N Latex HCY OPAX G03 C0541 H/CS 1

Transcripción

1 N Latex HCY Intended Use In vitro diagnostic reagents for the quantitative determination of total homocysteine (HCY) in human serum, heparinized plasma and EDTA plasma by means of particle-enhanced immunonephelometry with BN* II and BN ProSpec Systems. Summary and Explanation Homocysteine is an amino acid derived from methionine, requiring folic acid, vitamin B6 and B12 for further metabolisation. Homocysteine exists both in free but predominantly in and protein-bound form. Mutations in the genes coding for the enzymes involved in homocysteine metabolism, e.g. MTHFR (5,10-methylene-tetrahydrofolate reductase), result in hyperhomocysteinemia 1,2. Folic acid, vitamin B6 and vitamin B12 are necessary cofactors for a proper breakdown of homocysteine, deficiencies of these vitamins are associated with increased plasma levels of homocysteine 1-3. Homozygous mutationen of CBS (cystathionine-β-synthase) gene causes severe hyperhomocysteinemia along with homocysteinuria. Hyperhomocysteinemia was found to be associated with an increased risk for ischemic heart disease, stroke, peripheral arterial disease and deep venous thrombosis 1-4, as well as for neural tube defects and preeclampsia in pregnancy 3. High concentrations of homocysteine in blood induces endothelial dysfunction, suggesting a causal role in vascular disease 2,3. An increased frequency of hyperhomocysteinemia is observed especially in elderly, smokers, patients with renal disease, diabetes, or on a strict vegetarian diet 3. Determination of homocysteine is recommended for cardiovascular risk assessment and assessment of thrombophilia and for exclusion of folic acid, vitamin B 6 or B 12 deficiency in patients at high risk. Principle of the Method Competitive Assay Bound homocysteine in the sample is reduced to free homocysteine by the action of dithiothreitol, and then converted enzymatically to S-adenosyl-homocysteine (SAH) in the next step. Conjugated S-adenosyl-cysteine (SAC), added at the onset of the reaction, competes with the SAH in the sample for bonding by anti-sah antibodies bound to polystyrene particles. In the presence of SAH, there is either no aggregation or a weaker aggregation of particles. In the absence of SAH in the sample, an aggregation of the polystyrene particles by the conjugated SAC occurs. The higher the SAH content of the reaction mixture is, the smaller the scattered light signal will be. The result is evaluated by comparison with a standard of known concentration. Reagents Materials provided N Latex HCY, Code No. OPAX N HCY Reagent, three vials with 1.7 ml each N HCY RA, three vials with 2.2 ml each N HCY SR A, three vials with 0.6 ml each N HCY SR B, three vials with 1.1 ml each Composition N HCY Reagent consists of a suspension of polystyrene particles coated with a monoclonal anti-sah antibody (mouse) (< 0.1 g/l). N HCY RA consists of a buffered, stabilized solution of the reduction agent dithiothreitol (< 0.5 g/l) and adenosine (< 20 mg/l). N HCY SR A consists of a buffered, stabilized solution of the enzyme S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase (recombinant) (< 100 ku/l). N HCY SR B consists of a buffered, stabilized solution of a conjugate of SAC with porcine thyreoglobulin (PTG-SAC) (< 0.1 g/l). Preservative N HCY SR after mixing of N HCY SR A and N HCY SR B: sodium azide < 1 g/l Warnings and Precautions 1. For in vitro diagnostic use only. 2. In vitro diagnostics containing sodium azide must be handled with due caution: Do not ingest or allow contact with skin or mucous membranes. Sodium azide can form explosive azides if it comes into contact with heavy metals such as copper or lead. Preparation of the Reagent N HCY Reagent and N HCY RA are supplied ready-for-use. N HCY Reagent should be shaken carefully before its first use. N HCY SR: Pipette the whole contents of a vial of N HCY SR A into a vial of N HCY SR B and mix by shaking gently. Storage and Stability Store the reagents protected from light! Storage at +2 to +8 C: see expiry date on the label; Stability once opened: two weeks (N HCY Reagent, N HCY RA and N HCY SR mixture), if bottles are sealed tightly again immediately after use and stored at +2 to +8 C. Do not freeze the reagents. On-board Stability: N HCY Reagent, N HCY RA and N HCY SR mixture, a minimum of three days, at eight hours per day, or a comparable period of time. Note: On-board stability may vary, depending on the BN* System used and laboratory conditions. For further details, refer to BN* II and BN ProSpec System Instruction Manual. Materials required, but not provided BN* II or BN ProSpec System N Protein Standard SL (human), Code No. OQIM N/T Protein Control SL/L (human), Code No. OQIN N/T Protein Control SL/M (human), Code No. OQIO N/T Protein Control SL/H (human), Code No. OQIP N Diluent, Code No. OUMT BN* II Evaporation Stoppers (optional), Code No. OVLE Additional materials and supplies as described in your BN* System Instruction Manual. Specimens To minimize synthesis of HCY in erythrocytes after drawing, it is strictly recommended to prepare the patient samples as follows: Store blood samples on ice immediately following venipuncture and centrifuge within one hour to separate the plasma or serum from the blood cells. For testing, use the freshest possible (stored for a maximum of seven days at +2 to +8 C) or frozen human serum, heparinized plasma or EDTA plasma samples. Samples can be stored at below -20 C for up to three months, if they are frozen within 24 hours after collection and if repeated freeze-thaw cycles are avoided. Serum samples must be coagulated completely and, after centrifugation, must not contain any particles or traces of fibrin. Lipemic samples, or frozen samples which are turbid after thawing, must be clarified by centrifugation (10 minutes at approximately 15,000 x g) prior to testing. The use of different sample types is not recommended for patient s monitoring. Procedure Notes 1. Consult your BN* System Instruction Manual for details regarding operation of the instrument. 