INVESTIGACIÓN. Hincapié O., Sánchez P, Gómez A., Martínez J, Riuadeneira F., Barreto A.*, Parra C.***

Transcripción

1 INVESTIGACIÓN ESTANDARIZACIÓN DE LAS TÉCNICAS DE ELISA Y WESTERN BLOT PARA LA DETERMINACIÓN DE UNA PROTEINA DE COMPROMISO AUTOINMUNE EN PACIENTES CON ENFERMEDAD DE MENIERE Hincapié O.*, Sánchez P*, Gómez A.**, Martínez J**, Riuadeneira F.**, Barreto A.***, Parra C.*** The serum of patients with Meniere's disease was analyzed by means of Elisa and Western Blot techniques to determine if an inmmunoreactivity exists against the protein HSP70 expressed in bovine kidney. Patients with normal hearing and without family history of otologic illnesses were used as control groups. 90.9% of the patients with Meniere's disease presented antibodies that reacted against the protein of 70KDa in the extract of bovine kidney. The reactivity incidence in the control groups was 9.1%(p<.001). El suero de pacientes con la enfermedad de Meniere se analizó por medio de las técnicas de Elisa y Western Blot para determinar si existía inmunoreactividad contra la proteína HSP70 expresada en riñon bovino. Pacientes con audición normal y sin antecedentes familiares de enfermedades otológicas se usaron como grupo control. El 90.9% de los pacientes con la enfermedad de Meniere presentaron anticuerpos que reaccionaron contra la proteína de 70KDa en el extracto de riñon bovino. La incidencia de reactividad en el grupo control fue de 9.1% (p c.001). Palabras claves: anticuerpos, Elisa, enfermedad de Meniere, proteína HSP70 de riñon bovino, Western Blot, autoinmunidad. INTRODUCCIÓN La pérdida neurosensorial de la audición es el resultado de la disfunción o daño del oído interno en la sección coclear del VIH par craneal. Esta lesión pue- * Estudiantes Bacteriología. RU.J. ** Instituto de Genética Humana RU.J. *** Laboratorio de Inmunobiología RU.J. de ser producto de diversas etiologías intra o extra cocleares. La presbiacusia (pérdida de audición por envejecimiento) es la causa más común de la pérdida auditiva neurosensorial bilateral. A pesar de que se ha dilucidado enteramente la fisiopatología de la mayoría de estos procesos hay varias formas de pérdida auditiva neurosensorial coclear cuya causa y patogénesis aún no son claras y en las cuales se sospecha una etiología autoinmune. (4) 32 Laboratorio Actual Año 17 No. 33 Noviembre de 2000

