Detección, Identificación e Interpretación de Imágenes por IFI de Patrones de Anticuerpos Onconeuronales

Transcripción

1 Detección, Identificación e Interpretación de Imágenes por IFI de Patrones de Anticuerpos Onconeuronales Ángela Carrasco Sayalero F.E.A. en Inmunología Sección de Autoinmunidad ( Servicio de Inmunología) X Congreso Nacional del Laboratorio Clínico ZARAGOZA 2016

2 SÍNDROMES NEUROLÓGICOS PARANEOPLASICOS Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016 Los síndromes neurológicos paraneoplasicos son complicaciones importantes del cáncer generalmente mediadadas por un mecanismo inmunopatogenitico

3 CONCEPTOS GENERALES Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016 Asociados a una neoplasia, por efecto remoto. Signos y síntomas que resultan del daño de tejido neurológico localización de una neoplasia En ausencia de Invasión directa Metástasis remoto a la Complicación vascular/metabólica/ infecciosa/isquémica Terapia antineoplásica Senties-Madrid H et al. Paraneoplastic Syndromes Associated with Anti-Hu Antibodies. IMAJ. 2001

4 PATOGENIA Expresión ectópica de proteínas neuronales. Desarrollo de tejido neuronal maduro o inmaduro en el tumor. Se considera un efecto secundario del sistema inmunológico que pretende reducir el crecimiento del tumor. Debido a una disfunción de las células T reguladoras. Células T oligoclonales citotóxicas cruzan la barrera hemato-encefálica y atacan a las neuronas que expresa el Ag que comparte con el tumor

5 FISIOPATOLOGÍA Origen autoinmune? Inmunidad celular Inmunidad humoral Ac contra Ag intracelulares Ac contra Ag superficie Tumor Tumor / Idiopático Paraneoplásico o autoinmune Viaccoz A, Honnorat J. Paraneoplastic Neurological Syndromes: General Treatment Overview. Curr Opin Neurol Senties-Madrid H et al. Paraneoplastic Syndromes Associated with Anti-Hu Antibodies. IMAJ Wilson JF. The irony of paraneoplastic disorders. The Scientist

6 CARACTERÍSTICAS CLÍNICO-INMUNOLÓGICAS SNP Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016 Mediados por mecanismos de inmunidad humoral Ac frente antígenos de superficie: Síndrome de unión neuromuscular, Encefalitis Límbica. Los tumores subyacentes suelen ser teratomas y cáncer de timo Pronóstico favorable y una buena respuesta (antitumoral, inmunoterapia: corticoides +Ig iv/ Plasmaferesis, Ciclofoxfamida y Rituximab) Mediados por mecansimos de inmunidad celular Ac frente antígenos intracelulares: Los SNP clásicos asociados anticuerpos de tipo Hu, Ri. Anfifisina que afectan a SNC. Tumores asociados cancer de pulmon, seminoma, cancer de mama. Pronostico malo y respuesta pobre ((inmunoterapia, corticoides)

7 METODOLOGIA DE TRABAJO DESCARTAR : Enfermedad autoinmune sistémica con afectación neurológica; Neuropatía infecciosa post-vacunales o toxica IFI Triple tejido /+ Hep-2 1/80 DOBLE SCREENING: IFI e Inmunoblot Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016 IFI : sustrato de cerebelo de primate (1/10,1/40,1/100) Tipo de muestra : Suero o LCR Inmunoblot : antígenos purificados o recombinantes IFI +/ Blot + : Patrón identificable / especificidad encontrada IFI + / Blot - : Patrón identificable / Blot negativo NO significa SP

8 ESTUDIO DE ANTICUERPOS ANTI-NEURONALES Screening Inmunofluorescencia indirecta (IFI) Inmunohistoquímica (IHQ) Confirmación Inmunoblot (Ac intracelulares) Células transfectadas (Ac superficie) Carrasco A, Alarcón I, González C, Graus F. Identificación y utilidad clínica de los anticuerpos antineuronales. Inmunología Dalmau J, Graus F, Saiz A. Protocolo de detección de anticuerpos anti-neuronales y proteína

