Metodología y aplicaciones de la amplificación de material genético: Introducción a la bioinformática.

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1 Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular Práctica 3 Metodología y aplicaciones de la amplificación de material genético: Introducción a la bioinformática. Curso 1 Medicina (Abril) 2012 BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR HUMANA Mohammed Rafii-El-Idrissi Benhnia Ph.D. Phone: Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular 1. Familiarizarse con el proceso de amplificación mediante polimerasas 2. Identificar los parámetros críticos de una PCR y familiarizarse con el fundamento de la electroforesis de ácidos nucleicos 3. Secuenciación de ADN. OBJETIVOS 4. Identificar en el laboratorio virtual una especie patógena mediante PCR 5. Retrotranscripción-amplificación en cadena de la polimerasa (RT- PCR) 6. Caso práctico: uso de las bases de datos de genes (BLAST) y familiarizarse con la notación 1

2 Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular OBJETIVOS 1. Familiarizarse con el proceso de amplificación mediante polimerasas 2. Identificar los parámetros críticos de una PCR y familiarizarse con el fundamento de la electroforesis de ácidos nucleicos 3. Secuenciación de ADN. 4. Identificar en el laboratorio virtual una especie patógena mediante PCR 5. Retrotranscripción-amplificación en cadena de la polimerasa (RT- PCR) 6. Caso práctico: uso de las bases de datos de genes (BLAST) y familiarizarse con la notación Qué es la PCR? PCR: Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction, Kary Mullis-1985) Amplificación selectiva de un segmento particular de ADN El segmento puede representar una parte pequeña de entre una mezcla heterogénea de AND: e.g. un exón específico de un gen humano 2

3 Qué es la PCR? Herramienta muy poderosa de amplificar y/o detección de fragmentos de ADN de interés ~2 horas. La técnica de la PCR tiene multitud de aplicaciones: Ø Diagnóstico (prenatal, infecciones microbianas, mutaciones de oncogenes, etc) Ø Medicina forense Ø Antropología o Arqueología molecular Ø Microbiología ambiental Qué hay en la reacción? Molde de ADN Tampón or buffer de la reacción mantener ph adecuado para el funcionamiento de ADN polimerasa (Tris, iones amonio, iones magnesio, albúmina bovina sérica) 4 nucleótidos trifosfato (dntps): datp, dctp, dttp y dgtp Cebadores (primers) ADN polimerasa (normalmente Taq) 3

4 Qué hay en la reacción? Reagent for PCR Volume (µl) for each (25 µl total) Final concentration Taq DNA polymerase U/ml (added last) 10x buffer 2.5 1x dntps (10 mm each, µm combined) Forward primer µm Reverse primer µm dh2o (nuclease free) or Template (AND) 1 Qué hay en la reacción? CONTROLES EN LA REACCIÓN DE PCR CONTROL NEGATIVO TaqPol, dntps, buffer, cebadores + H 2 O CONTROL POSITIVO TaqPol, dntps, buffer, cebadores + DNA conocido FALSOS POSITIVOS CONTROL DE LA AMPLIFICACIÓN MUESTRA PROBLEMA TaqPol, dntps, buffer, cebadores + DNA desconocido DIAGNÓSTICO SEGURO 4

5 Termocicladores Gran variedad de suministradores. Gran variedad de formatos. Reacciones se llevan a cabo en tubos o en placas de 96. Cebadores Oligonucleótidos deben tener ~20 bases. El contenido G/C debe ser del 45 55%. La base en el extremo 3 debe ser G o C. Los cebadores no deben ser complementarios entre ellos o formar bucles consigo mismo. 5

6 Cebadores Cebadores que forman bucles 5 -GTTGACTTGATA T 3 -GAACTCT Cebadores Un cebador puede formar un dímero consigo mismo o con otro cebador. 5 -ACCGGTAGCCACGAATTCGT-3 3 -TGCTTAAGCACCGATGGCCA-5 Los cebadores pueden ser excelentes, pero no deseados, substratos para la Taq polimerasa. 6

