidad de transporte (4,5 kb) y su reproducción es tediosa porque necesitan un virus de apoyo (adenovirus o herpesvirus), los cuales son difíciles de eliminar completamente. Originalmente se descubrió que al eliminar parte del genoma viral para introducir el transgen se perdía la capacidad de integración específica. Recientemente se ha descubierto que la proteína Rep78, en presencia de los ITRs, es capaz de potenciar la integración específica en el genoma celular y podría solucionar este problema. La falta de especificidad celular ha sido solucionada empleando estrategias de moléculas biespecíficas. Fig.12. Vectores virales de transferencia génica Vectores virales quiméricos Consiste en la combinación de varios vectores para compensar las limitaciones que tienen por separado, y aprovechar las ventajas más destacables que poseen de forma individual. Un ejemplo es la quimera adenovirus-retrovirus, en la que se utilizan dos tipos de vectores adenovirales: uno incorpora la maquinaria de empaquetamiento retroviral, y el otro introduce el material 21

22 genético equivalente a un vector retroviral. Se aprovecha la eficacia de transducción de los vectores adenovirales para cotransfectar con ambos vectores, transformando las células diana en productoras de vectores retrovirales. Los vectores así generados son capaces de infectar células vecinas e integrarse en su genoma. Transferencia génica mediada por semen Consiste en la introducción de ADN foráneo en gametos masculinos antes del proceso de fertilización. Las células espermáticas están consideradas por algunos autores como células inertes dado que no cuentan con la mayoría de la maquinaria molecular y bioquímica que existe en las células somáticas para permitir la replicación de ADN, la transcripción de los genes y la síntesis de proteínas. Su morfología es particular, y se caracteriza por un compartimento extremadamente reducido y un núcleo que contiene en ADN compactado a modo de cromatina condensada, conectados a un largo flagelo. Estas observaciones de la morfología llevan a la conclusión de que las células espermáticas tienen como única misión actuar de vectores de su propio genoma durante la fertilización. La primera evidencia de que las células espermáticas de mamífero podían incorporar ADN foráneo cuando eran incubadas en solución con estas macromoléculas fue descrita por Brackett et al. en En 1989 Lavitrano y col. describieron la producción de ratones transgénicos mediante inseminación artificial, utilizando semen que había sido incubado con ADN exógeno. Las células espermáticas habían incorporado ADN plasmídico. La generación F1 contenía el ADN exógeno. La transferencia génica mediada por semen en vertebrados se ha desarrollado y sufrido muchos cambios en los últimos años. La incubación de las células espermáticas con ADN foráneo seguida de fertilización in vitro o in vivo ha generado conejos, cerdos, ratones, ovejas, vacas, peces, pollos transgénicos. La definición y el establecimiento de los protocolos según la especie a transformar es y será un tema valioso en biotecnología. Una ventaja de la transferencia génica mediada con semen frente a la microinyección, es que la segunda requiere manipulación individual de los embriones, mientras que con la segunda se pueden transformar genéticamente un alto número de embriones en un solo paso. Esto es particularmente interesante cuando se quieren obtener especies acuáticas transgénicas. Existen investigaciones que sugieren que el control y captación del ADN exógeno por parte de las células espermáticas de mamíferos está altamente regulada y es muy específica. De hecho, el fluido seminal antagoniza fuertemente la unión de ADN foráneo y bajo condiciones normales es una fuerte protección de las células espermáticas contra el ADN foráneo. 22

23 En el caso de animales domésticos, incluyendo vacuno y cerdos, al llevar a cabo inseminación artificial a menudo se incorpora ADN foráneo mediante transferencia génica mediada por semen. El semen recién recolectado de los animales donadores se lava repetidas veces para eliminar el plasma seminal mediante centrifugaciones secuénciales. La suspensión de células espermáticas es incubada con ADN plasmídico foráneo diluido en un medio apropiado. La incorporación de ADN en células espermáticas mediada por complejos ADN-lisosomas ha demostrado afectar la motilidad de los espermatozoides, y a medida que aumenta la concentración de ADN disminuye el grado de fertilización in vitro. Técnicas alternativas se han desarrollado para una mejor incorporación del ADN foráneo. Para aumentar la incorporación de ADN por las células espermáticas, detergentes no polares, como tritón y tween, que desestabilizan la membrana espermática podrían ser usados. Se han obtenido resultados similares mediante el congelamiento y descongelamiento. Existe un método llamado Integración mediada por restricción enzimática (REMI). Esta técnica emplea un ADN lineal derivado de un plásmido por el corte con una enzima de restricción que origina un extremo cohesivo en uno de los extremos. El ADN foráneo es introducido, junto con la enzima de restricción en las células espermáticas por lipofección o electroporación. El enzima de restricción corta el ADN viral en los sitios que permiten la integración del ADN foráneo mediante el emparejamiento de los extremos cohesivos. Otro método alternativo es la inyección directa del esperma tratado e incubado con el ADN foráneo en el citoplasma del oocito, método conocido como Inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). La ICSI fue exitosamente utilizada en ratones para transferir largos fragmentos de ADN. Para algunas especies se ha descrito el método de la incorporación de ADN por electroporación al esperma incubado en una solución isosmótica que contiene el ADN foráneo. Es el caso de las células espermáticas de los peces, con las que se han realizado con éxito el desarrollo de estas técnicas. Una última estrategia es la incubación de las células espermáticas con el ADN foráneo y anticuerpos monoclonales (mab C). El anticuerpo es una proteína básica que se une al ADN por interacciones iónicas, permitiendo al ADN foráneo a unirse específicamente al esperma. Esta proteína interacciona con un antígeno de membrana de la célula espermática de todas las especies con las que se ha experimentado, incluyendo el ratón, el cerdo, el pollo, la oveja y el humano. Según Lavitrano et al. (2003), SMGT es altamente eficiente y relativamente barato, y puede ser usado en especies resistentes a la microinyección. 23

