CURSO DE MICROBIOLOGÍA Alta especialidad en implantología Cuarta parte

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1 Laboratorio de Genética Molecular División de Estudios de Posgrado e Investigación Facultad de Odontología, UNAM CURSO DE MICROBIOLOGÍA Alta especialidad en implantología Cuarta parte Dra. Laurie Ann Ximénez-Fyvie Mtra. Adriana Patricia Rodríguez-Hernández

2 Métodos para el estudio de microorganismos Identificación fenotípica Tinción de Gram Morfología celular Motilidad Tolerancia al oxígeno Morfología de colonia Tipificación bioquímica Perfiles de proteínas celulares Identificación genética Hibridaciones DNA-DNA PCR Secuenciación 16S rrna

3 Identificación fenotípica Definición Aplicación Ventajas Desventajas Secuencia consecutiva de métodos de microbiología tradicional que en conjunto llevan a la identificación de especies bacterianas en cultivo; mediante la determinación y posterior seguimiento de sus características fenotípicas y metabólicas a través de diagramas de flujo de identificación aceptados Identificación y cuantificación de especie cultivable previamente caracterizadas o de microorganismos predeterminados a partir de muestras clínicas o cultivos puros Permite la realización de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana posteriores o en paralelo a la identificación Es posible realizar la cuantificación de las especies evaluadas En comparación a la identificación genética: Más laborioso Mayor tiempo y costo Difícil manejo de muestras bucales y de otros sitios con proporciones elevadas de especies fastidiosas Subestimación de especies fastidiosas No permite la identificación de especies no-cultivables

4 Identificación fenotípica- Diagrama de flujo Tinción de Gram Morfología celular Motilidad Tolerancia al O 2 Morfología de colonia Tipificación bioquímica Perfiles de proteínas celulares

5 Identificación fenotípica- Tinción de Gram Gram positivo Gram negativo

6 Identificación fenotípica- Morfología celular Coco Bacilo Espirilo Pleomórfico

7 Identificación fenotípica- Motilidad Contraste de Fases Campo Obscuro En Agar Sin motilidad De nado (Swimming) De deslizamiento (Glidding) En espasmos (Twitching) Tubo de Punción

8 Identificación fenotípica (Tolerancia al oxígeno) Anaerobio estricto (en ausencia de O 2 ) Microaerofílico (en conc. bajas de O 2 ) Capnofílico (en presencia de CO 2 ) Anaerobio facultativo (en presencia/ausencia de O 2 ) Aerobio estricto (en presencia de O 2 )

9 Identificación fenotípica- Morfología de colonia Color Tamaño Forma Textura Consistencia Periferia Adherencia al agar Formación de fosas Propiedades hemolíticas Fluorescencia con luz UV

10 Identificación fenotípica- Tipificación bioquímica Fermentación de carbohidratos Productos terminales Catalasa Oxidasa Coagulasa Reacciones de aglutinación

11 Identificación fenotípica- Perfiles de proteínas celulares SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis)

12 Métodos genéticos- Hibridaciones DNA-DNA Definición Aplicación Ventajas Desventajas Método no-dependiente del cultivo bacteriano para la identificación de especies; mediante la detección de fragmentos cortos de DNA marcados (sondas) tras su enlace a moléculas de DNA complementarias en una muestra (templete) Identificación y cuantificación de microorganismos predeterminados a partir de muestras clínicas o cultivos puros En comparación al resto de las pruebas de identificación: Capacidad para evaluar mayor número de especies y muestras En comparación a la identificación fenotípica: Menor tiempo y costo Fácil manejo de muestras bucales y de otros sitios con proporciones elevadas de especies fastidiosas Permite la identificación de especies no-cultivables En comparación a otras pruebas genéticas: Es posible cuantificación las especies evaluadas En comparación a la identificación fenotípica: No permite la realización de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en paralelo a la identificación En comparación a otras pruebas genéticas: Menor sensibilidad y especificidad

