CINÉTICA DE CRECIMIENTO CELULAR
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- Nicolás Vera Pereyra
- hace 7 años
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1 CINÉTICA DE CRECIMIENTO CELULAR
2 Crecimiento Celular Estequiométrico: Aspectos fundamentales la concentración final de células depende de la concentración y composición del medio de cultivo. balance de materia y energía de los procesos de crecimiento celular. Cinético: velocidad en la que se desarrolla el proceso 2
3 Aspectos que intervienen en la interacción entre las células y el medio ambiente a lo largo de su crecimiento Condiciones ambientales (medio) multicomponente reacciones en solución equilibrio ácido-base. cambio de las propiedades reológicas multifásico (gas, líquido) distribución espacial no unifrome. nutrientes sustratos productos calor interacciones mecánicas Población celular multicomponente heterogeneidad en cada célula individual mutiples reacciones mecanismos de control interno adaptabilidad variabilidad genética
4 Modelos de crecimiento celular Modelos segregados Modelos no segregados Modelos estructurados Modelos no estructurados
5 No Estructurado Estructurado No Segregado Caso ideal Un solo componente. Descripción de las células como promedio Multicomponente. Descripción de las células como promedio. Segregado Un solo componente. Población celular heterogénea. Multicomponente. Población celular heterogénea. Caso real
6 Sistemas de cultivo Discontinuo (Batch) Continuo Discontinuo alimentado (Fed-Batch)
7 Bioreactores: Tanque de agitación mecánica 45
8 Cultivo Batch o Discontinuo V constante Xo Po So f X S f P f
9 Continuo Reservorio S R F I = F S F I F S V constante X P S X S P
10 Discontinuo alimentado (fed-batch). F, S R X VX V F V 0 S 0 VP
11 Discontinuo (batch). Características Tiempos cortos de procesos lo que permite trabajar en condiciones asépticas, sobre todo cuando se trata de medios de cultivos ricos en nutrientes. Períodos muertos: lavado, esterilizado, etc. Opera a baja densidad celular. Las concentración de los distintos componentes varía a lo largo del proceso.
12 Distintas fases en el crecimiento de un organismo en un proceso en batch
13 Discontinuo (batch). Suponemos que las células crecen en condiciones homogéneas en cuanto a transferencia de nutrientes (fte. de carbono, nitrógeno, minerales, vitaminas, etc.) Las concentraciones de nutrientes y de biomasa del cultivo varían a través del tiempo. El crecimiento de un microorganismo puede describirse a través de una ecuación exponencial de acuerdo a: Xn = Xo * 2 n (1) Xn = biomasa después de n generaciones Xo = biomasa inicial n = número de generaciones
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15 También puede decirse que la biomasa se incrementará en dx en un determinado intervalo de tiempo dt de acuerdo a la ecuación: dx = Xo m (2) dt donde µ es la velocidad específica de crecimiento de un organismo y tiene unidades de t -1 (min -1, h -1 o d -1 ). Integrando la ecuación 2 se obtiene: Discontinuo (batch). la velocidad específica de crecimiento depende: características intrínsecas del organismo factores externos (fte. de carbono, O2, T, etc.) Xt = Xo * e m t (3) o bien ln Xt = ln Xo + m * t (4)
16 Cálculo de parámetros cinéticos en cultivos en batch Graficando ln X vs. tiempo el cálculo de la recta de regresión en la zona de crecimiento exponencial es igual a m. También es posible calcular la fase lag de acuerdo a lo que se describe en el gráfico. Figura 2: Gráfica ln X vs. tiempo, calculo de m y de la fase lag
17 Discontinuo (batch). Otro parámetro importante a conocer en un proceso en batch es el tiempo de duplicación de la biomasa (td), por la ecuación 4 podemos reemplazar t = td y Xt= 2 Xo ln 2Xo = ln Xo + m * td (5) m = ln 2 = td td (6) td = m (7)
18 lag Fase Descripción µ Las células se adaptan al nuevo ambiente µ 0 aceleración Comienza el crecimiento µ < µ µmax exponencial desaceleración Se alcanza la velocidad máxima de crecimiento Crecimiento disminuye por falta de nutrientes o inhibidores µ = µ µmax µ < µ µmax estacionaria Se detiene el crecimiento µ = 0 muerte Las células pierden viabilidad y se lisan µ < 0
19 Influencia del substrato limitante en el crecimiento microbiano La biomasa final obtenida es un proceso de cultivo esta dada por la relación de rendimiento: Y X/S = ΔX ΔS (8) Yxs= gr. de peso seco de biomasa obtenida por gr. de substrato consumido.