2 En las enfermedades de origen autoinmune, hay una alteración en el reconocimiento de lo propio, llevando a la producción de autoanticuerpos y consecuente destrucción de tejidos. La enfermedad de Meniere se caracteriza por una tríada de síntomas que incluyen: 1) tínnitus (ruidos y zumbidos), 2) pérdida neurosensorial de la audición fluctuante, y 3) ataques episódicos de vértigo. La enfermedad de Meniere se presenta más frecuentemente entre la tercera y la quinta década de la vida, aunque adultos jóvenes y mayores no están exentos de padecerla. El vértigo suele aparecer en episodios bien definidos, el cuadro a menudo es postrante, con frecuencia acompañado de náuseas y vómitos que persisten por un lapso prolongado. Durante el ataque, siempre existe nistagmus vestibular espontáneo (movimientos involuntarios del ojo). Entre los episodios se observa intolerancia al movimiento, vértigo relacionado con la posición, caídas y ataxia momentánea. (31) Hasta el momento no existe una prueba de alternativa estandarizada y específica que determine cuáles pacientes presentan autoinmunidad en oído y/o cuáles pueden beneficiarse del tratamiento con corticosteroides. Este último recurso se ha basado en la intuición del médico tratante y el uso de pruebas inespecíficas de laboratorio para la detección de autoinmunidad, tales como VSG, proteína C reactiva, anticuerpos antinucleares (ANAS), factor reumatoide, inmunoglobulinas séricas o críoglobulinas y pruebas de proliferación linfocitaria. Para determinar de una manera específica si hay presencia de autoanticuerpos contra antígenos de membrana coclear, se propuso estandarizar las pruebas de ELISA y Western Blot como un complemento diagnóstico que detecta autoinmunidad en oído interno, específicamente para la enfermedad de Meniere y la Pérdida Progresiva Neurosensorial Bilateral de la Audición. De la misma forma se podría contribuir a dilucidar la eficacia del tratamiento con corticosteroides y el posible desarrollo de nuevas terapias inmunomoduladoras. MATERIALES Y MÉTODOS Población de estudio La población de estudio fue una muestra por conveniencia de once pacientes con diagnóstico clínico de enfermedad de Meniere que consultaron el servicio de otorrinolaringología en las diferentes instituciones, los cuáles fueron sometidos a los criterios de inclusión y exclusión (mayor de 65 años, pérdida auditiva menor a 24 horas, barotrauma, trauma acústico, trauma craneoencefálico y lesión penetrante en el oído) Para el grupo control negativo se tomaron sujetos sin antecedentes de hipoacusia que fueron sometidos a exámenes, teniendo en cuenta los criterios de exclusión. Obtención del extracto antigénico La proteína alrededor de los 70Kda fue aislada de extracto renal bovino, previamente demostrado que contenía una proteína altamente análoga, desde el punto de vista inmunológico a la proteína de 68KDa de membrana coclear humana y extracto de oído interno bovino. (24) La literatura demuestra que la proteína blanco fue separada por peso y carga realizando electroforesis preparativa en gel de poliacrilamida, y transferida a un papel de nitrocelulosa. La membrana con la proteína fue digerida con tripsina y los péptidos resultantes fueron separados por cromatografía líquida de alta resolución. La secuencia de la cadena de 22 aminoácidos de este péptido fue idéntica a la secuencia parcial de aminoácidos 213 a 234 de HSP70 bovina (Genbank accession N U02891, National Center for Biotechnology Information): Q T Q I F T T Y S DN Q P G V L! Q V Y EG La secuencia también fue idéntica a la correspondiente a los aminoácidos 424 a 445 de la cadena larga de HSP70 humana (Genbank accession N MI 1717, National Center for Biotechnology Information). (24) Basados en estos estudios se decidió utilizar riñon bovino como antígeno, teniendo en cuenta la facilidad de extracción y la cantidad de proteína expresada. Obtención del extracto de riñon bovino El riñon bovino fue obtenido a partir de un novillo de 2 años de edad, del frigorífico local, en condiciones de asepsia y empacado en hielo para ser transportado al laboratorio. Se retiró totalmente la grasa y el tejido conectivo del riñon, se realizaron dos lavados con PBS ph 7.4, se cortó en pequeñas piezas y se alicuotó en tubos que contenían 40ml de PBS con PMSF y Azida de Sodio. El riñon fue homogenizado aproximadamente 3 minutos y filtrado por gasa estéril. Se alicuotó en tubos nuevos de polipropileno de 50ml y se realizó sonicación por 60 minutos, se centrifugó a 1550g por 30 minutos a 4 C de temperatura (IEC Centra MP4R International Equipment Company) y se filtró nuevamente por membranas de 2.5um, 0.45 um y de 0.22 um respectivamente en condiciones de esterilidad. Laboratorio Actual Año 17 No. 33 Noviembre de

