TRABAJO PRÁCTICO N 2 MEDIOS DE CULTIVO SIEMBRA Y TRANSPLANTE

Transcripción

1 TRABAJO PRÁCTICO N 2 MEDIOS DE CULTIVO SIEMBRA Y TRANSPLANTE

2 MEDIOS DE CULTIVO. Definición: es toda preparación artificial, sólida, semisólida o líquida que suministra al microorganismo cada una de las sustancias fundamentales, una fuente de energía y condiciones ambientales adecuadas para el desarrollo y la supervivencia del microorganismo.

3 CULTIVOS: son las poblaciones de microorganismos que se obtienen en los medios de cultivo. Los cultivos pueden ser: a) puros o axénicos b) mixtos Un solo tipo de microorganismo Varios tipos de microorganismo Existe gran diversidad de condiciones químicas y físicas en las cuales puede ocurrir el crecimiento microbiano, pero siempre se requieren una fuente de energía y una fuente de carbono

4 Todos los organismos requieren una fuente de energía para obtener ATP y generar poder reductor (NADH, NADPH) por alguno de los siguientes metabolismos: - fotosíntesis - respiración aerobia: aceptor final de electrones O 2 - respiración anaerobia: aceptores finales de electrones: NO 3, SO 4, CO 2, fumarato. - fermentación: conjunto de reacciones donde compuestos orgánicos sirven como donadores y aceptores de electrones. Se produce ATP por fosforilación a nivel de sustrato.

5 Clasificación de Microorganismo según su fuente de energía y fuente de carbono

6 Composición de los medios de cultivos 1. Elementos energéticos y constitutivos a) Macro elementos b) Micro elementos o trazas c) Factores de crecimiento 2. Agua 3. Agentes solidificantés:

7 1. Elementos energéticos y constitutivos a) Macro elementos Fuente de Carbono CO 2 para autótrofos, azúcares para heterotrofos Se necesita el carbono para la construcción de muchas moléculas necesarias para la célula Fuente de nitrógeno NO 3 -, NH 3 ó N 2. (autótrofos) Aminoácidos y proteínas El nitrógeno es metabolizado para proveer proteínas, ácidos nucleicos y polímeros de pared

8 1. Elementos energéticos y constitutivos a) Macro elementos Fuente de: Se adiciona como: La célula lo utiliza para: Azufre SO 4 2-, tiosulfato o sulfuro Producir aminoácidos (cisteína y metionina) y diferentes coenzimas Fósforo Fosfatos de sódio o potasio Funciona como Buffer Para producción de ATP, fosfolipidos y Ac Nucleicos calcio, magnesio y potasio sales inorgánicas Co factores de enzimas sodio Na Cl Estabiliza la presión osmótica

9 1. Elementos energéticos y constitutivos b) Micro elementos o trazas Son metales que se requieren en muy pequeñas cantidades. Participan en la estructura de las enzimas, vitaminas, transportadores de electrones como citocromos. Son contaminantes de los macroelementos y se incorporan junto a ellos en los medios de cultivo. Frecuentemente esenciales: Cr, Co, Cu, Mn, Mo, Ni, Se, W, V, Zn Inhibidores del crecimiento: Au, Ag, Cd, Cr, Pb, y cualquier microelemento a concentración mayor que 10-4 M puede resultar tóxico para el desarrollo de los microorganismos.

10 1. Elementos energéticos y constitutivos b) Factores de Crecimiento Son compuestos orgánicos específicos requeridos en muy bajas concentraciones y que no pueden ser sintetizados por la célula Si la secuencia de producción enzimática, de un determinado componente. (Por ej: Histidina) esta interrumpida por alguna alteración, este componente no podrá sintetizarse por la célula y se convertirá en un factor de crecimiento. Ejemplos de factores de crecimiento : vitaminas, como las del complejo B algunos aminoácidos,purinas y pirimidinas

11 2. Agua El agua representa el 80-90% del peso total de una célula Es fundamental para la realización de todos los procesos metabólicos Funciones enzimáticas, solvatación de materiales orgánicos e inorgánicos, y donación de electrones para organismos fotosintéticos En los medios de cultivo se usa agua destilada, libre de iones como Ca2+ y Mg2+

12 3. Agentes solidificantés Cuando se agregan a un medio de cultivo permiten aislar colonias bacterianas. El mas utilizado es el Agar. Su uso es opcional El agar se enfría y se solidifica Permite aislar Colonias bacterianas Placa de petri Se adiciona el medio de cultivo con agar fundido

13 El Agar es un polisacárido ácido derivado de algas marinas, formado principalmente por galactosa con un grupo sulfato. Se usa sin problemas en medios de cultivo porque las bacterias NO lo digieren. Sus características: -Funde a C y permanece líquido hasta C. - Permanece sólido a 37 C, temperatura de incubación de la mayoría de las bacterias patógenas del hombre. -No es tóxico para las bacterias -Utilizado al 1.5-2%, permite el aislamiento de colonias (poblaciones de microorganismos derivadas de una única célula), lo que resulta imposible en medios líquidos!! -Para medios semisólidos (donde observo movilidad) empleo 0,2-0,3% de agar - Es transparente, lo que facilita la visualización de las colonias.