9 Sustrato: INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI) Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016 Cerebelo de rata (síndromes centrales) y nervio de primate (síndromes periféricos). Hipocampo de rata (Ac superficie). Muestra Suero Ac intracelulares Suero y LCR Ac superficie S ( %) y E (95%) Carrasco A, Alarcón I, González C, Graus F. Identificación y utilidad clínica de los anticuerpos antineuronales. Inmunología Carrasco A, Graus F. Atlas de anticuerpos anti-neuronales Tampoia et al. Diagnostic accuracy of different immunological methods for the detection of antineuronal antibodies. Immunol Invest 2010

10 INMUNOHISTOQUÍMICA Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016 Sustrato: Cerebelo de rata (síndromes centrales) y nervio de primate (síndromes periféricos). Hipocampo de rata (Ac superficie). Muestra Suero Ac intracelulares Suero y LCR Ac superficie Carrasco A, Alarcón I, González C, Graus F. Identificación y utilidad clínica de los anticuerpos antineuronales. Inmunología Carrasco A, Graus F. Atlas de anticuerpos anti-neuronales

11 INMUNOBLOT Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016 Indicación: Ac intracelulares. Sustrato: Blog con antígenos purificados o recombinantes. Muestra: Suero (o LCR). Dilución: 1/10, 1/40, 1/100. S (83-100%), E (96-100%). Carrasco A, Alarcón I, González C, Graus F. Identificación y utilidad clínica de los anticuerpos antineuronales. Inmunología Carrasco A, Graus F. Atlas de anticuerpos anti-neuronales Tampoia et al. Diagnostic accuracy of different immunological methods for the detection of antineuronal antibodies. Immunol Invest 2010

12 Sustrato: Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016 CÉLULAS TRANSFECTADAS Células HEK293 (human embrionic cells of kidney). Transfección con un vector de expresión eucariótica (plásmido) con ADN que codifique el Ag específico (NMDAR, AMPAR, etc.). Cultivo para crecimiento. Muestra: suero y LCR. Inmunofluorescencia indirecta. Sensibilidad: suero (85%), LCR (82-100%). Especificidad: ~100%. Carrasco A, Alarcón I, González C, Graus F. Identificación y utilidad clínica de los anticuerpos antineuronales. Inmunología Carrasco A, Graus F. Atlas de anticuerpos anti-neuronales Tampoia et al. Diagnostic accuracy of different immunological methods for the detection of antineuronal antibodies. Immunol Invest 2010

13 CLASIFICACIÓN DE LOS ANTICUERPOS Grupos Anticuerpos Características Grupo I (Ag intracelulares) Grupo Ia -Hu (ANNA-1) -PCA-2 -Ri (ANNA-2) -Anfifisina* -ANNA-3 -Recoverina -Yo (PCA-1) -CV2 / CRMP-5 -Ma1 (PNMA1) -Ma2 (Ta, PNMA2) Paraneoplásicos (asociación bien caracterizada) Posible presencia con tumor sin clínica (0-16%) Rol patogénico? Marcadores Mala respuesta a inmunoterapia (10-30% leve) Grupo Ib -Familia ZIC -Familia SOX Paraneoplásicos (CPCP) NO rol patogénico (marcadores) Grupo Ic -GAD* -AK5 No paraneoplásicos (raro tumor) Autoinmune Grupo II (Ag superficie) Grupo IIa -NMDA -LGI1 -Caspr2 -AMPA -GABA-B -GABA-A -GlyR -DPPX -Homer-3 Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016 Tendencia en más jóvenes No implican paraneoplasia (tumor <70%) Rol patogénico Buena respuesta inmunoterapia (75-80%) Grupo IIb -mglur1 -mglur5 -VGCC -DNER (Tr) Paraneoplásicos Rol patogénico Buena respuesta inmunoterapia (75-80%) Graus, Dalmau, Saiz. Antibodies and neuronal autoinmune disorders of the CNS. J Neurol Lancaster E. Paraneoplastic disorders. Continuum *Ag sinápticos intracelulares (mejor respuesta a inmunoterapia)