2. Reagents and samples stored at +2 to +8 C can be used immediately for testing on the BN* II and BN ProSpec System. Assay Protocol for the BN* Systems The assay protocol for serum and plasma is given in the BN* System Instruction Manual and the software of the instrument. All steps are performed automatically by the system. Establishment of the Reference Curve Reference curves are generated by multi-point calibration. Serial dilutions of the N Protein Standard SL are automatically prepared by the instrument using N Diluent. The standard dilutions must be used within four hours. The reference curve is valid for two weeks and can be used beyond this period as long as controls with corresponding method depending target values, e. g. N/T Protein Control SL/L, M and H are recovered within their respective confidence interval. If a different lot of reagent is used, a new reference curve must be generated. The exact measuring range depends upon the concentration of the analyte in each lot of N Protein Standard SL. For typical figures refer to the respective BN* System Instruction Manual. Assay of Specimens Samples are automatically diluted 1:5 with N Diluent. The dilutions must be measured within four hours. If the results obtained are above the measuring range, the assay can be repeated using a higher dilution of the sample. Refer to your BN* System Instruction Manual for information on repeat measurements using other dilutions. Internal Quality Control Assay N/T Protein Controls SL/L, M and H after each establishment of a reference curve, the first use of a reagent vial as well as with each series of samples. The controls are assayed and evaluated as for patient samples. Assigned value and confidence interval for the controls are listed in the respective Table of Assigned Values. If a result of the controls is outside the confidence interval, the determination must be repeated. If the repeated determination confirms the deviation, a new reference curve should be established. Do not release patient results until the cause of the deviation has been identified and corrected. Results The results are evaluated automatically and are represented in µmol/l or in a unit selected by the BN* System user. Limitations of the Procedure Samples containing particles must be centrifuged prior to testing. Lipemic samples which cannot be clarified by centrifugation (10 minutes at approximately 15,000 x g) must not be used. No interference was observed from bilirubin up to 600 mg/l, triglycerides up to 3.7 g/l as well as from rheumatoid factors up to 1,200 IU/mL. The following drugs, 6-azauridine-triacetate, carbamazepine, methotrexate, nitrous oxide and phenytoin, may elevate the homocysteine concentrations 5. Patient samples may contain heterophilic antibodies which may lead to false high or false low results in immunoassays. This assay is designed to minimize the influence of heterophilic antibodies. However, a complete suppression of their effects cannot be guaranteed. Dade Behring has validated use of these reagents on various analyzers to optimize product performance and meet product specifications. User defined modifications are not supported by Dade Behring as they may affect performance of the system and assay results. It is the responsibility of the user to validate modifications to these instructions or use of the reagents on analyzers other than those included in Dade Behring Application Sheets or these instructions for use. Results of this test should always be interpreted in conjunction with the patient s medical history, clinical presentation and other findings. Due to matrix effect, inter-laboratory survey samples and control samples may yield results that differ from those obtained with other methods. It may therefore be necessary to assess these results in relation to method-specific target values. Serum/plasma comparison studies using the N Latex HCY assay yielded results for serum which were more than 10 % higher than those for EDTA plasma. Therefore it is not recommended to interchangeably report results for the same patient using either serum or EDTA plasma. No significant difference in homocysteine concentration was observed between EDTA and heparinized plasma. Reference Intervals Homocysteine concentration in plasma or serum of healthy individuals can vary with age, gender, geographical area, nutritional status, and genetic factors. Scientific literature reports reference intervals for adult males and females between 5 and 15 µmol/l. In a study on 800 apparently healthy individuals the 95. percentile was determined with 15.7 µmol/l homocysteine 6. In a study on 193 