1. OBJETIVO Detectar enterotoxina A de C. perfringens por método de aglutinación pasiva en látex en cepas aisladas de alimentos
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- José María Castro Ortega
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1 PRT Página 1 de 9 1. OBJETIVO Detectar enterotoxina A de C. perfringens por método de aglutinación pasiva en látex en cepas aisladas de alimentos 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE Aplicar este procedimiento a filtrados de cultivos aislados de C. perfringens en alimentos 3. FUNDAMENTO La ingestión de alimentos contaminados con C. perfringens pueden producir intoxicación alimentaria. La producción de enterotoxina se asocia con el proceso de formación de esporas. La detección de enterotoxina de C. perfringens en cultivo no es tan eficiente debido a los problemas de estimular en medios artificiales la producción de esporas que está asociada a la formación de enterotoxinas. Se ha reconocido la aglutinación pasiva en fase reversa (RPLA) como un método eficaz para la detección de la enterotoxina A de C. perfringens y la técnica consiste en la detección de antígenos solubles como las toxinas bacterianas puedan ser detectadas por un ensayo de aglutinación, mediante una reacción entre los anticuerpos solubles y los antígenos particulados. En la fase reversa, los anticuerpos que están unidos a partículas, reaccionan con el antígeno solubles. Las partículas en este caso de látex no juegan por sí mismas parte de la reacción y son por lo tanto pasivas y el entramado de las partículas de látex por la reacción específica antígeno/anticuerpo da como resultado una reacción visible de aglutinación de látex. La sensibilidad del método en detectar enterotoxina es aproximadamente de 2 ng/ ml 4. REFERENCIAS 4.1 Harmon, S.M and Kautter, D.A (1986). J. Food Protection. 49: 523; Sakaguchi, G. Vemura, T. and Riemann, H.P. (1973). J. Appl. Microbiol. 26: Duncan, C.L. and Strong, D.H. (1968). J. Appl. Microbiol. 1:82
2 PRT Página 2 de 9 5. TERMINOLOGÍA No Aplica 6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1 Reactivos y medios de cultivo Cepas de estudio aisladas y filtradas Caldo Cooked Meat Medio de Duncan y Strong modificado Carbonato de calcio 0,66M Kit PET- RPLA test Oxoid código TD0930A (latex sensibilizado, latex control, enterotoxina control y diluyente) 6.2 Equipos e insumos Placas de microtitulación en V Micropipeta de 25 µl Membrana de filtración de baja unión de proteínas, con un poro de 0,2-0,45 µm. (Millipore SLGV) Cámara de humedad Centrífuga (opcional) Tubos centrífuga (opcional) 7. DESARROLLO 7.1 Preparación del cultivo: Cultivar el microorganismo aislado (pool) en Cooked Meat a 35 C por horas Inactivar por calentamiento a 75 C durante 20 minutos Subcultivar en medio de Duncan y Strong (Anexo N 3) para producción enterotoxinas Inocular en 16 a 18 ml de medio de Duncan y Strong con 0,8 ml del cultivo de Cooked Meat previamente inactivado (tomar del fondo del tubo) Cuidar que la tasa de dilución no supere la proporción 1: 20 para no inhibir la formación de esporas.
3 PRT Página 3 de Incubar a 35 C por 24 horas Centrifugar a 900 g a 4 C (3000 rpm) durante 20 min Usar el sobrenadante como muestra Si no se dispone de centrífuga, filtrar con membrana de 0,2-0,45µm y usar el filtrado como muestra a ensayar 7.2 Reactivos para el Ensayo: Los reactivos de látex y diluyentes están listos para su uso Agitar vigorosamente antes de su uso para asegurar una suspensión homogénea 7.3 Reconstitución enterotoxina control Añadir 0,5 ml de diluyente al vial de control enterotoxina, agitar hasta disolver El control de enterotoxina reconstituido aglutinará con el látex sensibilizado El uso del control proporcionará las referencias para los patrones positivos 7.4 Método de ensayo Reactivos de trabajo Distribuir la placa de forma que cada fila tenga 8 posillos Cada muestra necesita 3 filas Con una micropipeta dispensar 25 µl del diluyente en cada pocillo de las 3 filas excepto en el primer pocillo de cada fila Añadir 25 µl de la muestra (sobrenadante o filtrado) al primer y segundo pocillo de fila 1 y En fila 3 añadir 25 µl de control enterotoxina al primer y segundo pocillo Con una micropipeta comenzando por el segundo pocillo de cada fila, recoger 25 µl y llevar a cabo diluciones dobles a lo largo de cada una de las 3 filas. Parar en el 7 pocillo ( último) y dejarlo sólo con diluyente A cada pocillo de la primera fila añadir 25 µl de látex sensibilizado A cada pocillo de la segunda fila, añadir 25 µl de control de látex A cada pocillo de la tercera fila, añadir 25 µl de látex sensibilizado Mezclar por rotación con microagitador o a mano. Tomar precauciones para que no se produzcan salpicaduras desde los pocillos.