13 Métodos genéticos- Hibridaciones DNA-DNA Sonda: fragmento de DNA marcado con una molécula reportadora que permite su detección después de la hibridación Molécula Reportadora Radioactiva: Isótopos con emisiones (generalmente P 32 ) No-Radioactiva: Digoxigenina, Fluorescina, Biotina, etc. Especificidad: determinada por el diseño de la sonda Sensibilidad: determinada por el tipo y concentración de la sonda Southern Blot Blanco = DNA Sonda = DNA Northern Blot Blanco = RNA Sonda = DNA Western Blot Blanco = Proteína Sonda = Anticuerpo

14 Métodos genéticos- Hibridaciones DNA-DNA MiniSlot MiniBlotter Canales abiertos Membrana de nylon Canales de hibridación Membrana de nylon Filtros Socransky et al. Biotechniques 1994

15 Métodos genéticos- Hibridaciones DNA-DNA Socransky et al. Biotechniques 1994

16 Métodos genéticos- Hibridaciones DNA-DNA Especie ATCC Especie ATCC Actinomyces georgiae Actinomyces israelii Actinomyces meyeri Actinomyces naeslundii stp Actinomyces odontolyticus Actinomyces viscosus Aggregatibacter actinomycetemcomitans * Campylobacter gracilis Campylobacter rectus Campylobacter showae Capnocytophaga gingivalis Capnocytophaga ochracea Capnocytophaga sputigena Dialister pneumosintes Eikenella corrodens Eubacterium nodatum Eubacterium saburreum Filifactor alocis Fusobacterium nucleatum Fusobacterium periodonticum Neisseria mucosa Parvimonas micra Porphyromonas asaccharolytica Porphyromonas gingivalis Prevotella intermedia Prevotella loescheii Prevotella melaninogenica Prevotella nigrescens Propionibacterium acnes 6919 Selenomonas noxia Streptococcus anginosus Streptococcus constellatus Streptococcus gordonii Streptococcus intermedius Streptococcus mitis Streptococcus oralis Streptococcus sanguinis Tannerella forsythia Treponema denticola Veillonella parvula * Serotipos a: & b: Subespecies nucleatum: 25586, polymorphum: & vincentii: 49256

17 Métodos genéticos- PCR Definición Aplicación Ventajas Desventajas Método no-dependiente del cultivo bacteriano para la identificación de especies; mediante la amplificación de porciones específicas de DNA en una muestra (templete) Identificación de microorganismos predeterminados a partir de muestras clínicas o cultivos puros En comparación al resto de las pruebas de identificación: Mayor sensibilidad En comparación a la identificación fenotípica: Menor tiempo y costo Fácil manejo de muestras bucales y de otros sitios con proporciones elevadas de especies fastidiosas Permite la identificación de especies no-cultivables En comparación a la identificación fenotípica: No permite la realización de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en paralelo a la identificación En comparación a la identificación fenotípica e hibridaciones DNA-DNA: No permite la cuantificación de especies (excepto PCR en tiempo real) En comparación a hibridaciones DNA-DNA: Bajo número de especies evaluadas

18 Métodos genéticos- PCR Ciclos repetitivos de desnaturalización, alineamiento de primers y extensión para producir múltiples copias de una secuencia determinada de DNA Especificidad: determinada por el diseño de los primers Sensibilidad: hipotéticamente 1 célula PCR

19 Métodos genéticos- Secuenciación de la fracción 16S rrna Definición Aplicación Ventajas Desventajas Método no-dependiente del cultivo bacteriano para la identificación de especies; mediante la determinación de la secuencia en el DNA de la fracción 16S rrna en una muestra (templete) y su posterior comparación con secuencias publicadas Identificación de cualquier microorganismo a partir de muestras clínicas o cultivos puros En comparación al resto de las pruebas de identificación: Mayor especificidad En comparación a la identificación fenotípica: Menor tiempo y costo Fácil manejo de muestras bucales y de otros sitios con proporciones elevadas de especies fastidiosas Permite la identificación de especies no-cultivables En comparación a la identificación fenotípica: No permite la realización de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en paralelo a la identificación En comparación a la identificación fenotípica e hibridaciones DNA-DNA: No permite la cuantificación de especies En comparación a hibridaciones DNA-DNA: Bajo número de especies evaluadas

20 Métodos genéticos- Secuenciación de la fracción 16S rrna Comparación con bancos de secuencias conocidas Especificidad: hipotéticamente absoluta Sensibilidad: hipotéticamente 1 célula Secuenciación 16S rrna

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