EDTA-plasma samples of healthy persons from Central Europe, the values obtained with N Latex HCY were in a range of 4.9 to 15.0 µmol/l (2.5 th to 97.5 th percentile). Nevertheless, each facility should determine its own reference intervals since values may vary depending on the population of specimen type studied. Specific Performance Characteristics Sensitivity The analytical sensitivity of the assay is given by the lower limit of the reference curve and depends therefore on the concentration of the analyte in the N Protein Standard SL. A typical limit of detection for homocysteine is 2 µmol/l for measurements performed using a sample dilution of 1:5. Specificity No cross-reactivity of the applied antibody is known. Plasma samples spiked with different concentrations of adenosine (up to 1 mm), S-adenosyl-L-menthionine (up to 0.5 mm), L-cystathionine (up to 2 mm), L-cysteine (up to 5 mm), L-methionine (up to 0.4 mm) or homocysteine-thiolactone (up to 0.1 mm) showed a deviation in results compared to the respective result of the non-spiked sample of < 5.0% and < 1.0% for L-cysteine, respectively. Precision The following coefficients of variation (CV) were obtained with N Latex HCY (n = 40) on a BN* System: Mean Value Intra Assay Inter Assay Total Sample (µmol/l) CV (%) CV (%) CV (%) N/T Protein Control SL/L N/T Protein Control SL/M N/T Protein Control SL/H EDTA plasma pool EDTA plasma pool The results were evaluated by analysis of variance. Method Comparison The N Latex HCY (y) was compared to a commercially available immunoassay (x) by evaluating 73 plasma samples with homocysteine concentrations ranging from 4.83 to 38.4 µmol/l. Regression analysis of the results yielded the following equation: y = 0.97x µmol/l (r = 0.99). Note: The values cited for specific performance characteristics of the assay represent typical values and are not to be regarded as specifications for N Latex HCY. Bibliography 1. Stanger O, Herrmann W, Pietrzik K et al. DACH-LIGA Homocysteine (German, Austrian and Swiss Homocysteine Society): Consensus paper on the rational clinical use of homocysteine, folic acid and B-vitamins in cardiovascular and thrombotic diseases: guidelines and recommendations. Clin Chem Lab Med 2003; 41: The Homocysteine Studies Collaboration. Homocysteine and risk of ischemic heart disease and stroke. JAMA 2002; 288: Chambers JC, Seddon MDI, Shah S, Kooner JS. Homocysteine a novel risk factor for vascular disease. J R Soc Med 2001; 94: Herrmann W. The importance of hyperhomocysteinemia as a risk factor for diseases: an overview. Clin Chem Lab Med 2001; 39: Wald DS, Law M, Morris JK. Homocysteine and cardiovascular disease: evidence on causality from a meta-analysis. BMJ 2002; 325: Graham IM, Daly LE, Refsum HM, et al. Plasma homocysteine as a risk factor for vascular disease. The European Concerted Action Project. JAMA 1997; 277: OPAX G03 C0541 H/CS 1

2 BN ProSpec is a registered trademark of Dade Behring Marburg GmbH in the USA, Germany and other countries. * BN is a trademark of Dade Behring Marburg GmbH in the USA. Produced by Axis-Shield for Dade Behring N Latex HCY OPAX G03 C0541 H/CS 2 Edition August 2005 Anwendungsbereich In-vitro-Diagnostika zur quantitativen Bestimmung von Gesamt-Homocystein (HCY) in humanem Serum, Heparin-Plasma und EDTA-Plasma mittels partikelverstärkter Immunnephelometrie mit BN* II und BN ProSpec Systemen. Diagnostische Bedeutung Homocystein ist eine von Methionin abgeleitete Aminosäure, die zur weiteren Metabolisierung Folsäure und die Vitamine B6 und B12 benötigt. Homocystein existiert in freier, jedoch überwiegend in proteingebundener Form. Mutationen der an der Homocystein-Metabolisierung beteiligten Enzyme, z.b. MTHFR (5,10-Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase) führen zu Hyperhomocysteinämie 1,2. Folsäure sowie Vitamin B6 und B12 sind wichtige Kofaktoren für den Abbau von Homocystein; ein Mangel dieser Vitamine führt zu erhöhten Plasmaspiegeln von Homocystein 1-3. Homozygote Mutationen im CBS (Cystathionin-β-Synthase) Gen verursachen eine schwere Hyperhomocysteinämie mit Homocysteinurie. Hyperhomocysteinämie ist assoziiert mit einem erhöhten Risiko für ischämische Herzerkrankungen, Schlaganfall, periphere arterielle Erkrankungen und tiefe Beinvenenthrombosen 1-4, sowie mit Neuralrohrdefekten und Präeklampsie in der Schwangerschaft 3. Hohe Homocystein-Konzentrationen im Blut verursachen endotheliale Dysfunktionen, die auf eine kausale Rolle bei vaskulären Erkrankungen hinweisen 2,3. Ein gehäuftes Auftreten der Hyperhomocysteinämie wird besonders bei Älteren, Rauchern, Patienten mit Nierenerkrankungen, Diabetes und bei streng vegetarischer Ernährung 3 beobachtet. Die Bestimmung von Homocystein ist angezeigt im Rahmen einer kardiovaskulären Risikoabschätzung sowie zur Thrombophilieabklärung und bei Risikopatienten um einen Mangel an Folsäure, Vitamin B6 oder B12 auszuschließen. Prinzip der Methode Kompetitiver Assay Gebundenes Homocystein in der Probe wird durch Dithiothreitol zu freiem Homocystein reduziert, das im nächsten Schritt enzymatisch in S-Adenosyl-Homocystein (SAH) umgewandelt wird. Dem Reaktionsansatz zugesetztes konjugiertes S-Adenosyl-Cystein (SAC) konkurriert mit dem SAH der Probe um die Bindung durch an Polystyrol-Partikel gebundene Anti-SAH Antikörper. Bei Anwesenheit von SAH erfolgt keine bzw. eine abgeschwächte Aggregation der Partikel. Bei Abwesenheit von SAH in der Probe erfolgt eine Aggregation der Polystyrol-Partikel durch das konjugierte SAC. Je höher der SAH-Gehalt im Ansatz, um so geringer ist das Streulichtsignal. Die Auswertung erfolgt im Vergleich mit einem Standard bekannter Konzentration. Reagenzien Inhalt der Handelspackung N Latex HCY, Best.