DIAGNÓSTICO DE ENTEROPARASITOSIS HUMANAS MÉTODOS DE ESTUDIO DE LAS ENTEROPARASITOSIS

Transcripción

1 DIAGNÓSTICO DE ENTEROPARASITOSIS HUMANAS MÉTODOS DE ESTUDIO DE LAS ENTEROPARASITOSIS Prof. Adjta. Dra. Nora Fernández Depto. Parasitología y Micología

2 IMPORTANCIA Diagnóstico - Enteroparasitosis sintomática - Detección precoz, asintomática. Diagnóstico diferencial de infecciones entéricas: parasitarias, bacterianas, virales. Diagnóstico diferencial con otras patologías del tubo digestivo. Instaurar el mejor tratamiento (específico). Valorar respuesta al tratamiento. Prevención.

3 COPROLOGÍA Del griego kopros : excremento, estudio de las materias fecales. Comprende la observación microscópica, macroscópica y el análisis químico de las materias fecales (coprofuncional). El examen de las heces tiene su indicación clínica en las diarreas, en procesos que cursan con insuficiencia digestiva o en los que se busca un agente etiológico: Coprovirológico Coprocultivo Coproparasitario

4 COPROPARASITARIO Se trata de un conjunto de técnicas complementarias, que permiten demostrar la presencia de las diferentes formas evolutivas de los protozoos y helmintos enteroparásitos: esporas, trofozoítos, quistes, ooquistes, huevos, larvas y adultos. Se utiliza también para el diagnóstico de parasitosis de glándulas anexas Ej.: hígado. En la fascioliasis los huevos de Fasciola hepatica son eliminados con las heces.

5 CONJUNTO DE TÉCNICAS? No existe un único método capaz de demostrar todas las formas evolutivas parasitarias Diferente morfología y ciclos. Diferencias estructurales y tintoriales. Diferencias en la viabilidad debido a : ph, tratamientos farmacológicos, etc. Distinta localización en el tubo digestivo por lo que su distribución y ubicación de los parásitos en el bolo fecal será diferente: centro o en la periferia. Variaciones en la resistencia de las formas evolutivas. La eliminación intermitente hace que existan períodos negativos.

6 ETAPAS DEL PROCESO DIAGNÓSTICO PREANALÍTICA: está sujeta a mayor porcentaje de errores, insume mayor tiempos e involucra solicitud, asesoramiento,,obtención, almacenamiento, transporte y recepción en el laboratorio. ANALÍTICA: corresponde a la realización del procedimiento diagnóstico. - Incluye: elección de los métodos, la estandarización, la realización de control de calidad, etc. POSTANALÍTICA: interpretación de resultados, validación, emisión del informe.

7 FASE ANALÍTICA TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS EN LAS ENTEROPARASITOSIS

8 IMPLEMENTACIÓN DE TÉCNICAS Planta física del laboratorio, equipamiento, insumos, costos racionalización. Recursos humanos capacitados y entrenados. Tiempo. Actualmente existen diferentes metodologías diagnósticas con diferente costo, utilidad, simplicidad y sensibilidad.

9 ELECCIÓN Se debe tener presente la población y el objetivo del estudio: Diagnóstico: orientación de acuerdo a los datos clínicos: - Edad, procedencia, antecedentes personales; patológicos; familiares; ambientales: acceso al agua potable, saneamiento; control de tratamientos: antiparasitarios; otros tratamientos : antidiarreicos, laxantes, etc. Estudio epidemiológico: guarderías, escuelas, asentamientos, población rural, hospitales, residencias para ancianos, carné de salud para manipuladores de alimentos, viajes, etc. Investigación: Especies y variedades Fármacos

10 OBTENCIÓN DE LA MUESTRA DE HECES PARA COPROPARASITARIO Emisión Espontánea. Se puede administrar laxantes salinos, no oleosos (vaselina, glicerina). No luego de estudio radiográfico c/bario. No en período menstrual. Régimen alimentario - Hay quienes indican durante las hrs previas a la recolección de la muestra no ingerir frutas, verduras y grasas. Desde nuestro punto de vista no es necesario. Cantidad de muestra - Aproximadamente 50 grs (tamaño de una nuez) para heces formadas; liquidas al menos 4 ml (10-15 ml).

11 OBTENCIÓN DE LA MUESTRA - En frasco de plástico limpio de boca ancha y tapa rosca. - Rotulada con nombre paciente, C.I, Nº registro del laboratorio. - La de la mañana o la noche anterior, conservación en heladera hasta 24 horas (sin conservantes). - Muestra inadecuada aquella que se mantuvo más de 24 hrs a temperatura ambiente. - Si se utilizan sustancias para conservar la muestra, tener en cuenta sus efectos sobre las formas evolutivas y contaminación del medio ambiente. - Evitar contaminación con orina, detergentes, hipoclorito de Na +. - La fermentación altera trofozoítos y las larvas de Strongyloides stercoralis.

