CURSO INTERNACIONAL INMUNIDAD INNATA EN SALUD Y ENFERMEDADES INFECCIOSAS

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1 CURSO INTERNACIONAL INMUNIDAD INNATA EN SALUD Y ENFERMEDADES INFECCIOSAS 29 de agosto - 9 de septiembre de 2016 Comité Organizador: Eva María Salinas Miralles (Universidad Autónoma de Aguascalientes) y Daniel Scott-Algara (Instituto Pasteur de Paris) Organizado por: la Universidad Autónoma de Aguascalientes y el Instituto Pasteur de Paris, con la colaboración y participación de la Embajada de Francia en México, UNU/BIOLAC, la UNAM, el Centro de Investigación Biomédica de Occidente en Guadalajara, la Unidad de Investigación Médica de Zacatecas, la Universidad Autónoma de Nuevo León en San Nicolás de los Garza, el CONACYT, Red INMUNO-CANEI y la Sociedad Mexicana de Inmunología y BD Biociencias. 1

2 MÓDULO PRÁCTICO 3 Del 5 al 9 de Septiembre de 2016 SEDE: DIVISIÓN DE INMUNOLOGÍA CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS DE OCCIDENTE (CIBO-IMSS), GUADALAJARA, JALISCO. MÉXICO 2

3 MÓDULO PRÁCTICO 3 Profesores: Dr. Alejandro Bravo Cuellar Dra. Georgina Hernández Flores Dr. Pablo Cesar Ortiz Lazareno Colaboradores: Tec. Espec. María de Jesús Delgado Ávila Biol. Vida Celeste Rosas González 3

4 PRÁCTICA 1 Elaboración de plantillas, compensación a) Compensación multicolor. Realizar la compensación para cada uno de los protocolos que realizará. Para ello utilizará el CD45, CD3 ó CD56 conjugado con los diferentes fluorcromos que se utilizarán durante las prácticas, así como las perlas para realizar compensación. Utilizará anticuerpos conjugados con los siguientes fluorocromos: FITC, PE, PerCP, PerCP-Cy5.5, PE-Cy7, APC. 1.- Agitar en el vortex las perlas CompBead Plus antes de usarlas. 2.- Etiquete tubos de citometría para cada uno de los fluorocromos que utilizará y para su control negativo. 3.- Adicionar 100 L de solución de tinción, añadir 1 gota del víal CompBead (Control negativo) o una gota del CompBead Plus según corresponda. 4.- Agitar sus tubos en el vortex. 5.- Adicionar los anticuerpos en cada uno de los tubos según el fluorocromo con el cual corresponde el conjugado. 6.- Incubar 20 minutos a temperatura ambiente. Protegidos de la luz. 7.- Realizar un lavado con PBS durante 7 minutos a 1800 rpm. 4

5 8.- Desechar el sobrenadante y resuspender el botón de células con 0.5 ml de solución de tinción. Agitar sus tubos en el vortex. 9.- Analizar cada uno de sus tubos en e l c i t o m e t r o para realizar la compensación para su ensayo Utilizar la herramienta para compensación automática de su software. 5

6 Práctica 2 Estudio fenotípico y funcional de células NK en sangre periférica A) Fenotipificación de receptores de células NK en sangre total La fenotipificación de las células Natural Killer se realizará de sangre recolectada en tubos con heparina (5 ml). Colocar 0.6 ml de sangre en un tubo de citometría. El resto de la sangre se utilizará para realizar cultivo celular de mononucleares. 1) Preparar 5 tubos de citometría (12 x 75mm) y numerarlos del tubo (1-5). 2) Mezclar los siguientes anticuerpos: CD3-FITC (volumen recomendado x 4.5) + CD56-APC (volumen recomendado x 4.5) + CD45-PerCP (volumen recomendado x 4.5) + CD16 PE-Cy7 en un tubo Eppendorf de 0.5 ml. 3) Distribuir la mezcla de anticuerpos marcados con los diferentes fluorocromos en los tubos de citometría (Tubo 2-5). 4) Posteriormente, distribuir en los tubos numerados del dos al cinco, según corresponda la cantidad necesaria del anticuerpo marcado con PE (anticuerpos para los receptores de células NK). 5) Agitar el tubo que contiene.6 ml de sangre. 6) Colocar 50 μl de sangre en los tubos marcados del 1 al 5, sin tocar las paredes del tubo. 6

7 7) Limpiar la pipeta con etanol al 75%. 8) Agitar los tubos en el vortex (velocidad baja). 9) Colocar los tubos a temperatura ambiente (TA), 30 minutos en la oscuridad, agitar una vez, después de 15 minutos de incubación. 10) Agregar 450 L de Buffer de lisis (BD), agitar 10 seg. Incubar durante 15 minutos. Guardarlos a 4ºC protegidos de la luz hasta su lectura. NOTA: Realizar controles de compensación utilizando CD45 para PE, PerCP, FITC y APC. Lista de anticuerpos: PE PerCP FITC APC PE-Cy7 1 XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX 2 NKG2D CD45 CD3 CD56 CD16 3 NKp30 CD45 CD3 CD56 CD16 4 NKp44 CD45 CD3 CD56 CD16 5 NKp46 CD45 CD3 CD56 CD16 7