-Nr. OPAX N HCY Reagenz, drei Flaschen mit je 1,7 ml N HCY RA, drei Flaschen mit je 2,2 ml N HCY SR A, drei Flaschen mit je 0,6 ml N HCY SR B, drei Flaschen mit je 1,1 ml Zusammensetzung N HCY Reagenz besteht aus einer Suspension von Polystyrol-Partikeln, die mit einem monoklonalen Anti-SAH Antikörper (Maus) (< 0,1 g/l) beladen sind. N HCY RA besteht aus einer gepufferten, stabilisierten Lösung des Reduktionsmittels Dithiothreitol (< 0,5 g/l) und Adenosin (< 20 mg/l). N HCY SR A besteht aus einer gepufferten, stabilisierten Lösung, des Enzyms S-Adenosyl-L-Homocysteinhydrolase (rekombinant) (< 100 ku/l). N HCY SR B besteht aus einer gepufferten, stabilisierten Lösung eines Konjugates von SAC an Thyreoglobulin vom Schwein (PTG-SAC) (< 0,1 g/l). Konservierungsmittel N HCY SR nach Mischung von N HCY SR A und N HCY SR B: Natriumazid < 1 g/l Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen 1. Nur zur in-vitro-diagnostischen Anwendung. 2. Beim Umgang mit Natriumazid-haltigen in-vitro-diagnostika ist zu beachten: Verschlucken und Berührung mit Haut oder Schleimhäuten vermeiden. Natriumazid kann mit Schwermetallen, wie Kupfer oder Blei, explosive Azide bilden. Vorbereitung des Reagenzes N HCY Reagenz und N HCY RA sind gebrauchsfertig und können ohne weitere Vorbehandlung eingesetzt werden. N HCY SR: der gesamte Inhalt einer Flasche N HCY SR A ist in eine Flasche N HCY SR B zu pipettieren und durch leichtes Schütteln zu mischen. Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen Die Reagenzien sind lichtgeschützt zu lagern! Lagerung bei +2 bis +8 C: das Verfallsdatum ist auf dem Etikett angegeben; Stabilität nach Öffnen: zwei Wochen (N HCY Reagenz, N HCY RA und N HCY SR Mischung), sofern unmittelbar nach Gebrauch wieder dicht verschlossen bei +2 bis +8 C gelagert. Die Reagenzien dürfen nicht eingefroren werden. Stabilität auf BN* II und BN ProSpec Systemen: N HCY Reagenz, N HCY RA und N HCY SR Mischung minimal drei Tage mit jeweils acht Stunden oder einen vergleichbaren Zeitraum. Hinweis: Die on-board Stabilität hängt von dem verwendeten BN* System sowie den Laborbedingungen ab. Weiterführende Angaben sind in den Bedienungsanleitungen des BN* II und des BN ProSpec Systems enthalten. Zusätzlich benötigte Materialien BN* II oder BN ProSpec System N Protein-Standard SL (human), Bestell-Nr. OQIM N/T Protein-Kontrolle SL/L (human), Bestell-Nr. OQIN N/T Protein-Kontrolle SL/M (human), Bestell-Nr. OQIO N/T Protein-Kontrolle SL/H (human), Bestell-Nr. OQIP N-Diluens, Bestell-Nr. OUMT BN* II Evaporation Stoppers (wahlweise), Bestell-Nr. OVLE Verbrauchsmaterial und Ausrüstung wie in den Bedienungsanleitungen der BN* Systeme beschrieben. Untersuchungsmaterial Um die HCY Synthese in den Erythrozyten nach der Blutentnahme zu minimieren, sollten Patientenproben wie folgt behandelt werden: Blutproben sollen unmittelbar nach der Entnahme auf Eis gelagert und innerhalb von einer Stunde nach Entnahme zentrifugiert werden, um Plasma bzw. Serum von den Blutzellen zu trennen. Zur Messung sollen möglichst frische (max. sieben Tage bei +2 bis +8 C aufbewahrte) oder gefroren gelagerte humane Serum-, Heparinplasma- oder EDTA-Plasmaproben eingesetzt werden. Werden Proben innerhalb von 24 Stunden nach Entnahme eingefroren, so ist eine Lagerung unterhalb von -20 C bis zu drei Monaten möglich, wenn wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermieden wird. Serumproben müssen vollständig geronnen sein und dürfen nach Zentrifugation keine Partikel oder Spuren von Fibrin enthalten. Lipämische Proben oder eingefrorene Proben, die nach dem Auftauen trüb sind, müssen vor der Bestimmung durch Zentrifugation (10 Minuten bei ca x g) geklärt werden. Bei Verlaufskontrollen ist die Verwendung verschiedener Probenarten zu vermeiden. Testdurchführung Hinweise 1. Einzelheiten zur Bedienung der BN* Systeme sind der entsprechenden Bedienungsanleitung zu entnehmen. 2. Am BN* II und BN ProSpec System können bei +2 bis +8 C gelagerte Reagenzien und Proben direkt zur Bestimmung eingesetzt werden. Assay-Protokoll an den BN* Systemen Das Assay-Protokoll, für Serum und Plasma, ist in der Bedienungsanleitung sowie der Software des jeweiligen Gerätes enthalten. Alle Schritte werden automatisch vom System durchgeführt. Erstellung der Referenzkurve Referenzkurven werden über eine Mehrpunktkalibrierung erzeugt. Für die Erstellung werden automatisch Verdünnungsreihen des N Protein Standard SL mit N-Diluens hergestellt. Die Verdünnungen müssen innerhalb von vier Stunden verwendet werden. Die Referenzkurve ist zwei Wochen gültig. Sie kann über diesen Zeitraum hinaus verwendet werden, solange Kontrollen mit entsprechenden verfahrensabhängigen Sollwerten wie z.b. die N/T Protein-Kontrolle SL/L, M und H innerhalb ihres jeweiligen Vertrauensbereichs wiedergefunden werden. Bei Verwendung einer anderen Reagenzcharge muss eine neue Referenzkurve aufgenommen werden. Der exakte Messbereich hängt von der Analytkonzentration jeder N Protein Standard SL Charge ab. Typische Messbereiche sind in der