14 ANTICUERPO ESPECIFICO SÍNDROMES PARANEOPLÁSICOS CARACTERIZACIÓN ASOCIACIÓN CLÍNCA 1. Anti-Hu (ANNA-1) Antígeno: Proteína Hu ligada al RNA 2. Anti-Yo Antígeno: CDR62/CDR34 Fluorescencia en núcleos neuronales en sistema nervioso central y periférico Detección por IFI e Inmunoblot Fluorescencia en Citoplasma células de Purkinje. Patrón granular Detección por IFI e Inmunoblot Neuropatías sensitivas, encefalitis límbica, degeneración cerebelosa, encefalomielitis subaguda Tumor asociado: carcinoma de célula pequeña de pulmón Degeneración cerebelosa Tumor asociado: ovárico; mama 3. Anti-CV2 (CRMP5) Antígeno: CRMP Anti-Anfifisina Endocitosis de las vesículas sinápticas Fluorescencia en Citoplasma oligodendrocitos capa granular y sustancia blanca del cerebelo Detección por IFI e Inmunoblot Fluorescencia en la zona granular un botón sináptico y la zona molecular positiva Detección por IFI e Inmunoblot Encefalomielitis, neuropatía motora y sensitiva, ataxia cerebelosa Tumor asociado: carcinoma de célula pequeña de pulmón, timoma Síndrome de Stiff-person Tumor Asociado: carcinoma de pulmón célula pequeña; cáncer de mama 5. Anti-Tr (PCA-Tr) Antígeno: DIVER altamente específico en C. Purkinje 6. Anti-Ri (ANNA-2) Antígeno: NOVA Proteína ligada al RNA 7. Anti -Ma2 (PMNA2) Antígeno: Fosfoproteína citoplasmática implicada en la síntesis de RNA Fluorescencia punteado en la zona molecular y citoplasma de las células de Purkinje Detección por IFI Idéntico a Hu en SNC, Negativo núcleos neuronales plexo mientérico intestino Detección por IFI e Inmunoblot Fluorescencia núcleo dentado, puntos en el nucleolo o citoplasma Detección por IFI e Inmunoblot Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016 Degeneración cerebelosa Tumor asociado linfoma de Hodgkin. Encefalitis de tronco y opsoclono Tumor asociado :carcinoma de pulmón célula pequeña, cáncer mama Encefalitis límbica. encefalitis meso-di encefálica Tumor asociado: testículo A Carrasco F Graus; Atlas de Ac Anti-neuronales 2012

15 ENCEFALITIS AUTOINMUNE ANTICUERPO ESPECÍFICO 1. Anti-receptor de NMDA Receptor NMDA de Glutamato 2. Anti LGI1 Proteína asociada a VGKC CARACTERIZACIÓN Fluorescencia en zona molecular de hipocampo y estrato granuloso del cerebelo IFI y Células transfectadas Fluorescencia en zona molecular hipocampo y cerebelo IFI y Células transfectadas ASOCIACIÓN CLÍNCA Encefalitis Tumor asociado: teratoma ovárico (58%) Encefalitis límbica Tumor asociado: ninguno 3. Anti-receptor de GABA B Receptor de GABA B Fluorescencia en zona molecular hipocampo y cerebelo Células transfectadas Encefalitis límbica Tumor asociado: SCLC (70%) 4. Anti CASPR2 Proteína asociada a VGKC Fluorescencia en zona molecular hipocampo y cerebelo IFI y Células transfectadas Síndrome de Morvan, neuromiotonia, encefalitis límbica Tumor asociado: Timoma (73%) 5. Anti-receptor de AMPA Receptor AMPA de Glutamato 6. Anti-receptor mglur5 Fluorescencia en zona molecular hipocampo y cerebelo IFI y Células transfectadas Fluorescencia en zona molecular hipocampo Encefalitis límbica Tumor asociado: SCLC, mama, timoma (60%) Encefalitis límbica Hodgkin A. Carrasco; F. Grau; Atlas de Ac Anti-Neuronales 2012