24 El uso de espermatozoides como vehículos no invasivos para transferir ADN foráneo a oocitos durante fertilización in vitro ha proporcionado una nueva alternativa para la generación de animales transgénicos. Transplante de núcleos y clones Clonación Las técnicas para llevar a cabo clonación celular artificial requieren un proceso de elaboración o de manipulación que permite obtener copias idénticas o casi idénticas de las células madre o progenitoras utilizadas. Si el producto o embrión se transfiere a un útero, se produce la implantación en el endometrio y se desarrolla un nuevo ser (clonación reproductiva). Pero si se transfiere a un medio de cultivo, el embrión dará origen a células madre embrionarias con la potencialidad para diferenciarse hacia cualquier tipo de célula adulta (clonación terapéutica) Métodos de clonación 1. Partición. En esta técnica se utilizan embriones octocelulares, en estado de preimplantación. A partir del embrión seleccionado, se toman mitades o secciones que posteriormente se introducen dentro de zonas pelúcidas naturales o artificiales. A continuación, se efectúa la implantación del producto en el endometrio. El número máximo de células del embrión, no puede ser superior a 8, porque a partir de este momento, se inicia la expresión del genoma embrionario. Los individuos obtenidos son prácticamente idénticos entre sí, aunque diferentes a los progenitores, por lo cual se considera que son el equivalente de los gemelos monocigóticos. Esta técnica, empleada por Wilmut en 1999, se ha seguido ampliamente para la clonación de animales de granja. Como ejemplos de esta técnica están las ovejas Megan y Morag, del Roslin Institute obtenidas en el Clonación por transferencia nuclear de células somáticas (SCNT: Somatic Cell Nuclear Transfer). Esta técnica se basa en la habilidad de inyectar o fusionar óvulos carentes de núcleos con núcleos diploides derivados de células somáticas en cultivo. Estas células pueden ser transfectadas de manera estable y proporcionar cientos de animales idénticos en una generación. La transferencia nuclear se describió por primera vez en 1952 en anfibios y consistió en extraer el material genético de un ovocito para posteriormente introducirle el material genético de una célula del animal a clonar. Los trabajos pioneros de Briggs y King (1957) demostraron que los núcleos de células al estado de blastocisto eran capaces de dirigir el desarrollo embrionario normal de ovocitos reconstituidos y generar una rana adulta a partir de estas células. En la década de los ochenta se realizaron exitosamente transferencias nucleares en la mayoría de los mamíferos como conejos (Stice y Robl, 1988), cerdos (Prather, y col., 1989), bovinos (Prather y col., 1987) y ovejas (Willadsen, 1986; Smith y Wilmut, 1989). Estos experimentos se realizaron por 24

25 medio de la disociación de blastómeros embrionarios (células embrionarias no diferenciadas) y su posterior transferencia nuclear. Sin embargo, los intentos por realizar transferencia nuclear con células más diferenciadas fueron infructuosos, lo que llevó a pensar que el ADN de células diferenciadas no podía reprogramarse, surgiendo entonces el dogma de que el proceso de diferenciación celular era irreversible. Este dogma se derrumbó el 27 de febrero de 1997, fecha en que Ian Wilmut y sus colegas del Instituto Roslin, en Edimburgo, Escocia, explicaron en la revista Nature cómo habían creado a la oveja Dolly. Fig.13. Dolly: El primer mamífero clonado por transferencia nuclear desde una célula diferenciada. Dolly fue el resultado de la fusión de un núcleo procedente de una célula mamaria extraída de una oveja adulta con un óvulo al que previamente se le había extraído el material genético (proceso conocido como enucleación). El equipo escocés demostraba así que las células adultas y especializadas podían ser reprogramadas. La etapa clave de este proceso fue la coordinación del ciclo celular de la célula receptora y el de la célula donante de núcleos que se logró mediante la deprivación de suero de estas últimas (Campbell y col., 1996; Wilmut y col., 1997). La deprivación de suero, previo a la transferencia nuclear, induce a las células a salir del ciclo de crecimiento y entrar en un estado de arresto celular o quiescencia (G0/G1 en el ciclo celular), el cual potenciaría el desarrollo embrionario, permitiendo a los factores en el ooplasma reprogramar el núcleo donante (Campbell y col., 1996). Los requisitos mínimos para la SCNT incluyen el uso de dos tipos de células: somáticas o no sexuales, y sexuales femeninas, u oocitos. Los núcleos de células somáticas de individuos postnatales se transfieren dentro de oocitos o de cigotos enucleados. Esta técnica tiene la ventaja que permite conservar el genoma durante la diferenciación celular y la capacidad del citoplasma celular 25