jeweiligen BN* System Bedienungsanleitung angegeben. Messung der Patientenproben Proben werden automatisch 1:5 mit N-Diluens verdünnt. Die Verdünnungen müssen innerhalb von vier Stunden gemessen werden. Bei Messwerten, die oberhalb des Messbereichs liegen, kann die Messung aus einer höheren Probenverdünnung wiederholt werden. Wiederholungsmessungen aus weiteren Probenverdünnungen sind in den Bedienungsanleitungen der BN* Systeme beschrieben. Interne Qualitätskontrolle Die N/T Protein-Kontrollen SL/L, M und H sollten nach jeder Erstellung einer Referenzkurve, nach erstmaliger Verwendung einer Reagenzabfüllung sowie bei jeder Serie von Proben eingesetzt werden. Die Kontrollen werden im Ansatz und bei der Auswertung wie Patientenproben behandelt. Sollwert und Vertrauensbereich der Kontrollen sind der entsprechenden Tabelle der Sollwerte zu entnehmen. Wenn das Ergebnis der Kontrollmessung außerhalb des Vertrauensbereichs liegt, ist die Kontrollmessung zu wiederholen. Wird die Abweichung durch die Wiederholungsmessung bestätigt, sollte eine neue Referenzkurve aufgenommen werden. Patientenergebnisse dürfen erst dann freigegeben werden, wenn die Ursache der Abweichung identifiziert und behoben wurde. Ergebnisse Die Auswertung erfolgt automatisch in µmol/l oder in einer vom Benutzer am BN* System auszuwählenden abgeleiteten Einheit. Einschränkungen der Testdurchführung Proben, die Partikel enthalten, müssen vor der Bestimmung zentrifugiert werden. Lipämische Proben, die durch Zentrifugation (10 Minuten bei ca x g) nicht geklärt werden können, sind von der Bestimmung auszuschließen. Eine Störung durch Bilirubin bis zu 600 mg/l, Triglyceride bis zu 3,7 g/l sowie durch Rheumafaktoren bis 1200 IU/ml konnte nicht festgestellt werden. Medikamente wie 6-Azauridin-Triacetat, Carbamazepin, Distickstoffmonoxid, Methotrexat und Phenytoin können zu erhöhten Homocystein-Konzentrationen führen 5. Patientenproben können heterophile Antikörper enthalten, die in Immunoassays zu falsch-hohen oder falsch-niedrigen Ergebnissen führen können. Dieser Assay ist so ausgelegt, dass der Einfluss heterophiler Antikörper minimiert ist. Dennoch kann eine komplette Unterdrückung ihrer Effekte nicht garantiert werden. Dade Behring hat den Einsatz dieser Reagenzien auf verschiedenen Analysengeräten auf optimale Produktleistung und Einhaltung der Produktspezifikationen überprüft. Vom Benutzer vorgenommene Änderungen werden von Dade Behring nicht unterstützt, da sie die Leistung des Systems und die Testergebnisse beeinflussen können. Es liegt in der Verantwortung des Benutzers. Änderungen an diesen Anleitungen oder die Verwendung dieser Reagenzien auf anderen als in den Applikationsvorschriften von Dade Behring oder diesen Gebrauchsanweisungen genannten Analysengeräten zu validieren. Resultate dieses Tests sollten stets in Verbindung mit der Vorgeschichte des Patienten, dem klinischen Bild und anderen Untersuchungsergebnissen interpretiert werden. Aufgrund von Matrixeffekten können für Kontroll- und Ringversuchsproben unterschiedliche Ergebnisse in Abhängigkeit von der verwendeten Bestimmungsmethode resultieren. Es kann daher notwendig sein, die Bewertung dieser Ergebnisse an methoden-spezifischen Zielwerten vorzunehmen. Serum/Plasma Vergleichsstudien unter Verwendung von N Latex HCY ergaben für Serum um mehr als 10 % höhere Resultate als für EDTA-Plasma. Daher wird empfohlen, Ergebnisse für einen Patienten nicht im Wechsel zwischen Serum und EDTA-Plasma zu erheben. Zwischen EDTA- und Heparin-Plasma wurde kein signifikanter Unterschied der Homocystein-Konzentration ermittelt. Referenzbereich Homocystein-Konzentrationen in Plasma oder Serum gesunder Individuen können in Abhängigkeit vom Alter, Geschlecht, geografischen Gebiet, Ernährungsstatus und von genetischen Faktoren variieren. In der Literatur werden Referenzintervalle für erwachsene Männer und Frauen von 5 bis 15 µmol/l genannt. In einer Studie mit 800 augenscheinlich gesunden Probanden betrug die 95. Perzentile 15,7 µmol/l Homocystein 6. Bei einer Untersuchung der EDTA-Plasmaproben von 193 gesunden Erwachsenen aus Zentraleuropa lagen die mit dem N Latex HCY Reagenz ermittelten Ergebnisse im Bereich von 4,9-15,0 µmol/l (2,5. bis 97,5. Perzentile). Darüber hinaus sollte jedes Labor seine eigenen Referenzbereiche ermitteln, da die Ergebnisse in Abhängigkeit vom untersuchten Kollektiv und von der Probenart variieren können. Leistungsmerkmale der Bestimmung Empfindlichkeit Die analytische Empfindlichkeit der Bestimmung wird durch die untere Grenze der Referenzkurve festgelegt und ist damit abhängig von der Konzentration des Analyten im N Protein Standard SL. Eine typische Nachweisgrenze für Homocystein ist 2 µmol/l bei Messung aus einer Probenverdünnung von 1:5. Spezifität Es sind keine Kreuzreaktionen des verwendeten Antikörpers bekannt. Plasma Proben, denen unterschiedliche Konzentrationen an Adenosin (bis zu 1 mm), S-Adenoyl-L-Methionin (bis zu 0,5 mm), L-Cystathionin (bis zu 2 mm), L-Cystein (bis zu 5 mm), L-Methionin (bis zu 0,4 mm) oder Homocystein- Thiolacton (bis zu 0,1 mm) hinzugefügt wurden, erbrachten eine Abweichung der Resultate im Vergleich zu den entsprechenden Ergebnissen der Proben ohne Zusätze um < 5% bzw. <1 % für L-Cystein. Präzision Nachfolgende Variationskoeffizienten (VK) wurden mit N Latex HCY (n = 40) an einem BN System erhalten: Mittelwert