Los principales mecanismos que intervienen en la separación cromatográfica son:

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Rubén Lagos Murillo
hace 7 años
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1 TP 8 CROMATOGRAFIA EN PAPEL, Introducción Los métodos cromatográficos son un conjunto de técnicas empleadas para separar compuestos químicos de una mezcla. Su nombre significa escribir con color ya que la cromatografía fue empleada por primera para separar pigmentos. Existen numerosas variantes del método, pero el fundamento es común a todos los métodos: Una Fase Móvil se mueve a través de una Fase Estacionaria arrastrando en su camino las moléculas de una muestra. Estas interaccionan de forma diferentes con las fases, por lo cual algunas avanzan rápido y otras mas lento, logrando así la separación Los métodos cromatográficos pueden ser clasificados según: El estado físico de la fase El mecanismo de separación El tipo de soporte. La dirección de la corrida Según el estado de las fases tenemos que la fase móvil puede ser un gas o un líquido, mientras que la estacionaria puede ser un líquido o un sólido. Se pueden establecer cuatro tipos de cromatografia: gas-líquido, líquido-líquido, gas-sólido, líquido-sólido. Existen numerosos mecanismos de interacción entre los componentes de la mezcla y las fases del sistema cromatográfico. En algunos casos participan más de un mecanismo en un mismo proceso de separación por lo que dificulta la clasificación. Los principales mecanismos que intervienen en la separación cromatográfica son: Adsorción: Gases o líquidos contenidos en la fase móvil son retenidos por una adsorción selectiva en la superficie del sólido que constituye la fase estacionaria.. Este mecanismo controla la cromatografía gas-sólido y líquido-sólido. La muestra aplicada en la capa es adsorbida en la superficie del material por la acción de fuerzas electrostáticas (fuerzas de Van der Waals, puentes de Hidrógeno, efectos inductivos, etc). 42

2 Reparto: Los componentes de la fase móvil son retenidos por la fase estacionaria liquida en función de su solubilidad en ella. Si las dos son liquidas se tiene un proceso de extracción en continuo. Intercambio Iónico: La fase estacionaria constituida por un sólido intercambiando iones con iones contenidos en la fase móvil, liquida. El intercambio de iones sólido-solución esta regulado por la afinidad química de los iones con ambas fases y por sus respectivas concentraciones. Tamaño Molecular: Especies neutras de alto peso molecular pueden ser separadas en virtud de su tamaño donde la fase estacionaria es un gel hidrofílico altamente poroso que retiene las moléculas de menor tamaño al de los poros. Las moléculas de mayor tamaño son retardadas en su paso por pequeñas fuerzas de adsorción de la superficie externa del gel que luego son excluidas de la fase estacionaria. Respecto al soporte son varias las formas que existen, se llama soporte inerte si no participa en la separación y soporte activo si participa en el proceso de separación. La dirección de la corrida puede ascendente, descendente o bidireccional. La fase móvil puede ser un único solvente o bien una mezcla de ellos, lo cual permite lograr fases de polaridades intermedias. A continuación se muestra la serie eleutrópica de polaridad creciente de los solventes más comunes ETER DE PETROLEO HEXANO TETRACLORURO DE CARBONO BENCENO CLORURO DE METILENO CLOROFORMO ETER ETILICO ACETATO DE ETILO ACETONA PIRIDINA ETANOL METANOL AGUA Dentro de las múltiples variables encontramos la cromatografía en papel. Es una técnica de separación e identificación de sustancias químicas mediante un disolvente que se mueve sobre hojas o tiras de papel de filtro u papeles especialmente diseñados. La cromatografía en papel se utiliza para compuestos muy polares o polifuncionales. El uso más común es para azúcares, 43