16 OTROS SÍNDROMES ANTICUERPO ESPECÍFICO CARACTERIZACIÓN ASOCIACIÓN CLÍNCA NMO-IgG Antígeno: AQP4 Fluorescencia en córtex y cerebelo: zona Pia y subpia ELISA; IFI sobre células transfectadas Neuromielitis Optica (Síndrome de Devic s) SOX1 (AGNA) Antígeno: Proteína SOX1 Relacionado con células madre neuronales Fluorescencia en núcleos de las células de la glia de Bergmann alrededor de las células de Purkinje SOX1: Mediante Inmunoblot LEMS paraneoplásico, en menor medida mismos síndromes asociados a anti-hu Tumor asociado: SCLC Anti-GAD Proteína Sináptica * Solo detecta títulos elevados de GAD (>2000 por RIA) Fluorescencia; Patrón granular en capa molecular * RIA, ELISA, Inmunoblot SPS, ataxia cerebelo, encefalitis límbica Cáncer No A Carrasco; F Graus; Atlas de Ac Anti-Neuronales 2012

17 ESTRUCTURA DEL CEREBELO

18 ANA: FALSO POSITIVO Núcleo neuronas E.M. (E.M.) Estrato Granuloso Vasos Fibras Células de Purkinje Estrato Granular (E.G.) Células Glía de Bergmann ANA 1/40. Falso Positivo. Núcleo neuronas E.G. Sustancia Blanca C. Purkinje

19 ANA INESPECÍFICO

20 NEGATIVO (E.M.) Núcleo neuronas E.M. Estrato Granuloso Vasos Fibras Células de Purkinje Estrato Granular (E.G.) NEGATIVO Células Glía de Bergmann Sustancia Blanca Núcleo neuronas E.G. C. Purkinje

21 ANTI HU/RI (E.M.) Núcleo neuronas E.M. Vasos C. Purkinje Fibras Células de Purkinje Estrato Granular (E.G.) Células Glía de Bergmann Estrato Granuloso Núcleo neuronas E.G. Sustancia Blanca Sustancia Blanca Anti Hu/Ri. Núcleos Neuronales del SNC y Periférico

22 ANTI HU (ANNA-1) AG: PROTEÍNA HU LIGADA AL RNA

23 ANTI-YO Núcleo neuronas E.M. (E.M.) Estrato Granuloso Vasos Fibras Células de Purkinje Estrato Granular (E.G.) Células Glía de Bergmann C. Purkinje Núcleo neuronas E.G. Sustancia Blanca Anti-Yo, citoplasma de las C.P. patrón granular Sustancia Blanca

24 ANTI YO (PCA-1) AG: CDR62/CDR34

25 ANT-YO (E.M.) Núcleo neuronas E.M. Vasos Fibras C. Purkinje Células de Purkinje Estrato Granular (E.G.) Estrato Granuloso Células Glía de Bergmann Sustancia Blanca Sustancia Blanca Núcleo neuronas E.G. Anti-Yo. Puede haber un segundo anticuerpo hay IFI en E.G. y S.B.

26 ANTI CV2 AG: CRMP-5 EG Fluorescencia en citoplasma de oligodendrocitos, capa granular y sustancia blanca del cerebelo

27 FALSO CV2 (E.M.) Núcleo neuronas E.M. Estrato Granuloso Vasos Fibras C. Purkinje Células de Purkinje Falso CV2, Astrocitos Estrato Granular (E.G.) Células Glía de Bergmann Núcleo neuronas E.G. Sustancia Blanca

28 ANFIFISINA Núcleo neuronas E.M. (E.M.) Fibras Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016 C. Purkinje Vasos Sustancia Blanca Células de Purkinje Estrato Granular (E.G.) Células Glía de Bergmann Patrón Sináptico E.M.+, E.G. Botón Sináptico: Anfifisina Sustancia Blanca Núcleo neuronas E.G. Estrato Granuloso

29 ANFIFISINA ENDOCITOSIS DE LAS VESIUCLAS SINAPTICAS

30 MITOCONDRIA+ FALSO PATRÓN DE ANFIFISINA Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016 (E.M.) Mitocondria +, falso positivo de Anfifisina (botón sináptico E.G.) Fibras Núcleo neuronas E.M. Sustancia Blanca Vasos Células de Purkinje Estrato Granular (E.G.) Células Glía de Bergmann Sustancia Blanca C. Purkinje Núcleo neuronas E.G. Estrato Granuloso

31 ANTI-TR (E.M.) Núcleo neuronas E.M. Estrato Granuloso Vasos Fibras Células de Purkinje C. Purkinje Estrato Granular (E.G.) Células Glía de Bergmann Núcleo neuronas E.G. Sustancia Blanca Anti-PCA2-Tr, dendritas en E.M., punteado en C.P. y E.M.