Intra-Assay Inter-Assay Gesamt Probe (µmol/l) VK (%) VK (%) VK (%) N/T Protein-Kontrolle SL/L 6,7 4,5 7,3 8,5 N/T Protein-Kontrolle SL/M 11,0 3,4 5,6 6,6 N/T Protein-Kontrolle SL/H 22,3 4,6 3,7 5,9 EDTA Plasmapool 1 11,8 4,2 6,1 7,4 EDTA Plasmapool 2 32,9 2,7 3,7 4,6 Die Ergebnisse wurden mittels Varianzanalyse ermittelt. Methodenvergleich N Latex HCY (y) wurde verglichen mit einem kommerziell erhältlichen Immunoassay (x) durch Bestimmung von 73 Plasmaproben im Bereich von 4,8 bis 39,4 µmol/l Homocystein. Die Regressionsanalyse der Ergebnisse ergab die folgende Gleichung: y = 0,97 x + 0,06 µmol/l (r = 0,99). Anmerkung Die angegebenen Werte für die Leistungsmerkmale der Bestimmung stellen typische Ergebnisse dar und sind nicht als Spezifikation für N Latex HCY anzusehen. Literatur Siehe englische Packungsbeilage BN ProSpec ist eine eingetragene Marke der Dade Behring Marburg GmbH in den USA, Deutschland und anderen Ländern. * BN ist eine Marke der Dade Behring Marburg GmbH in den USA. Hergestellt von Axis-Shield für Dade Behring Ausgabe August 2005

3 N Latex HCY Domaine d utilisation Réactifs in vitro pour le dosage quantitatif de l homocystéine totale (HCY) dans le sérum ou le plasma hépariné ou prélevé sur EDTA, par immunonéphélémétrie sensibilisée avec des particules, à l aide des systèmes BN* II et BN ProSpec. Intérêt diagnostique L homocystéine est un acide aminé dérivé de la méthionine qui nécessite, pour poursuivre sa métabolisation, de l acide folique et les vitamines B6 et B12. L homocystéine existe sous forme libre, mais est le plus souvent liée aux protéines. Des mutations des enzymes participant à la métabolisation de l homocystéine, par ex. de la MTHFR (5,10-méthyl-tétra-hydrofolate réductase), entraînent une hyperhomocystinémie 1,2. L acide folique ainsi que les vitamines B6 et B12 sont des co-facteurs importants de la dégradation de l homocystéine ; un déficit de ces vitamines entraîne un taux plasmatique augmenté de l homocystéine 1-3. Les mutations homozygotes du gène de la CBS (cystathionine-β-synthase) provoquent l apparition d une hyperhomocystinémie sévère avec homocystinurie. L hyperhomocystinémie est associée à un risque augmenté de maladies cardiaques ischémiques, d attaque d apoplexie, de maladie artérielle périphérique, de thrombose veineuse profonde de la jambe 1,4, ainsi que de malformations du tube neuronal et de prééclampsie pendant la grossesse 3. Une concentration élevée d homocystéine dans le sang provoque des dysfonctionnements endothéliaux qui semblent jouer un rôle dans les maladies vasculaires 2,3. Une hyperhomocystinémie est plus fréquemment observée chez les sujets âgés, les fumeurs, les patients atteints de maladies rénales, les diabétiques, ainsi que chez les sujets strictement végétariens 3. Le dosage de l homocystéine est indiqué dans le cadre d une évaluation du risque cardio-vasculaire ainsi que pour clarifier une thrombophilie, et pour exclure un déficit en acide folique, en vitamine B6 ou B12 chez les sujets à risques. Principe de la méthode Test compétitif L homocystéine liée présente dans l échantillon est réduite, sous l action de dithiothréitol, en homocystéine libre, qui est ensuite enzymatiquement transformée au cours de l étape suivante en S-adénosylhomocystéine (SAH). La S-adénosyl-cystéine (SAC) conjuguée, ajoutée au mélange réactionnel, entre en compétition avec la SAH de l échantillon pour se fixer aux anticorps anti-sah fixés sur les particules de polystyrène. En présence de SAH, il n y a pas, ou qu une faible agrégation des particules. En l absence de SAH dans l échantillon, il y a agrégation des particules de polystyrène avec la SAC conjuguée. Plus le taux de SAH de l échantillon est élevé, plus le signal lumineux est faible. L exploitation se fait par comparaison avec un standard de concentration connue. Réactifs Conditionnement N Latex HCY, code OPAX N HCY Réactif, 3 flacons de 1,7 ml N HCY RA, 3 flacons de 2,2 ml N HCY SR A, 3 flacons de 0,6 ml N HCY SR B, 3 flacons de 1,1 ml Composition N HCY Réactif est composé d une suspension de particules de polystyrène recouvertes d anticorps monoclonaux (Souris) anti-sah (< 0,1 g/l). N HCY RA est composé d une solution tampon stabilisée du milieu de réduction composé de dithiothréitol (< 0,5 g/l) et d adénosine (< 20 mg/l). N HCY SR A est composé d une solution tampon stabilisée de l enzyme S-adénosyl-L-homocystéine hydrolase (recombinante) (< 100 ku/l). N HCY SR B est composé d une solution tampon stabilisée d un conjugué de SAC avec de la thyréoglobuline de porc (PTG-SAC) (0,1 gl/l). Agent de conservation : N HCY SR après mélange des réactifs N HCY SR A et B : azide de sodium < 1 g/l Mises en garde et précautions d emploi 1. A n'utilisier que pour un usage in vitro. 