3 aminoácidos y pigmentos naturales La fase móvil se desplaza a través del papel, arrastrando los componentes de la mezcla a distintas velocidades En esta cromatografía se utiliza el fenómeno de reparto en donde la fase estacionaria se halla sobre un soporte activo (el papel) que en realidad forma parte de la fase estacionaria que es un complejo celulosa-agua Parte experimental Objetivos: Separar mediante cromatografía de partición en papel los hidratos de carbono presentes en una muestra. Separar mediante cromatografía de partición en papel los aminoácidos de una muestra dada. Separación y detección de Hidratos de carbono Extracción de la muestra Exprimir 5 ml de jugo de naranja, limón o tomate. Centrifugar a 3000 rpm por 3 minutos. A 1 ml de sobrenadante agregar 3 ml de etanol para precipitar las proteínas y sales. Centrifugar a 3000 rpm por 3 minutos Preparación de la cuba Colocar 1 cm aproximadamente de fase móvil acetato de etilo: piridina: agua (55:25:20). Esto permite saturar la cuba con vapores de la fase móvil para obtener un frente de corrida homogéneo Siembra Se aplican muestras en solución a no menos de 1,5 cm del borde inferior de una tira rectangular de papel, y a no menos de 1,5 cm de los bordes laterales, manteniendo a su vez, entre mancha y mancha una distancia no menor de 1 cm. Se hace un toque con el capilar, se evapora el solvente, se hace otro toque, tratando de concentrar la muestra sin superar un diámetro de la mancha de 3 mm. La siembra es puntual para fines analíticos, y en banda para fines preparativos. Tomar un capilar para cada muestra a sembrar Sembrar 3 gotas del extracto de jugo 44

4 Sembrar 3 gotas de una muestra problema. Sembrar 3 gotas del standard de glucosa Sembrar 3 gotas del standard de fructosa Sembrar 3 gotas del standard de ribosa Revelado: Si los compuestos de la mezcla fuesen coloreados, las manchas serian visibles directamente. De lo contrario habrá que revelarlas. Algunos reveladores empleados son: Luz UV: si los compuestos absorben esta radiación las manchas se verán con fluorescencia. Reactivos de color: específicos para cada compuesto. Se deberá tener en cuenta que no se pueden usar reveladores que destruyan el papel como el ácido sulfúrico o el calor. Vapores de yodo sublimado: es un revelador universal. Revelador para Hidratos de carbono Nitrato de plata 40% (para usar diluir 1:40 en acetona) NaOH en etanol (1ml NaOH 1N + 20 ml etanol) Tiosulfato de sodio 2,5 % La reacción en medio alcalino es la siguiente: Reacción principal: Ag Agº Reacción secundaria Ag Ag 2 O Los reactivos deben estar en solución no acuosa para no disolver los azúcares. Una vez esparcido el nitrato de plata, se deja secar y se lava con NaOH y se fija con Tiosulfato, para evitar que se desvanezcan las manchas y para solubilizar el exceso de oxido de plata. Evaluación La evaluación requiere el cálculo de la relación de frentes para cada muestra Rf = distancia recorrida por la muestra / distancia recorrida por el frente Separación y detección de aminoácidos Extracción de la muestra Exprimir 5 ml de jugo de naranja, limón o tomate. 45

5 Centrifugar a 3000 rpm por 3 minutos. A 1 ml de sobrenadante agregar 3 ml de etanol para precipitar las proteinas y sales. Centrifugar a 3000 rpm por 3 minutos Preparación de la cuba Colocar 1 cm aproximadamente de fase móvil etanol: agua: amoníaco (80:10:10). Esto permite saturar la cuba con vapores de la fase móvil para obtener un frente de corrida homogéneo Siembra Se aplican muestras en solución a no menos de 1,5 cm del borde inferior de una tira rectangular de papel, y a no menos de 1,5 cm de los bordes laterales, manteniendo a su vez, entre mancha y mancha una distancia no menor de 1 cm. Se hace un toque con el capilar, se evapora el solvente, se hace otro toque, tratando de concentrar la muestra sin superar un diámetro de la mancha de 3 mm. La siembra es puntual para fines analíticos, y en banda para fines preparativos. Tomar un capilar para cada muestra a sembrar Sembrar 3 gotas del extracto de jugo Sembrar 3 gotas de una muestra problema. Sembrar 3 gotas del standard de aspartico Sembrar 3 gotas del standard de alanina Sembrar 3 gotas del standard de lisina Revelado Esparcir ninhidrina 0,2% en acetona sobre el papel y luego calentar a 100 C durante 15 minutos Evaluación La evaluación requiere el cálculo de la relación de frentes para cada muestra Rf = distancia recorrida por la muestra / distancia recorrida por el frente 46

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