7 Etapas de un ciclo de PCR 1- Desnaturalización denaturation 95 C, 30 sec. 2- Alineamiento Annealing C, 30 sec. 3- Extensión extension/elongation 72 C, 45 sec. Tiempo depende del tamaño del producto ciclos Etapas de un ciclo de PCR 1. Desnaturalización (denaturation) 95º C 7

8 Etapas de un ciclo de PCR 2. Alineamiento o unión de los cebadores (Annealing) 5 Cebadores (primers) º C 3 5 La PCR amplifica una zona de ADN flanqueada entre dos cebadores Etapas de un ciclo de PCR 3. Extensión (extension/elongation) Polimerasa Taq 72º C 72º C 8

9 Etapas de un ciclo de PCR ciclos: Desnaturalización. Alineamiento. Extensión. Cuántas copias se generan? No hay amplificación de la secuencia deseada hasta el tercer ciclo. La acumulación no es estrictamente el doble tras cada ciclo en las primeras fases. Tras 30 ciclos, hay 1,073,741,764 copias específicas (~ ). Hay también otras 60 copias de ADN. 9

10 Comprueba las etapas de PCR 1. Visita la página web que se indica abajo 2. Entra en el apartado Amplification 3. Observa cómo se comportan los parámetros siguientes: Temperatura, número de ciclos y etapas de PCR Nota cómo en el ciclo 3 hay 8 copias de ADN y 2 copias de la secuencia diana Video Ha funcionado PCR? Electroforesis de ADN Comprobación mediante una electroforesis (densidad eléctrica K) Es el tamaño del producto el esperado? Hay más de una banda? Quizás haya que optimizar la reacción. Video 10

11 Optimización de PCR T de alineamiento Cebadores tienen una temperatura de alineamiento de 54 C). La T debe confirmarse empíricamente. Saltos de T de 2 C arriba y abajo. Uso de cicladores con gradiente Optimización de PCR Concentración de Mg 2+ La fidelidad de la PCR depende [Mg 2+ ]. Variaciones de [Mg 2+ ] de 0.5 mm

12 Cómo es la longitud del fragmento amplificado? Típicamente entre bp. Es posible amplificar >25 kb. Requiere modificar el tampón de la reacción, tiempo de extensión y tipo de polimerasa Limitación por la integridad del material de partida. Cuántos ciclos? Acerca de la sensibilidad Saturación: Los reactivos se agotan Los productos se alinean La polimerasa se degrada Los productos no deseables se acumulan. 12

13 Son importantes los errores? Sí, si quieres clonar el fragmento amplificado de ADN una molécula individual puede tener varias mutaciones. No, si quieres secuenciar el fragmento amplificado o digerirlo con enzimas de restricción. Usa un enzima con capacidad correctora. Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular 1. Familiarizarse con el proceso de amplificación mediante polimerasas 2. Identificar los parámetros críticos de una PCR y familiarizarse con el fundamento de la electroforesis de ácidos nucleicos 3. Secuenciación de ADN. OBJETIVOS 4. Identificar en el laboratorio virtual una especie patógena mediante PCR 5. Retrotranscripción-amplificación en cadena de la polimerasa (RT- PCR) 6. Caso práctico: uso de las bases de datos de genes (BLAST) y familiarizarse con la notación 13

14 Método de Sanger para secuenciación de nucleótidos Método enzimático El ADN molde. Un enzima que replique el ADN. Un cebador o "primer" marcado radiactivamente. Los cuatro nucleótidos trifosfato (datp, dctp, dgtp y dttp). Nucleótidos dideoxi (ddatp, ddttp, ddctp y ddgtp). Son nucleótidos modificados que han perdido el grupo hidroxilo de la posición 3' de la desoxirribosa. Método de Sanger para secuenciación de nucleótidos Deben realizarse en 4 tubos diferentes, 4 mezclas de reacción. Cada mezcla de reacción contiene 4 nucleótidos trifosfato (datp, dctp, de dttp y dgtp), ADN polimerasa I, un cebador marcado radiactivamente y un nucleótido dideoxi, por ejemplo ddgtp, a una concentración baja. El nucleótido dideoxi utilizado (ddgtp) competirá con su homólogo (dgtp) por incorporarse a la cadena de ADN que se está sintetizando, produciendo la terminación de la síntesis en el momento y lugar donde se incorpora. 14