2. Les réactifs contenant de l azide de sodium doivent être manipulés avec précaution : ne pas avaler et éviter tout contact avec la peau et les muqueuses. L azide de sodium peut devenir explosif au contact de métaux lourds comme le cuivre ou le plomb. Préparation des réactifs N HCY Réactif et N HCY RA sont prêts à l emploi et peuvent être directement utilisés sans traitement préalable. N HCY SR : transférer à l aide d une pipette la totalité du contenu d un flacon de N HCY SR A dans un flacon de N HCY SR B, et mélanger en agitant avec précaution. Stabilités et conditions de conservation Les réactifs doivent être conservés à l abri de la lumière! Conservation à +2/+8 C : la date de péremption est indiquée sur l étiquette. Stabilité après ouverture : deux semaines (N HCY Réactif, N HCY RA et mélange N HCY SR), à condition de bien refermer les flacons et de les replacer à +2/+8 C immédiatement après emploi. Ne pas congeler les réactifs. Stabilité sur les systèmes BN* II et BN ProSpec : Le N HCY Réactif, le N HCY RA et le mélange N HCY SR se conservent au minimum pendant trois jours de travail de huit heures, ou sur une période équivalente. Remarque : la stabilité «on-board» dépend du système BN* utilisé ainsi que des conditions d analyse du laboratoire. Pour plus de détails, se reporter au manuel d utilisation des systèmes BN* II et BN ProSpec. Matériel et autres réactifs nécessaires Système BN* II ou BN ProSpec N Standard Protéines SL (humain), code OQIM N/T Contrôle Protéines SL/L (humain), code OQIN N/T Contrôle Protéines SL/M (humain), code OQIO N/T Contrôle Protéines SL/H (humain), code OQIP N-Diluant, code OUMT BN* II Bouchons anti-évaporation (utilisation optionnelle), code OVLE Consommable et équipement selon les instructions des manuels d utilisation des systèmes BN*. Echantillons à tester Pour minimiser la synthèse d HCY dans les érythrocytes après le prélèvement, traiter les échantillons de patients de la façon suivante : Placer les échantillons sanguins sur de la glace dès leur prélèvement, et les centrifuger dans l heure qui suit pour séparer le plasma ou le sérum des cellules sanguines. Utiliser des échantillons sériques ou plasmatiques prélevés sur héparine ou EDTA, humains, de préférence frais (conservés 7 jours maximum à +2/+8 C), sinon congelés. S ils sont congelés dans les 24 heures qui suivent leur prélèvement et conservés à < -20 C, ils peuvent être utilisés pendant 3 mois ; ne les congeler qu une seule fois. Les échantillons sériques doivent être totalement coagulés et ne plus contenir ni particules ni traces de fibrine après centrifugation. Les échantillons lipémiques ou devenus troubles après décongélation doivent être clarifiés par centrifugation (10 min à env g) avant leur emploi dans le test. L utilisation de différents types d échantillons n est pas recommandée pour le suivi des patients. Réalisation du test Remarques 1. Pour plus de détails sur l utilisation des systèmes BN*, se reporter au manuel d utilisation du système utilisé. 2. Les réactifs et échantillons conservés à +2/+8 C peuvent être directement utilisés sur les systèmes BN* II et BN ProSpec. Protocole de dosage sur les systèmes BN* Le protocole de dosage pour sérum et plasma est indiqué dans le manuel d utilisation ainsi que dans le logiciel de chaque système. Toutes les étapes sont effectuées automatiquement par le système. Etablissement de la courbe d étalonnage La courbe d étalonnage est établie selon une calibration en plusieurs points, à partir d une série automatique de dilutions du N Standard Protéines SL avec le N Diluant. Les dilutions doivent être utilisées dans les quatre heures. La courbe d étalonnage reste valable deux semaines. Pendant cette période, elle peut être utilisée aussi longtemps que les contrôles qui ont des valeurs théoriques spécifiques à la technique utilisée, par ex. les N/T Contrôles Protéines SL/L, M et H, sont retrouvés à l intérieur de leur domaine de confiance respectif. Etablir une nouvelle courbe d étalonnage à chaque changement de lot de réactif. Le domaine de mesure exact dépend de la concentration en HCY de chaque lot de N Standard Protéines SL. Des domaines de mesure types sont indiqués dans les manuels d utilisation des systèmes BN*. Mesure des échantillons de patients Les échantillons sont dilués automatiquement au 1/5 avec le N-Diluant. Les dilutions doivent être testées dans les 4 heures. Si on obtient des valeurs supérieures au domaine de mesure, refaire le dosage à une dilution plus élevée des échantillons. Pour le retest des échantillons à des dilutions supérieures, se reporter aux manuels d utilisation des systèmes BN*. Contrôle de qualité interne Introduire les N/T Contrôles Protéines SL/L, M et H à chaque nouvelle courbe d étalonnage, à chaque changement de flacon de réactif, ainsi qu à chaque nouvelle série d échantillons. Traiter les contrôles comme des échantillons de patients, aussi bien dans le test que pour l exploitation des résultats. Les valeurs théoriques des contrôles ainsi que leurs domaines de confiance sont indiqués dans le tableau des valeurs théoriques. Si les valeurs mesurées des contrôles sortent de leurs domaines de confiance, retester les contrôles. Si la déviation est confirmée, une nouvelle courbe d étalonnage doit être établie. Les résultats des patients ne peuvent être rendus qu après avoir identifié et éliminé la cause de la déviation. Résultats L exploitation se fait automatiquement. Les résultats sont rendus en µmol/l, ou dans l unité choisie par l utilisateur du système BN*. Limites du test Les échantillons qui contiennent des particules doivent être centrifugés avant le test. Les échantillons lipémiques qui ne peuvent être clarifiés par centrifugation (10 min à env x g) doivent être exclus du test. Aucune perturbation n a été observée en présence de bilirubine jusqu à 600 mg/l, de triglycérides jusqu à 3,7 g/l, ni de facteurs rhumatoïdes jusqu à 1200 UI/ml. Les médicaments comme le 6- azauridine triacétate, la carbamazépine, le