3 Cuantificación de proteínas La cuantificación proteica del extracto se efectuó por el método de Bradford, para conocer la concentración proteica total y determinar una concentración conocida para ser usada en el Elisa y el Western Blot. La concentración de proteína oscila entre ug/ml y 7825 ug /mi. Electroforesis SDS - PAGE La electroforesis fue realizada de acuerdo al método descrito por Laemmli.(36) Gel de corrido al 10 % (ph 8.8) y un gel de concentración al 4% (ph 6.8). Teniendo en cuenta la cuantificación de proteína se sembraron 30ug/20ul del extracto de riñon bovino suspendido en buffer de muestra, la solución resultante se calentó durante cinco minutos en ebullición para denaturar las proteínas. En algunos casos se añaden estándares precoloreados de peso molecular conocido, se le aplicaron 60mÁ y 120 voltios de corriente por gel hasta que haya un corrido que se detenga 1.5 cm sobre la base de las placas (aproximadamente tres horas). Las proteínas separadas se colorearon con azul brillante de Coomassie (R- 250) y se decoloró con metanol (cuatro partes), ácido acético (una parte) y agua destilada (cinco partes) y se transfirió inmediatamente a la membrana de nitrocelulosa. Transferencia de las proteínas a la membrana de nitrocelulosa Después de la electroforesis las proteínas fueron transferidas a la membrana de nitrocelulosa en buffer de transferencia ph 8.3. Se le aplicó una corriente de 350mÁ y 100 voltios por 1 hora y 5 minutos, durante el cual se realizó enfriamiento activo del buffer. Después de la transferencia, las membranas se colorearon con Rojo de Ponceau por 15 minutos. WESTERN BLOT Las membranas de nitrocelulosa fueron bloqueadas durante 30 minutos, con TBS 0.2% tween y 5% leche descremada. El papel se incubó con el primer anticuerpo (suero dilución 1/5) 1 hora a temperatura ambiente en agitación constante. por 50 minutos a temperatura ambiente, en agitación constante y en oscuridad. Se realizaron lavados. Las tiras se impregnaron con una solución reveladora para la peroxidasa (Luminol) durante 1 minuto y se realizó una impresión sobre una placa fotográfica especial para quimioluminiscencia. Se reveló con las técnicas convencionales de fotografía. ELISA Se sensibilizó la placa con looul del extracto de riñon bovino en una concentración de l.oug/ml de la proteína, diluido en buffer carbonato ph 9.2. Se incubó 1 hora a 37 C y toda la noche a 4 C. Se lavó 2 veces con PBS IX ph % tween. Se bloqueó con PBS IX ph 7.2, 5% leche descremada 2 horas a temperatura ambiente en oscuridad. Se adicionaron los sueros dilución 1/100 con PBS IX ph 7.2, 2.5% leche descremada. Se incubó 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad y se realizaron 6 lavados; se adicionó el conjugado (anti IgG humana* PO.) en dilución 1/ Se incubó 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad y se realizaron nuevamente los lavados, finalmente se incubó 30 minutos a temperatura ambiente el sustrato OPD (Ortofenilendiamina) en oscuridad y se frenó la reacción con Ácido Sulfúrico 2.5N, para leerla en el lector de Elisa (Multiskan MCC/340P versión 2.33), a 492nm contra blanco de sustrato. RESULTADOS Electroforesis de las proteínas del extracto de riñon bovino En la figura 1 se observa el extracto de riñon a diferentes diluciones. Teniendo en cuenta el marcador de peso molecular precoloreado se pudo determinar la presencia de la proteína de 68-70KDa, que es la de interés para el desarrollo de presente estudio. 70kDa Figura 1. Electroforesis SDS page El papel se lavó en cinco ocasiones por 5 minutos cada uno, con buffer TBS 0.2% tween 20. El papel se hace reaccionar con una inmunoglobulina polivalente antihumana de cabra conjugada con peroxidasa (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo, dilución 1:3000) 34 Laboratorio Actual Año 17 No. 33 Noviembre de 2000

4 En las líneas 1 y 6 el extracto se encuentra en una dilución de 1/ 2, en 2 y 7 dilución 1/ 4, en las 3 y 8 dilución 1 / 8 y en la línea 4 dilución 1/10, en la línea 5 se encuentra el marcador de peso molecular precoloreado que contiene las proteínas de 220kDa, 130kDa, 90kDa, 70kDa, 60kDa, 40kDa, 30kDa, 20kDa, 19kDa, y lokda. ELISA Los sueros de los pacientes con enfermedad de Meniere fueron analizados para detectar la presencia de autoanticuerpos que reconocieran la proteína HSP70 de riñon bovino, frente a los sueros del grupo control. TABLA 1. Comparación de promedios de absorbancia entre casos y controles con el extracto de riñon bouino y PBS. Pacientes PBS PBS PBS PBS n=11 pg ELISA-1 ELISA-2 ELISA-3' ELISA-4 Casos Media E E-02 D.E E E-02 Controles Media E E-02 D.E E E-02 Total Media E E-02 D.E E E-02 Pacientes EXTRACTO EXTRACTO EXTRACTO EXTRACTO n=11 pg ELISA-1 ELISA-2 ELISA-3 ELISA-4 Casos Media D.E E E-02 Controles Media D.E Total Media D.E Tabla 2. Comparación de promedios de absorbancia entre casos y controles con control de ruido de fondo. n=llpg Tabla 3. Comparación del promedio de los cuatro Elisa con control de ruido de fondo. Pacientes Media D.E Caso E- Control Tota No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre las mediciones de absorbancia de casos y controles en los Elisa (p> 0.05), resultado que puede ser dado por un bajo tamaño de muestra y por lo tanto no permite descartarla como prueba de tamizaje de autoinmunidad. WESTERN BLOT Múltiples ensayos de esta técnica fueron realizados a los pacientes positivos y los controles. El control positivo se observó claramente, lo cual indica que no hay errores de la técnica o reactivos defectuosos. El índice de positividad en la.población enferma es del 90.9% frente a un 9.1% en los controles. (p< 0.001). La razón de riesgo fue de 100, con un intervalo de confianza del 95% (5.5 a ). Este Western Blot demuestra la alta fidelidad de la prueba entre los pacientes con la enfermedad y la existencia de una fuerte banda en la región alrededor de peso molecular de 70kDa. La precisión se debe mejorar con un mayor tamaño de muestra. El Western Blot debe ser evaluado en una muestra mayor, con el objeto de obtener las características operativas (sensibilidad y especificidad), para determinar el rendimiento como prueba de ayuda diagnóstica de autoinmunidad de oído interno. Figura 2. Western Blot de grupo control. Pacientes ELISA-1 ELISA-2 ELISA-3 ELISA-4 Casos Media D.E E E-02 Controles Media D.E Total Media D.E Ac. HSC Laboratorio Actual Año 17 No. 33 Noviembre de