32 ANTI TR AG: DIVER, ESPECIFICO DE LAS C. PURKINJE

33 ANTI-HU/RI (ANNA-2) Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016 AG: NOVA PROTEINA LIGADA AL RNA Núcleo neuronas E.M. (E.M.) Vasos Fibras Células de Purkinje Sustancia Blanca Estrato Granular (E.G.) Células Glía de Bergmann C. Purkinje Núcleo neuronas E.G. Sustancia Blanca Anti Hu/Ri, discretamente positivo C.P. Estrato Granuloso

34 ANTI-MA2 (PMNA2) Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016 (E.M.) AG: FOSFOPROTEINA CITOPLASMATICA IMPLICADA EN LA SINTEISS DE RNA Estrato Granuloso Núcleo neuronas E.M. Vasos C. Purkinje Fibras Células de Purkinje Estrato Granular (E.G.) Células Glía de Bergmann Núcleo neuronas E.G. Sustancia Blanca Núcleos y fibras alrededor de las C. P. Ma2, núcleo dentado, puntos en el nucleolo o citoplasma

35 ANTI-GAD Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016 (E.M.) Estrato Granuloso Núcleo neuronas E.M. Vasos Fibras Células de Purkinje C. Purkinje Estrato Granular (E.G.) Células Glía de Bergmann Sustancia Blanca Patrón granular E.M. punteado sináptico anti-gad Núcleo neuronas E.G. Sustancia Blanca

36 ANTI-GAD PROTEINA SINAPTICA IMUNOHISTOQUIMICA IFI : Patrón granular en capa molecular

37 ANTI-SOX Núcleo neuronas E.M. (E.M.) Fibras C. Purkinje Estrato Granuloso Vasos Células de Purkinje Estrato Granular (E.G.) Células Glía de Bergmann Núcleo neuronas E.G. Sustancia Blanca anti-sox. Núcleos de las celulas de la Glia de Bergmann alrededor de las C.P.

38 ANTICUERPOS CONTRA ANTÍGENOS DE SUPERFICIE Congreso Nacional del Laboratorio Clínico : Aquaporin : NMDA-receptors 2009: AMPA-receptors 2010: GABAB-receptors 2010: LGI1; CASPR2 2012: DNER (Tr)

39 HIPOCAMPO

40 CORTE DE HIPOCAMPO Hipocampo Positivo

41 Anti-NMDA : receptor NMDA de Glutamato Hipocampo: Zona molecular Cerebelo: Estrato Granuloso Encefalitis Límbica

42 ANTI-NMDA Núcleo neuronas E.M. (E.M.) Sustancia Blanca Vasos Fibras C. Purkinje Estrato Granuloso Células de Purkinje Estrato Granular (E.G.) Células Glía de Bergmann Núcleo neuronas E.G. Sustancia Blanca anti-nmdar, botones sinápticos en E.G.

43 ANTI-NMDA CEREBELO+ + HIPOCAMPO - CT + NO CT C T -

44 Anti-AMPA: Receptor AMPA del Glutamato HIPOCAMPO Zona Molecular CEREBELO Baton Sinaptico EG, Fibras nerviosas Difuso y granulado EM Encefalitis Límbica Clásica // Síntomas Psiquiátricos asociados

45 Anti-GABA: Receptor de GABA Hipocampo Cerebelo Encefalitis Límbica Clásica ( coexistencia con GAD65 ) Estatus epilépticos refractarios

46 Anti-LGI1 (VGKC) : Proteína Presináptica Hipocampo Cerebelo Epilepsia Autoxomica

47 Anti-CASPR2 (VGKC) : Proteina Axonal Transmembrana Hipocampo Cerebelo Síndrome de Morvan ( neuromiotomia +/- encefalitis ) // Epilepsias Resistentes