15 Método de Sanger para secuenciación de nucleótidos 1. Sea un DNA que se desea secuenciar: ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC - 2. Disponemos de un oligonucleótido complementario a la secuencia, TAGGCACG que se hibrida con el DNA cuya secuencia deseamos conocer, y que vale como cebador de la nueva síntesis. Este oligonucleótido está marcado radioactivamente ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC - -*TAGGCACG 5 3 Síntesis en presencia de ddgtp ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC - -*TAGGCACGAAG* ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC - -*TAGGCACGAAGG* - ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC - -*TAGGCACGAAGGCACATTCG* - ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC - -*TAGGCACGAAGGCACATTCGATG* - ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC - -*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCAATCG* ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC - -*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCAATCGAATCG* 26 15

16 G A T C - A continuación, las cuatro mezclas se someten a electroforesis en poliacrilamida-sds. Este método separa polinucleótidos en función de su tamaño, de forma que los más cortos se desplazan más rápidamente. Como el cebador está marcado Radioactiva-mente, revelamos la plancha de electroforesis por autorradiografía. Con esto leemos directamente la secuencia complementaria del polinucleótido inicial: 5 -AAGGCACATTCGATGCAAT- CGAATCGAACGTCCCAAAAG- GATTCCGGGAAAATG-3 + SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA DE ADN Detección al mismo tiempo 16

17 Aplicación de la PCR identificación de bacterias Entra en The bacterial identification lab Elección del caso práctico Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular OBJETIVOS 1. Familiarizarse con el proceso de amplificación mediante polimerasas 2. Identificar los parámetros críticos de una PCR y familiarizarse con el fundamento de la electroforesis de ácidos nucleicos 3. Secuenciación de ADN. 4. Identificar en el laboratorio virtual una especie patógena mediante PCR 5. Retrotranscripción-amplificación en cadena de la polimerasa (RT- PCR) 6. Caso práctico: uso de las bases de datos de genes (BLAST) y familiarizarse con la notación 17

18 Podemos amplificar por PCR ARN? No directamente la ADN polimerasa necesita un molde de ADN y no copia ARN. mrna puede copiarse antes en ADN complementario al ARN (cdna) usando la transcriptasa inversa. cdna es un molde para la PCR Retrotranscripción-amplificación en cadena de la polimerasa (RT-PCR) RT PCR master mixes Reagent for PCR Volume (µl) for each (25 µl total) Final concentration Quiagen RT PCR buffer 5x 5 1x One step RT PCR enzyme 1 Mix dntps (10 mm each, µm each dntp combined) Primers A µm Primers B µm dh2o (nuclease free) 5.75 Template (mrna) 10 18

19 Retrotranscripción-amplificación en cadena de la polimerasa (RT-PCR) er paso: retrotranscripción a partir del ARN. 2º paso: amplificación a partir de la primera hebra de ADNc. 5 PCR 5 5.3er paso: PCR estándar. RT A Retrotranscripción-amplificación en cadena de la polimerasa (RT-PCR) 7 kb exon 1 intron 1 exon 2 B 7 kb exon 1 intron 1 exon 2 exon 3 M A B 1200 pb 600 pb 19

20 Trabajando con secuencias Caso práctico: BLAST 1. Localiza en la base de datos el gen para óxido nítrico sintasa inducible, inos, NM_ Familiarizarse con la notación la secuencia de nt pertenece a ARN o es genómica? Dónde comienza y acaba la proteína? Entra en la base de datos NCBI para ver el gen de la inos murine Videos 20

21 Caso práctico: BLAST Identifica los cebadores en la secuencia usando BLAST contra el gen (NOS2) Seq 1 introduce en GI el número del gen NM_ Seq 2 introduce (copy-paste) el oligo 5 y el oligo 3 Oligo 5 CAgCTCATCCggTACgCTggCTAC Oligo 3 ACTTCCTCCAggATgTTgTAgCg Cuál es el tamaño amplificado tras RT-PCR? 397 pb Video Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular Mohammed Rafii-El-Idrissi Benhnia Ph.D. Scientist Infectious diseases and vaccine discovery Gracias Thanks 21

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