12 RECOMENDACIONES PARA USUARIOS No dejar las heces expuestas al aire RECOMENDACIONES PARA PERSONAL TÉCNICO-NO TÉCNICO Cada laboratorio debe tener sus pautas Debe existir comunicación entre : mensajero-recepcionista-técnicos-médicos-enfermeras Se deben examinar lo mas rápido posible (condición ideal). Cuando se reciben varias muestras al mismo tiempo, se deberá separar las que son líquidas, tienen pus, mucus o sangre, y deberán ser examinadas antes que las demás, ya que puede haber trofozoítos de amebas, los que con el transcurso del tiempo pierden movilidad.

13 NÚMERO DE MUESTRAS Existen varios criterios al respecto. Para diagnóstico de enfermedad por enteroparásitos COPROPARASITARIO SERIADO 3 MUESTRAS - Separadas c/3-7 días. Se considera que una única muestra tiene una sensibilidad del 40%-60%, ya que existen períodos negativos por los propios ciclos biológicos de los enteroparásitos (eliminación intermitente). Múltiples muestras de material fecal, aumenta la probabilidad de hallazgo. Concentración de múltiples muestras en un solo examen. Aplicación de un algoritmo ante la presencia de un resultado negativo y la persistencia de síntomas.

14 ALGORITMO CLÍNICO-PARASITOLÓGICO POSITIVA Diagnóstico y mejoría con tratamiento. No justifica 2 muestra 1 NEGATIVA Desaparición de los síntomas; se halló otra causa. Sin otra causa ni mejoría: solicitar 2 muestra POSITIVA Diagnóstico y mejoría con tratamiento. No justifica 3 muestra 2 NEGATIVA Desaparición de los síntomas; se halló otra causa. Sin otra causa ni mejoría: solicitar 3 muestra 3 POSITIVA Diagnóstico y mejoría con tratamiento. NEGATIVA Desaparición de los síntomas; se halló otra causa. Sin mejoría y firme sospecha de enteroparasitosis, evaluar detección de coproantígenos, Acs, realización de sondeo duodenal, biopsia, etc.

15 ESTUDIO DE ENTEROPARÁSITOS Métodos directos: Coproparasitario Coloraciones Detección de coproantígenos Método de Graham (espátula adhesiva) Métodos Indirectos: Detección de anticuerpos (Acs) en suero. Utilizados para amebiasis, fascioliasis, estrongiloidiasis y esquistosomiasis, etc.

16 COPROPARASITARIO 1- MACROSCÓPICO PARÁSITOS PSEUDOPARÁSITOS SANGRE MUCUS PUS COLOR CONSISTENCIA LIENTERIA 2 MICROSCÓPICO a) Directo en fresco c/ SF Heces s/concentrar b) Técnicas de concentración Para heces c) Directo en fresco c/ colorantes: lugol, azul de tionina, etc. d) Recuento de huevos e) Coloraciones permanentes f) Método de Graham

17 COPROPARASITARIO 3 INMUNOLÓGICOS 4 CULTIVOS 5 BIOLOGÍA MOLECULAR 6 MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA Detección de coproantígenos INVESTIGACIÓN Laboratorios de referencia * PCR INVESTIGACIÓN Laboratorios de referencia

18 1- MACROSCÓPICO Depende de la dieta y de la ingesta de agua. 1 y 2 indican constipación. 5-7 indican diarrea.

19 2a- MICROSCÓPICO : directo en fresco c/ SF DATOS QUE APORTA Las heces s/concentrar formadas quistes Movilidad de trofozoítos y larvas. Células de mucosa intestinal. Células inflamatorias. Productos de una mala digestión/ absorción de alimentos. pastosas semi-líquidas trofozoítos ooquistes líquidas

20 2a - PREPARACION DEL EXAMEN DIRECTO En portaobjetos colocar 1 gota de SF y otra de lugol. Se hace una suspensión c/ aprox. 2 mg de heces. Se coloca un cubreobjetos de 24 x 24 mm y se observa al MO a 10 x y luego a 40 x. La suspensión de heces preparada debe permitir leer a través de la preparación.

21 2a- MICROSCÓPICO : directo en fresco c/ SF Huevos de Hymenolepis diminuta Quistes de Giardia lamblia

22 2b- TÉCNICAS DE CONCENTRACIÓN Fundamento: aumentar el número de parásitos a partir de un volumen de heces preestablecido. Procedimientos a) Sedimentación b) Flotación c) Biológicos Cada uno posee ventajas y desventajas. Sensibilidad variable para protozoos y helmintos.