48 INMUNOHISTOQUIMICA VGKC

49 Anti-DPPX (VGKC): Proteína Transmemebrana (tipo II) (Dipeptidyl amino peptidase like proteine) Subunidad reguladora Kv4.2 de VGKC Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016 Hipocampo Estrato lúcido del Hipocampo. Cerebelo Fluorescencia granular del Encefalomielitis + Síntomas Intestinales

50 PATRONES ESPECIFICOS DIFICILES DE DIFERENCIAR Hipocampo Anti-NMDAR Anti-AMPAR Anti-GABABR Anti-LGI1 (VGKC) Anti-CASPR2 (VGKC) Anti-DPPX (VGKC)

51 PATRONES ESPECIFICOS DIFICILES DE DIFERENCIAR Cerebelo Anti-NMDAR Anti-AMPAR Anti-GABABR Anti-LGI1 (VGKC) Anti-CASPR2 (VGKC) Anti-DPPX (VGKC)

52 OTROS SÍNDROMES Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016 Neuromielitis Óptica (Sindrome de Dévic) Anti-NMO IgG Antigeno AQP4

53 NEUROMIELITIS ÓPTICA (NMO-IGG) Cerebro Nervio óptico Anti-AQP 4

54 NEUROMIELITIS ÓPTICA (NMO-IGG) HEK293 Transfectadas con AQP-4 HEK293 Control Anti-AQP 4

55 RELEVANCIA DE LOS AUTOANTICUERPOS El 31% de los resultados positivos lo son para algo diferente de lo solicitado! Anti-LGI1 11,1% Anti-GABAB 2,8% Anti-AMPAR 0,0% NMDAR + Hu 1,9% NMDAR + GABAB 0,9% NMDAR + CASPR2 0,9% Anti-CASPR2 11,1% Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016 Hu + CV2 2,8% Anti-Hu 5.6% Anti-Yo 8,2% Anti-Ri 9,3% Anti-Ma 1,9% Anti-PCA2 0,9 % Anti-CV2 3,7% Anti-Amphiphysin 0,9% Anti-NMDAR 38%

56 GRACIAS

57 Taller de Imágenes. Foto 1. (E.M.) Estrato Granuloso Fibras Núcleo neuronas E.M. Vasos C. Purkinje Células de Purkinje Estrato Granular (E.G.) Células Glía de Bergmann Núcleo neuronas E.G. Sustancia Blanca Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016 Núcleos y fibras alrededor de las C. P. Ma2, núcleo dentado, puntos en el nucleolo o citoplasma

58 Taller de Imágenes. Foto 2. Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016 (E.M.) Núcleo neuronas E.M. Vasos Fibras C. Purkinje Células de Purkinje Estrato Granular (E.G.) Estrato Granuloso Células Glía de Bergmann Sustancia Blanca Sustancia Blanca Núcleo neuronas E.G. Anti-Yo. Puede haber un segundo anticuerpo hay IFI en E.G. y S.B.

59 Taller de Imágenes. Foto 3. Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016 (E.M.) Núcleo neuronas E.M. Vasos C. Purkinje Fibras Células de Purkinje Estrato Granular (E.G.) Células Glía de Bergmann Estrato Granuloso Núcleo neuronas E.G. Sustancia Blanca Sustancia Blanca Anti Hu/Ri. Núcleos Neuronales del SNC y Periférico

60 Taller de Imágenes. Foto 4. Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016 Núcleo neuronas E.M. (E.M.) Sustancia Blanca Vasos Fibras C. Purkinje Estrato Granuloso Células de Purkinje Estrato Granular (E.G.) Células Glía de Bergmann Núcleo neuronas E.G. Sustancia Blanca

61 Taller de Imágenes. Foto 5. Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016 (E.M.) Núcleo neuronas E.M. Estrato Granuloso Vasos Fibras Células de Purkinje C. Purkinje Estrato Granular (E.G.) Células Glía de Bergmann Núcleo neuronas E.G. Sustancia Blanca