8 B) Ensayo funcional de células NK (Determinación de CD107a, TNF e IFN- Diluir la sangre en gradientes de Ficoll. 1.- Diluir la sangre con PBS estéril 1/ Vaciar lentamente la sangre apoyándose en la pared del tubo, sobre el ficoll contenido en tubos de 5 o 15 ml. 3.- Centrifugar a 1800 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente. 4.- Tomar el anillo de células mononucleares con pipeta Pasteur y colocarlos en un tubo de 5 o 15 ml conteniendo PBS 1X, centrifugar a 1800 rpm, durante 7 minutos. 5.- Desechar el sobrenadante y resuspender el botón celular, agregando 7 ml de PBS estéril, centrifugar 1800 rpm durante 7 minutos. 6.- Decantar y resuspender sus células en 1000 L de PBS estéril. 7.- Contar sus células mononucleares. El medio de cultivo que se utiliza para cultivo celular es el RPMI-1640 con 10% de suero fetal bovino. 8.- Colocar células mononucleares en seis pozos (2 pozos para control negativo, 2 pozos control basal, 2 pozos para control positivo), para co-cultivo realizar el cálculo para la relación 1/1, 1/5 y 1/10 o 1/20 las células deberán estar resuspendidas en un volumen total de 100 L de medio de cultivo. 8

9 9.- Preparación de células blanco: Ajustar la línea K562 a una concentración de células en 100 L. Adicionar las células K562 en los pozos en donde se realizará el cocultivo con las células mononucleares Agregar el anticuerpo anti-cd107ape en todos los pozos EXCEPTO EN LOS CONTROLES NEGATIVOS. Colocar 2.5 g/ml de PMA g/ml de Ionomicina en el grupo a estimular [CONTROL POSITIVO] Incubar 1 hora a 37 C en atmósfera húmeda conteniendo 5% de CO Posteriormente, adicionar brefeldina y monensina, incubar durante 4 horas o toda la noche a 37 C en atmósfera húmeda conteniendo 5% de CO Recolectar las células y colocarlas en tubos para citometría. Centrifugar 1800 rpm durante 7 minutos, decantar, resuspender el botón y realizar dos lavados más con solución de lavado (BD) Resuspender el botón celular y adicionar 100 L de solución de lavado, incubar durante 30 minutos a 4 C, añadiendo los siguientes anticuerpos excepto al control negativo: CD3, CD56. Realizar un lavado con PBS. 15) Fijar durante 15 minutos a 4 C con la "solución 1" (BD), 100 L/tubo. Agitar 5 seg., en el vortex. 16) Al final de la incubación, añadir 2.0 ml de sol. de permeabilización 1x (BD). Y centrifugar 1800 rpm, durante 7 minutos. Desechar el sobrenadante. 21) Permeabilizar durante 5 minutos a 4 C, agregar 100 L/tubo de la solución de permeabilización. 9

10 22) Agregar los anticuerpos anti-ifn PE-Cy7 y anti-tnf- -PerCP-Cy5.5 excepto al control negativo durante 30 min a 4 C. 23) Adicionar 2.5 ml de sol de permeabilización, realizar un lavado adicional con PBS estéril 1x, centrifugar 2000 rpm, 7 min. Desechar el sobrenadante. 24) Resuspender el botón celular, y añadir 500 L de solución fijadora 1% PFA por tubo, agitar en el vortex. 25) Analizar en el citometro. NOTA 1: Al adicionar a sus células anticuerpos conjugados con fluorocromos proteger de la luz, de lo contrario podría perder la señal del fluorocromo cuando realice su lectura en el citometro. NOTA 2: La brefeldina previene la exocitosis de las citocinas contenidas en las vesículas exocíticas de la célula por lo cual su uso nos permite la visualización de la producción de citocinas una vez que las células son estimuladas. NOTA 3: La monensina previene la acidificación de las vesículas endocíticas evitando la degradación del receptor CD107a que ha sido re-internalizado de la superficie de membrana por la estimulación. 10

11 Práctica 3 Estudio de células dendríticas (mieloides y plasmocitoides) en sangre periférica Fenotipificación de células dendríticas mieloides y plasmocitoides en sangre total 1) Preparar 2 tubos de citometría (12 x 75mm) y numerarlos del tubo (I, II). 2) Realizar separación de células mononucleares a partir de sangre periférica. Realizar conteo de células. 3) Adicionar al tubo II, los anticuerpos lineage-fitc + HLA-DR-PerCP + CD123-PE + CD11c-APC. 5) Colocar 2 X 10 6 células mononucleares resuspendidas en 100 μl de buffer de tinción. 8) Colocar los tubos a temperatura ambiente (TA), 30 min., en la oscuridad, agitar una vez, después de 15 minutos de incubación. 9) Realizar un lavado de sus células. Centrifugar y decantar. 10) Añadir 450 L de la solución de de PBS con PFA al 1%, analizar las muestras en el citometro. Lineage: Cóctel con anticuerpo antihumano para CD3, CD14, CD16, CD19, CD20 y CD56. 11

12 ANOTACIONES: 12

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