14 Condiciones Físicas de un medio de cultivo Temperatura mesófilos: C psicrófilos: C termófilos: C a) aerobios estrictas: requieren oxígeno para crecer. b) anaerobios obligados: el O 2 les resulta tóxico. Presencia de oxígeno c) anaerobios facultativos: pueden crecer tanto en condiciones aerobias como en condiciones anaerobias. d) microaerófilos: necesitan bajas tensiones de O2 y una atm enriquecida en CO2. e) anaerobios aerotolerantes: crecen en ausencia de O2 y si son expuestos al O2 no mueren. presión osmótica la mayoría de las bacterias crece en 0.1 a 1% NaCl luz: Humedad: ph: es importante para los microorganismos fotosintéticos Los microorganismos necesitan un ambiente húmedo para su desarrollo la mayoría de las bacterias crece en medio neutro o levemente alcalino

15 CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Por su origen químicamente definidos o sintéticos naturales o complejos Su composición química se conoce con exactitud, cada componente es de alta pureza analítica y realiza un aporte específico ej: medios para autotrofos Se preparan a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal de composición química no rigurosamente constante: leche, suero, macerado de maíz,etc Ej: medios para quimioheterotrofos

16 Ej. Medio Definido o sintético; (para fototrofos): CO 2.. (fuente de C) NaNO 3 (fuente de N) Na 2 SO 4. (fuente de S y Na) KH 2 PO 4. (fuente de P y K) Trazas varias H 2 O (indispensable para toda función celular) Conjunto de sales, Especificas Para un determinado tipo de microorganismo Ej- agar nutritivo, medio natural o complejo; (para bacterias quimioorganotrofas): Peptona de carne g Extracto de carne g NaCl 0.5 g Agar g Agua destilada. 100 ml PEPTONAS: son producto de la hidrólisis ácida o enzimática de proteínas de origen animal o vegetal (ej. peptona de carne, peptona de soja, peptona de caseína). Aditivos que no tienen una Composición nutritiva definida EXTRACTO DE CARNE: su función es ser complemento vitamínico de las peptonas. Pero también aporta: Sustancias nitrogenadas como: aminoácidos, bases púricas y pirimídicas, ácidos orgánicos, creatina, xantina, hipoxantina, ácido úrico, urea. Sustancias no nitrogenadas como glucógeno, fosfatos de hexosas, ácido láctico, sales inorgánicas.

17 CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Por su Consistencia Líquidos sólidos semisólidos o blandos No contienen solidificante y no permiten el aislamiento de colonias Incluyen agar en concentraciones de 1.5 a 2% incluye agar al 0.3%

18 CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Por su Composición Comunes Enriquecidos incluyen una fórmula nutritiva básica que permite el crecimiento de microorganismos poco exigentes. Tienen una alta calidad nutritiva por el agregado de componentes muy ricos como leche, sangre, huevo líquido, etc. Se utilizan en el cultivo de bacterias exigentes

19 Ej. - comunes: AGAR NUTRITIVO -peptona de carne -extracto de carne -NaCl -agar 2% -agua destilada - enriquecidos: AGAR SANGRE

20 CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Por su función: Medios de enriquecimiento: Medios selectivos Medios diferenciales Medios Líqudos sembrados con poblaciones mixtas de microorganismos, favorecen la multiplicación de ciertos grupos e inhiben el desarrollo de las especies restantes. son medios sólidos que favorecen la multiplicación de un determinado microorganismo e inhibe el desarrollo de otros Se logran agregando comp qcos (Ab) o alterando las condiciones fcas (ph). permiten discriminar entre diferentes tipos de bacterias basándose en características metabólicas particulares de cada uno. Se logran agregando determinados sustratos (Ej glucosa) y un sistema indicador (Ej Rojo fenol)

21 Ej. - de enriquecimiento (líq.) - selectivos (sólidos) Caldo Mac Conkey (inhibidor + lactosa + púrpura de bromocresol Agar Mac Conkey (inhibidor + lactosa + rojo neutro)

22 Ej. -diferencial Fermentación de: -glucosa?; -sacarosa?; -lactosa? Producción de H 2 S? El medio incluye los 3 azúcares, sal de Fe 2+ y un indicador de ph (rojo neutro) Shigella Enterobacter Proteus Pseudomonas Agar triple azúcar hierro (TSI)

23 Ej. De transporte: medio de Stuart medio de Cary Blair Contiene buffer + sustancias criopresevantes (glicerol)

24 Control ph. Ajuste con NaOH o HCL -Cintas de ph -Azul de bromotimol -phmetro Esterilización de los medios de cultivo -Autoclave Control de Esterilidad -Se toma una parte representativa de los medios y se incuban en estufa de cultivo a 37ºC Medios de Transporte -Ej Medio de Stuart Conservación de los medios de cultivo -4-10º C en refrigerador

25 PARTE B: SIEMBRAS Y REPIQUES Siembra: se entiende por siembra al acto de transferir o colocar un microorganismo en un medio de cultivo adecuado. La transferencia se efectúa desde el hábitat natural (nicho ecológico) al medio de cultivo. Muestras Medio de cultivo

26 Trasplante o repique: es la transferencia de gérmenes desde un medio de cultivo a otro. Con qué se siembra? Ansas en anillo y un ansa recta Crecimiento de Colonias bacterianas Siembra en placa con medio solido

27 Con qué se siembra? Micropipeta o Pipeta pasteur Espátula de Drigalski Siembra Crecimiento de Colonias bacterianas Micropipeta Pipeta pasteur

28 Técnica aséptica para siembras y repiques La "Técnica aséptica" tiene un doble objetivo: a) evitar que el operador se contamine con microorganismos procedentes de las muestras o cultivos y b) evitar la contaminación de las muestras y cultivos con microorganismos procedentes del ambiente o del propio operador A- se esteriliza el ansa a la llama B- se sostiene el ansa con el índice. Luego con el meñique. se destapa el tubo de muestra.

29 C. Se flamea la boca para evitar Contaminación D- se sumerge el ansa para tomar Un inoculo del tubo E- se flamea el tubo, para Evitar su contaminación F- se tapa con el dedo meñique