23 a) SEDIMENTACIÓN Están basados en la utilización de agua u otros líquidos de baja densidad, recobrándose las formas evolutivas microscópicas de los parásitos, en el fondo de un y tubo cónico, donde se depositan por ser más densos. Sedimentación espontánea o simple Sedimentación-centrifugación Telemann (éter-ácido clorhídrico) Carles y Barthélémy (éter -ácido cítrico) Ritchie (formol-éter)

24 TÉCNICA DE SEDIMENTACIÓN ESPONTÁNEA Se homogeniza 2-5 grs de heces en 10 ml de SF. La mezcla se vierte en tubo cónico de 50 ml de capacidad, filtrándola a través de gasa (se puede utilizar las unidades de filtración). Se completa el volumen solución salina y se tapa. Se agita y se deja reposar 45 minutos. Se elimina el sobrenadante. Se toma con una pipeta una muestra del fondo del tubo. Se colocan 3 gotas en dos láminas portaobjetos diferentes y se cubre c/laminilla. Sensibilidad 55 % No requiere centrífuga Disponible

25 TÉCNICA DE SEDIMENTACIÓN/CENTRIFUGACIÓN MÈTODO DE RITCHIE Fundamento: lavados/centrifugados sucesivos partiendo de un volumen de heces preestablecido, para eliminar la mayor cantidad de restos vegetales y grasas que estén presentes, ya que pueden interferir en la visualización microscópica. Es el más utilizado, por su reproducibilidad, sensibilidad y bajo costo. Con el transcurso del tiempo se han incorporado diferentes variantes de la misma; también hay varios kits comerciales.

26 RITCHIE FORMOL / ÉTER ÉTER Tapón de grasa y restos vegetales FORMOL 10% SEDIMENTO También se usa acetato de etilo NO INFLAMABLE

27 VARIACIONES DEL RITCHIE HOMOGENEIZADO Proporción 1volúmen de materias fecales y 9 volúmenes de solución salina. En heces líquidas no es necesario agregar SF, se agita el recipiente que contiene la muestra y se procede a la filtración. FILTRACIÓN En heces c/grasas o mucus, pueden quedar atrapados en la gasa, por lo que puede ser innecesario la utilización. Hasta 3 lavados. LAVADOS

28 KITS COMERCIALES DE SEDIMENTACIÓN/CENTRIFUGACIÓN COSTOS ASPECTOS COMUNES Unidades de filtración Limpios Bioseguridad DIFERENCIAS tubos c/ conservantes o sin c/surfactante o sin Cucharitas Hisopos bolsas

29 FECAL PARASITE CONCENTRATOR JUMBO EVERGREEN Reemplaza el embudo y la gasa. Un vial 30 ml adapta a una unidad de filtración de 50 ml. Los orificios del filtro miden 0,6 mm de diámetro, permitiendo el pasaje de larvas, huevos, quistes y retiene la mayor parte de los desechos fecales. Surfactante Tritón X-100, disuelve y disgrega las heces y el mucus.

30 FECAL PARASITE CONCENTRATOR JUMBO EVERGREEN

31 PARATEST Utiliza como conservante formol tamponado al 5 %. En un solo paso se procede a la dilución, filtrado y concentración de la muestra. Posee un filtro de 266 mm. Disponibles 2 tipos más de conservantes: el SAF útil en laboratorios que realizan la coloración tricrómica y el Greenfix, biodegradable, no contamina el medio ambiente ni es tóxico. VIDEOS ON LINE FSqIqH8&feature=related

32 OTROS KITS COMERCIALES

33 b) FLOTACIÓN Los elementos parasitarios se recogen de la superficie de un líquido denso, a la cual ascienden por su menor peso específico. Flotación simple, Bass. Faust (sulfato de zinc) huevos de helmintos, estudios de tierra. Sheather modificado ( azúcar) para coccidios. Isospora Cyclospora Cryptosporidium

34 b) FAUST FUNDAMENTO Los elementos parasitarios se recogen de la superficie de un liquido denso al cual ascienden por su menor peso especifico. CLASIFICACIÓN Flotación Simple Flotación / Centrifugación Película superficial Sulfato de Zn Sedimento

35 c) BIOLÓGICOS Basados en el conocimiento y la aplicación del ciclo vital del parasito, fundamentalmente en formas juveniles. HARADA-MORI Strongyloides stercoralis Fundamento: Busca embrionar huevos de tremátodos y cestodos. Separar larvas de nemátodos. Sobre papel de filtro. Agua destilada Incubación a 20º C Examinar luego de 3 días. MÉTODO DE BAERMANN Strongyloides stercoralis Apropiado para el diagnostico de estrongiloidiasis. Las larvas poseen termotropismo e hidrotropismo +. Útil en coproparasitarios reiteradamente negativos.