20 El primero en establecer una relación entre la concentración de substrato limitante y la velocidad de crecimiento fue Monod y hallo que se correspondía con una hipérbola rectangular similar a la descripta por Michaelis-Menten para un proceso enzimático estableciendo la siguiente relación: µ = µ max s K S + s (9)
21 Representación gráfica del modelo de Monod de sustrato limitante
22 Donde µ max = es la máxima velocidad de crecimiento; s es la concentración de substrato limitante y Ks= constante de saturación de substrato y es igual a la concentración de substrato que da una velocidad de crecimiento de µmax /2. Si reemplazamos la ecuación 9 dentro de la 2 queda: dx dt = µ max s K S + s * Xo (10) dx dt = Xo µ Si s>> Ks, s/(ks+s) tiende a uno entonces el organismo crece a µ max conforme s tiende a Ks entonces s/(ks+s) tiende a cero reduciendo el crecimiento.
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29 Energía de activación para el crecimiento microbiano.
30 Efecto de la temperatura sobre m m de un cultivo aeróbico en glucosa de A. aerogenes
31 Cinética de crecimiento en cultivos con plásmidos Posibilidad de pérdida del plásmido Mutación del plásmido Diferencia de velocidad de crecimiento entre población con y sin plásmidos
32 X + : población con plásmidos X - : población sin plásmidos dx + = (1-p) * X + * m + dt dx - = p * X + * m + + X - * m - dt p: probabilidad de pérdida de plásmidos
33 F = X + X + + X - F: fracción de células con plásmidos. F = 1 - a - p 1 - a - 2 n( a + p - 1) p Donde a = m - m + n = m + * t ln 2
34 Relación de velocidad de crecimiento en poblaciones libres y que portan plásmidos.
35 Fracción de la población que porta plásmidos en un cultivo en batch después de 25 generaciones
36 Otros modelos de crecimiento El modelo logístico describe el crecimiento de una población al momento del inicio del crecimiento de acuerdo a la siguiente ecuación: m = m max * [ 1 - X ] Xf al inicio X<<Xf y [1-X / Xf ] tiende a 1 entonces el organismo crece a µ max en cambio cuando X = Xf [1-X / Xf ] tiende a 0 y dx/dt =0 entonces el crecimiento se detiene debido que la población llega a su densidad máxima. Si queremos evaluar entonces la velocidad de consumo de substrato reemplazamos por la ecuación 11 y queda: m max * [ 1 - X ] * X ds = Xf dt Yxs
37 Fase lag Aparte de la forma gráfica descripta para hallar la duración de la fase lag, otros autores ha descripto otras formas matemáticas como ser: t lag = t * lg X / Xo m max y también puede modificarse la ecuación de Monod : (-t/t m = m max * s 1- e Ks + s lag)
38 Cálculo de parámetros cinéticos en cultivos en batch Graficando ln X vs tiempo el cálculo de la recta de regresión en la zona de crecimiento exponencial es igual a µ. También es posible calcular la fase lag de acuerdo a lo que se describe en el gráfico.
39 Cinética de muerte celular La cinética de muerte celular puede describirse por la ecuación: k D = - 1 X dx dt Y haciendo la corrección en la ecuación 3 que describe el crecimiento de un microorganismo queda: Xt = Xo e ( µ-kd ) t El factor k D es importante en procesos como los de degradación de efluentes, cuando se trabaja a bajas velocidades de crecimiento cuando se usan inóculos de baja viabilidad.
40 Modificaciones de las ecuaciones de Monod calculando la fase lag y la velocidad de muerte celular
41 Un incremento de biomasa dx se deberá a consumo ds y esa relación esta dada por la formula de rendimiento Yxs = dx ds entonces la velocidad de consumo de substrato si reemplazamos por la ecuación 2 se transforma en: - ds = m max * X dx = Xo m dt Yxs dt o bien donde q S qs = m Velocidad de consumo de substrato - ds = qs * X dt es la velocidad específica de consumo de substrato Yxs q S tiene unidades de gr. de substrato limitante consumido por gr. de biomasa por tiempo (gr. sust * gr X -1 * h -1 ).
