GUIA DE TRABAJOS PRÁCTICOS Y SEMINARIOS

Transcripción

1 GUIA DE TRABAJOS PRÁCTICOS Y SEMINARIOS PhD. Marcelo Aba Dra. Carolina Bianchi Vet. María Verónica Cavilla Vet. Micaela Benavente Área de Endocrinología Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires 2015

2 ÁREA DE ENDOCRINOLOGÍA TRABAJO PRÁCTICO Nº 1 UTILIZACIÓN DE UN KIT COMERCIAL PARA LA VALORACIÓN DE PROGESTERONA EN PLASMA Objetivos: 1. Introducir al alumno en la metodología del radioinmunoensayo (RIA) para dosajes hormonales. Con pequeñas modificaciones, este método se aplica para la determinación de la mayoría de las hormonas, cuyo dosaje resulta de importancia en la práctica médica. 2. Demostrar, por medio de la determinación de las concentraciones de progesterona a través de un RIA como ejemplo, la utilidad que posee la metodología en el diagnóstico clínico veterinario. Introducción: El ciclo estral de los animales domésticos se caracteriza por la presencia de ondas foliculares, a partir de las cuales un folículo se desarrolla, crece y domina sobre el resto, transformándose en el folículo preovulatorio. Esta fase del ciclo estral (Fase Folicular) se caracteriza por altas concentraciones plasmáticas de estrógenos y por bajos niveles de progesterona. Tras producirse el pico de LH, se produce la ovulación y la consiguiente formación del cuerpo lúteo (CL), dando origen a la fase luteal del ciclo. El CL comienza a secretar progesterona, siendo ésta la hormona que domina a lo largo de esta fase. El destino de ese CL dependerá de la presencia o no de un embrión en desarrollo en el útero. En animales preñados, el embrión le envía una señal a la madre, lo que permite que el CL continué funcionando y secretando progesterona para el mantenimiento de la preñez. De no ocurrir la fecundación, luego de un periodo variable según la especie, ocurre el proceso de luteólisis con la respectiva destrucción del CL por acción de la prostaglandina F 2α y la disminución de las concentraciones plasmáticas de progesterona. Esta caída en los niveles de progesterona, liberará el freno impuesto a la liberación de gonadotropinas hipofisiarias iniciándose así un nuevo ciclo estral (Fig.1). Es importante destacar que para la mayoría de las especies domésticas, concentraciones plasmáticas de progesterona superiores a 1 ng/ml indican la presencia de un CL funcional.

3 Celo Fase Folicular Fase Luteal Fase Folicular E 2 Ov LH Progesterona FSH Días Fig. 1: Concentraciones hormonales durante el ciclo estral bovino Principios del Test: El RIA depende de la habilidad de un anticuerpo (Ac) de unir su antígeno específico (progesterona, en este caso). Básicamente, la hormona natural presente en la muestra se hace competir con la misma hormona marcada con un isótopo radioactivo ( 125 I ó 3 H) por un número limitado de sitios de unión en el anticuerpo específico. Como las cantidades de Ac y de hormona marcada utilizadas en el ensayo se mantienen constante, lo único que varía es la cantidad de hormona no marcada (contenida en la muestra problema). Después de un proceso en el que se separa la hormona libre de la unida al Ac, se encontrará que habrá tanto menor cantidad de radioactividad cuanto mayor sea la cantidad de hormona no marcada presente en la muestra y viceversa (Fig. 2). Construyendo una curva patrón empleando cantidades conocidas de hormona natural, se puede deducir la cantidad de hormona presente en la muestra en base a la radioactividad unida al Ac. Tubo de Anticuerpo Progesterona Progesterona Polipropileno de la muestra marcada Fig. 2: Esquema del Radioinmunoensayo

4 Reactivos provistos: Tubos de polipropileno recubiertos con anticuerpos de conejo anti progesterona Standards de Progesterona: Se proveen 7 standards para confección de la curva patrón conteniendo: 0; 0,1; 0,5; 2,0; 10; 20 y 40 ng/ml Progesterona marcada con 125 I Contador gamma Vortex Micropipetas de 100 y 1000 μl y tips correspondientes Rack de decantación Papel para gráfica logit log Muestras a evaluar: Suero, plasma o leche Procedimiento a seguir: 1) Colocar todos los reactivos a temperatura ambiente (15 28 ºC) 2) Numerar cada uno de los tubos y colocar en una gradilla de decantación 3) Agregar 100 μl del standard 0 ng/ml en los tubos 1 y 2 4) Continuar agregando cada uno de los siguientes standards y muestras problemas en los correspondientes tubos 5) Agregar 1000 μl de progesterona 125 I a todos los tubos 6) Mezclar con el vortex cada uno de los tubos 7) Incubar a temperatura ambiente durante 3 horas 8) Decantar el sobrenadante 9) Eliminar toda la humedad visible para mejorar la precisión 10) Medir la radioactividad presente en el precipitado 11) Leer durante 1 minuto en el contador gamma

5 12) Calcular los resultados, utilizando la siguiente fórmula: CPM (muestra o Standard) % B/B 0 = CPM (Standard 0 ng/ml) Protocolo: Tubo Descripción CPM - NSB % B/B 0 ng/ml 1 0 ng/ml (B 0 ) ,1 ng/ml ,5 ng/ml ,0 ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml Muestra 1 9 Muestra 2 10 Muestra 3 11 Muestra 4 Aplicaciones clínicas del dosaje de progesterona: Durante el trabajo práctico se discutirán brevemente las implicaciones clínicas de los resultados obtenidos de acuerdo a la reseña que acompañará a cada muestra provista.