36 c) BIOLÓGICOS HARADA-MORI Strongyloides stercoralis 30-60% de sensibilidad para 1 sola muestra

37 c) BIOLÓGICOS MÉTODO DE BAERMANN Gasa Heces, tierra, cultivo: 8-10 grs Malla Agua 40º C Se deja por minutos. Las larvas sedimentan en el tubo. Se abre la pinza, para obtener gotas en portaobjetos, y se observan al MO % de sensibilidad para 1 sola muestra

38 2c- MICROSCÓPICO : directo en fresco c/ lugol Quistes de Giardia lamblia Forma vacuolar Blastocystis hominis Larvas de Strongyloides stercoralis

39 d) RECUENTO DE HUEVOS Se utilizan para saber la intensidad de la infección helmintos transmitidos por el suelo. Ascaris lumbricoides Trichuris trichura Hymenolepis nana, entre otros. Tiene utilidad en estudios epidemiológicos y clínicos (eficacia de tratamiento). Cuantifican el número de huevos por gramo de materias fecales (h.p.g): - Leves - Moderadas - intensas de

40 d) TÉCNICAS PARA RECUENTO DE HUEVOS Recuento en placa microscópica Sencillo, poco exacto. Se realiza un ex. directo que contenga aproximadamente 2 mg de heces, se cubre c/ laminillas de 22 x 22 mm. Se recorre toda la laminilla y el número de huevos se multiplica por 500, el resultado se informa en h.p.g. Técnica de Kato-Katz Es el sugerido por la OMS, para diagnósticos individuales, como para investigaciones epidemiológicas. Más compleja, exacta. Disponible kit comercial.

41 e) COLORACIONES PERMANENTES: PREPARACIÓN DE FOTIS Heces frescas s/concentrar Heces concentradas Rotular con lápiz Confección Fijación: metanol Luego de la coloración pueden sellarse

42 e) COLORACIONES PERMANENTES 1) Kinyoun 1 2 2) Kinyoun modificado 3) Safranina 3 4 4) Tricrómica 5) Tricrómica modificada 5

43 f) MÉTODO DE GRAHAM Diagnóstico de oxiurosis : Enterobius vermicularis. FUNDAMENTO Sobre la base del ciclo biológico del agente, obtener huevos de E. vermicularis que están en la región peri-anal. Mediante la aplicación de un baja lenguas c/ cinta adhesiva o paleta de plástico engomada, alrededor de dicha zona. Durante 3 mañanas consecutivas. Higiene la noche previa; no aplicar cremas. Realizar el estudio en la mañana antes de que el niño se levante. Si usa pañal y a la mañana nota que está con materias fecales : no realizar el estudio ese día. No requiere refrigeración. Lavarse las manos después de realizar la toma de muestra.

44 f) MÉTODO DE GRAHAM

45 DETECCION DE COPROANTÍGENOS Productos específicos parasitarios Utilizan anticuerpos (Acs) mono o policlonales Los Acs se inmovilizan en diferentes tipos de soporte sólido: microplacas, membranas cromatográficas y otros materiales inertes.

46 ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO DETECCIÓN DE COPROANTÍGENOS Duración del ensayo 1h:20 Placas con AcMo proteínas específicas: de la pared quística, membrana, etc. Giardia lamblia (GSA 65 CWP1) Cryptosporidium sp Entamoeba histolytica (lectina Gal/gal Nac) Cualitativo. > Sensibilidad Estudios de campo Costo Equipos VENTAJAS DESVENTAJAS

47 INMUNOFLUORESCENCIA Giardia lamblia Crypstosporidium sp Microsporidios VENTAJAS Mayor sensibilidad DESVENTAJAS Costo Microscopio IF

48 INMUNOCROMATOGRÁFICOS FUNDAMENTO Reacción Ag-Ac colorimétrica Técnica cualitativa Heces frescas. No concentradas. Diluidas en buffer NaNO 3 al 0,1%. Ac conjugado con fosfatasa alcalina a un sustrato (indoxil fosfato) la reacción positiva da una línea azul. AcMo ESPECÍFICOS E.histolytica proteína 29kDa G.lamblia a-l-giardina C. parvum proteína disulfido isomerasa Sensibilidad y especificidad menor para E. histolytica

49 DETECCIÓN DE ANTICUERPOS Única herramienta: Estrongiloidiasis, Fascioliasis. Herramienta complementaria: Amebiasis, Criptosporidiosis, Giardiasis. Se realizan en suero. Presentan mayor sensibilidad que las técnicas clásicas. VENTAJAS Buena sensibilidad y especificidad. Control de tratamiento, negativización/ quimioterapia eficaz. Diferenciación especies de amebas. Procesar gran número de muestras simultáneamente. DESVENTAJAS: COSTOS

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51 EN SUMA: Recursos de cada laboratorio. Población a estudiar. Orientación clínica Implementación de coloraciones permanentes. Capacitación Controles Métodos tradicionales siguen siendo los de primera línea. Racionalización de todos los recursos.

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