5 En la figura 2, la línea 1 corresponde al anticuerpo policlonal HSC70. Las líneas 2 a la 12 son los sueros del grupo control. En la línea 9 se observa una banda a la misma altura del control de HSC70 y dos más de bajo peso molecular. Figura 3. Western Blot de Pacientes con enfermedad de Meniere. Ac. HSC Como prueba diagnóstica el Elisa no se emplearía basándose en los resultados, sin poder descartar un error tipo II. Desde la perspectiva inmunológica hay que considerar también que el extracto crudo de riñon expresa otras proteínas (como se observa en la electroforesis), y podrían tener una reacción cruzada con los sueros de los pacientes, así como en el grupo control, impidiendo visualizar la reacción de la proteína en estudio con los sueros. La presencia de una alta reactividad de los sueros control, puede ser explicada, si se toma en cuenta que en un extracto crudo de riñon se encuentran diferentes proteínas expresadas en gran cantidad. En la figura 3, la línea 1 corresponde al anticuerpo policlonal HSC70. Las líneas 2 a la 12 son los sueros de los pacientes diagnosticados con enfermedad de Meniere. En la línea 5 se observa negativa para la proteína HSC70, las líneas 6 y 7 aunque tienen mucho ruido de fondo se pueden observar las bandas a la altura de la HSC70, y en la línea 10 se ve la presencia de la banda de 70kDa muy leve y una marcada banda de un peso molecular más bajo. DISCUSIÓN La enfermedad de Meniere y la pérdida progresiva neurosensorial de la audición son entidades que en algunos casos son causadas por procesos autoinmunes. Estas etiologías son diagnosticadas clínicamente por sintomatología y pruebas no específicas para oído interno. Por lo cual se propone establecer pruebas diagnósticas que orienten hacia un tratamiento inmunosupresor. En 1990, estudios realizados por Harris y Sharp, demostraron la presencia de anticuerpos en el suero de pacientes con enfermedad de Meniere, los cuales reaccionaron contra la proteína de 68kDa expresada en la membrana coclear y que es homologa en un 99% a la expresada en riñon como lo demostraron Moscicki y colaboradores en (2,23) Esta homología permitió que este trabajo se llevara a cabo con extracto de riñon bovino, debido a su fácil manipulación y consecución. Se realizaron pruebas de Elisa, en las cuales fue imposible considerar desde la perspectiva estadística la posibilidad de estar cometiendo un error tipo II o b, es decir, no tener un instrumento con suficiente poder para encontrar diferencias, si realmente existen, dado en este caso, por un bajo tamaño de muestra. Otra posible causa del aumento del ruido de fondo, podría ser consecuencia del consumo de productos lácteos y carnes por parte de los sujetos de estudio, que puede llevar a la producción de anticuerpos contra algunas proteínas expresadas en el riñon. A pesar de que fue imposible lograr que la prueba de Elisa presentara valores significativos, los resultados no dejan de ser importantes para establecerla como prueba piloto y así mejorarla en posteriores investigaciones, teniendo en cuenta la purificación de la proteína en estudio. Las pruebas de Western Blot fueron practicadas con el fin de demostrar el reconocimiento específico de los anticuerpos presentes en el suero contra la proteína HSP70, a pesar de haber encontrado una asociación estadísticamente significativa (p< 0.001), para la continuidad del trabajo se procurara mejorar la precisión de los resultados aumentando el tamaño de muestra en la continuidad del estudio. De los 11 pacientes analizados 10 (90.9%) reaccionaron contra la proteína HSP70 y solo un paciente del grupo control (9.1%) fue positivo. La presencia de valores significativamente altos, en el Western Blot evidencian un compromiso autoinmune en esta enfermedad. AGRADECIMIENTOS Los autores agradecen por el apoyo brindado a la Pontificia Universidad Javeriana, al Instituto de Genética Humana de la Pontificia Universidad Javeriana, al Hospital Militar Central, Hospital Universitario San José, Clínica de la Policía y la Clínica Fundación Santa Fe de Bogotá. Así como por la asesoría y sugerencias a los doctores Diana Quijano, Vicente Rodríguez y José Sanmartín. 36 Laboratorio Actual Año 17 No. 33 Noviembre de 2000

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