42 Energía de mantenimiento: m S En todo proceso además del substrato que se consume para crecimiento existe una energía necesaria para el mantenimiento de la biomasa (m S ), esta energía es utilizada por la célula para, por ejemplo mantener gradientes, ph, turnover de macromoléculas, etc. Se expresa en unidades de substrato consumido por gr. de X por tiempo. Podemos decir entonces que en todo proceso parte de la fuente de carbono será consumida para el crecimiento y parte para el mantenimiento. Por la estimación del coeficiente de mantenimiento podemos recalcular lo que es el Y XS para crecimiento (Y XS verdadero) del Y XS observado por las siguientes ecuaciones, donde tenemos que la velocidad de consumo de substrato va a tener dos términos uno para el crecimiento y otro para el mantenimiento: ds = ds + ds dt dt M dt G ds dt ds dt M G consumo de substrato para mantenimiento consumo de substrato para crecimiento
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44 Formación de Productos Productos de bajo peso molecular Productos de alto peso molecular 1) Componentes estructurales. 2) Enzimas (intra o extracelulares).
45 Clasificación de los productos de fermentación de bajo peso molecular Productos directamente asociados con la generación de energia en la célula (asociados al crecimiento): etanol, acido acético, ac. láctico, productos de las fermentaciones anaeróbicas. Productos indirectamente asociados con la generación de energía (semiasociados al crecimiento):, aminoacidos, nucleótidos. Productos cuya síntesis no está claramente ligada directa o indirectamente a la generación de energía (no asociados al crecimiento): antibioticos, vitaminas.
46 Formación de productos 1 Asociado al crecimiento 2 Semiasociado al crecimiento 3 No asociado al crecimiento X( ) P(---) Tiempo Tiempo Tiempo
47 Cinética formación de productos Básicamente pueden describirse tres tipos de procesos con respecto a la formación de producto : asociados al crecimiento parcialmente asociados no asociados al crecimiento A continuación se describe tres fórmulas de rendimiento de importancia: producción de producto en función del sustrato Y P/S = ΔP ΔS
48 Cinética formación de productos Y PX = Y PS Yxs producción de producto en función de la biomasa Es también posible formular la ecuación de formación de producto a través del tiempo según: dp = a * dx + b * X dt dt donde a es una constante asociada al crecimiento y b es una constante que no esta asociada al crecimiento. Y también podemos definir q P s decir la velocidad específica de producción del producto q P = Y PX * m
49 Distintos Tipos de cinética de formación de productos
50 Productividad de una fermentación en batch Q p o P = X t t = 1 * ln X + t lag + t est + t lim m max Xo
51 Medidas de Performance de un Bioproceso Productividad mg / gr biomasa * h mg / L * h Mas importante porque describe cuanto tiempo puede durar el bioproceso Máxima Concentración de Producto mg / L (importante cuando el costo de la recuperación y purificación del producto representa un porcentaje alto en el costo total del bioproceso) Rendimiento de Producto gr de producto / gr de substrato (importante cuando el costo nutriente representa un porcentaje alto en el costo total del bioproceso, no muy usual)
52 Inhibición del crecimiento Alta concentración de sustrato y/o productos, cambios en las propiedades fisico-químicas del medio :presión osmótica, fuerza iónica, constante dieléctrica, y actividad de solutos, pueden alterar la fluidez de las membranas.
53 Posibles mecanismos de la acción de inhibidores Alteración de permeabilidad celular Alteración de la actividad de las enzimas Disociación de agregados enzimáticos Afecta la síntesis de enzimas Influencia en la actividad funcional de las células
54 Inhibición por sustrato Andrews y Noack Inhibición por producto Jerusalimsky y Neronova Otros modelos 1 = m Ks + S + S 2 Kis = m S Ks + S Kip Kip + P
55 Modificaciones del Modelo de Monod. Inhibición por altas concentraciones de substrato m = m max * s * 1 Ks + s (1+ (s / K is)) donde Ki es la constante de inhibición. Inhibición del crecimiento debido al producto m = m max * s * K ip Ks + s K ip + p donde K i,p es la constante de inhibición del producto y p es igual a la concentración del producto
56 Modificaciones del Modelo de Monod. Modelo de inhibición del crecimiento debido al producto de Luong: m = m max * 1 - P i n P i * Donde P i es la concentración de producto y P i * es la concentración crítica de producto en las cuales el crecimiento es cero. Y donde n es una constante que surge de graficar (ver gráfico ): ln 1 - m = n lnp i - n lnp i * m max de no conocerse P i * debe hallarse por prueba de ensayo y error para aquella recta de regresión que mejor ajuste tenga donde la pendiente será igual a n.
57 n ln Pi* 0 ln [ 1- µ/µmax] n -3 ln P
58 Modificaciones del Modelo de Monod. Otros modelos describen los casos para cuando se dan múltiples inhibiciones de productos y substratos, m = m max * 1 - C i n * 1 - P i n C i * P i *
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