4 PRT Página 4 de Para evitar la evaporación cubrir con una tapa y poner la placa en una caja húmeda Dejar la placa inmóvil sobre una superficie plana por 20 a 24 horas Leer sobre un fondo negro Eliminar los tubos centrífugas, jeringa de filtración, filtros de membrana, placas de microtitulación, tapas, puntas previa descontaminación en autoclave por 30 min. a 121 C 7.5 Interpretación de resultados: Los patrones de aglutinación deben juzgarse por comparación con la siguiente ilustración: Positivos son los resultados (+),(++),(+++) Los resultados de la fila 3 de pocillos donde se prueba el control toxina y el látex sensibilizado deben dar positivos Los resultados en la fila 2 de pocillos conteniendo muestra y látex control deben ser negativos Si filtrados o sobrenadantes de cultivos reaccionan con el látex sensibilizado a una dilución mayor que la observada con el látex control el resultado del test debe considerase positivo El último pocillo de todas las filas debe ser negativo ya que es sólo control del diluyente. Si se observan patrones positivos en estos pocillos la reacción debe considerarse no válido
5 PRT Página 5 de 9 8. REGISTROS Identificación del registro Registro Test Aglutinación Reversa Pasiva en Látex (Enterotoxina A en cepas de C. perfringens aisladas de Alimento) RG Almacenamiento Protección Recuperación Tiempo retención y disposición Archivador azul Acceso Papel 5 años y rotulado registro restringido al disposición en informes personal de la basura normal laboratorio 339. Sección partidos en Microbiología. trozos. 9. TABLA DE MODIFICACIONES Revisión Nº Pág. Modificada Motivo del cambio Fecha Aprobación 10. ANEXOS 10.1 Anexo N 1 Diseño de placa de microtitulación en V Anexo N 2 Esquema de microtitulación Anexo N 3 Preparación Medio de cultivo de Duncan y Strong modificado 10.4 Anexo N 4 Registro Test Aglutinación Reversa Pasiva en Látex (Enterotoxina A en cepas de C. perfringens aisladas ). RG
6 PRT Página 6 de 9 ANEXO N 1 DISEÑO PLCA MICROTITULACION EN V
7 PRT Página 7 de 9 ANEXO N 2 ESQUEMA DE TRABAJO MICROTITULACIÓN Fila 1 25 µl 25 µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl muestra diluyente diluyente diluyente diluyente diluyente diluyente diluyente + 25 µl eliminar Muestra 25 µl 1:2 1: 4 1: 8 1: 16 1: 32 1: 64 (-) µl látex 25 µl látex 25 µl látex 25 µl látex 25 µl látex 25 µl látex 25 µl látex sensibilizado sensibilizado sensibilizado sensibilizado sensibilizado sensibilizado sensibilizado Fila 2 25 µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl Muestra diluyente diluyente diluyente diluyente diluyente diluyente diluyente + 25 µl eliminar Muestra 25µ ml 1:2 1: 4 1: 8 1: 16 1: 32 1: 64 (-) µl látex 25 µl látex 25 µl látex 25 µl látex 25 µl látex 25 µl látex 25 µl látex Control control control control control control control
8 PRT Página 8 de Fila 3 25 µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl control Toxina diluyente diluyente diluyente diluyente diluyente diluyente diluyente + 25 µl eliminar Control Toxina 25µL 1:2 1: 4 1: 8 1: 16 1: 32 1: 64 (-) µl látex 25 µl látex 25 µl látex 25 µl látex 25 µl látex 25 µl látex 25 µl látex sensibilizado sensibilizado sensibilizado sensibilizado sensibilizado sensibilizado sensibilizado
9 PRT Página 9 de 9 ANEXO N 3 MEDIO MODIFICADO DE DUNCAN Y STRONG Preparación: Fórmula Extracto de levaduras Proteosa Peptona Almidón Soluble Tioglicolato sódico Na 2 HPO 4 x 7 H 2 O 4,0 g/ L 15,0 g/l 4,0 g/l 1,0 g/l 10,0 g/l Autoclavar a 121 C por 15 minutos. Añadir la suficiente cantidad de carbonato sódico 0,66 M esterilizado por filtración para incrementar el ph a 7,8 ± 0,1. Dispensar 16 a 18 ml de medio en tubos de 18 x180 mm con tapa rosca.
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