monoxyde de diazote, le méthotrexate ou la phénytoïne peuvent entraîner une augmentation de la concentration d homocystéine 5. Les échantillons de patients peuvent contenir des anticorps hétérophiles qui peuvent provoquer des résultats faussement élevés ou faussement diminués dans les tests immuno-enzymatiques. Ce test a été mis au point de façon à minimiser l influence des anticorps hétérophiles. Cependant, leur élimination complète ne peut être garantie. Dade Behring a validé l utilisation de ces réactifs sur différents systèmes pour optimiser leur efficacité et vérifier qu ils remplissent les spécifications définies. Dade Behring n est pas responsable des modifications apportées par les utilisateurs dans la mesure où elles peuvent modifier les performances du produit et les résultats des analyses. Il est de la responsabilité de l utilisateur de valider toute modification du protocole indiqué, ou toute utilisation de ces réactifs sur d autres systèmes que ceux indiqués dans les protocoles d adaptation de Dade Behring ou dans la fiche technique. Les résultats de ce test doivent toujours être interprétés en liaison avec l historique du patient, son tableau clinique ainsi que les résultats des autres analyses. Du fait d effets matriciels, les résultats obtenus dans le cadre de contrôles nationaux peuvent diverger selon la méthode de dosage utilisée. Il peut dans ces cas-là être nécessaire d évaluer les résultats selon des valeurs-cibles spécifiques à chaque méthode. Des études comparatives sérum/plasma ayant utilisé le test N Latex HCY ont montré que les résultats sur sérum étaient de plus de 10% supérieurs à ceux obtenus sur plasma prélevé sur EDTA. Aussi estil recommandé de ne pas rendre pour un même patient des résultats alternativement obtenus sur sérum et sur plasma prélevé sur EDTA. Aucune différence significative de concentration d homocystéine n a par contre été observée entre un test effectué sur plasma hépariné et un autre sur plasma prélevé sur EDTA. Domaine de référence La concentration en homocystéine dans le plasma ou le sérum d individus sains peut varier selon l âge, le sexe, la région géographique, l état nutritif et les facteurs génétiques. La littérature indique un intervalle de référence compris entre 5 et 15 µmol/l pour les hommes et les femmes adultes. Une étude portant sur 800 sujets apparemment sains a donné un 95 ème percentile à 15,7 µmol/l d homocystéine 6. Une étude effectuée sur des échantillons plasmatiques prélevés sur EDTA provenant de 193 adultes sains d Europe centrale a donné avec N Latex HCY des résultats couvrant un domaine de 4,9 à 15,0 µmol/l (2,5 ème 97,5 ème percentiles). Néanmoins, chaque laboratoire doit déterminer son propre domaine de référence dans la mesure où celui-ci peut varier considérablement en fonction du collectif et des échantillons étudiés. Caractéristiques du dosage Sensibilité La sensibilité analytique du dosage est déterminée par la limite inférieure de la courbe d étalonnage, et dépend donc de la concentration en HCY du N Standard Protéines SL. Le seuil de mise en évidence type pour l homocystéine est de 2 µmol/l, pour une dilution au 1/5 des échantillons. Spécificité Aucune réaction croisée de l anticorps utilisé n a été observée. Des échantillons plasmatiques additionnés de concentrations différentes d adénosine (jusqu à 1 mm), de s-adénosyl-l-méthionine (jusqu à 0,5 mm), de L-cystathionine (jusqu à 2 mm), de L-cystéine (jusqu à 5 mm), de L-méthionine (jusqu à 0,4 mm) ou d homocystéine-thiolactone (jusqu à 0,1 mm), ont donné des résultats < 5% et < 1% pour la L- cystéine par rapport à des échantillons non additionnés. Précision Les coefficients de variation (CV) suivants ont été obtenus avec le N Latex HCY (n = 40) sur un système BN* : Précision Valeur moyenne Répétabilité Reproductibilité Total Echantillon (µmol/l) CV (%) CV (%) CV (%) N/T Contrôle Protéines SL/L 6,7 4,5 7,3 8,5 N/T Contrôle Protéines SL/M 11,0 3,4 5,6 6,6 N/T Contrôle Protéines SL/H 22,3 4,6 3,7 5,9 Pool de plasmas EDTA 1 11,8 4,2 6,1 7,4 Pool de plasmas EDTA 2 32,9 2,7 3,7 4,6 Les résultats ont été obtenus par une analyse de variance. Comparaison avec une autre méthode Le test N Latex HCY (y) a été comparé avec un test d immunoanalyse du commerce (x), en testant 73 échantillons plasmatiques couvrant un domaine de concentrations allant de 4,8 à 39,4 µmol/l d homocystéine. L analyse de régression des résultats a donné l équation suivante : y = 0,97 x + 0,06 µmol/l (r = 0,99). Remarque Les valeurs indiquées comme caractéristiques du dosage représentent des résultats types et ne doivent pas être considérées comme des spécifications du test N Latex HCY. Littérature Voir mode d'emploi anglais. BN ProSpec est une marque déposée de Dade Behring Marburg GmbH aux USA, en Allemagne et dans d autres pays. * BN est une marque de Dade Behring Marburg GmbH aux USA. Fabriqué par Axis-Shield pour Dade Behring Edition Août 2005 OPAX G03 C0541 H/CS 3

4 N Latex HCY Settore d impiego Diagnostici in vitro per la determinazione quantitativa della omocisteina totale (HCY) nel siero umano, plasma eparinizzato o EDTA, mediante immunonefelometria amplificata con particelle con l impiego sui sistemi BN* II e BN ProSpec. Significato diagnostico La omocisteina è un aminoacido che si forma dalla metionina, il quale necessita di acido folico e vitamina B6 e B12 per l ulteriore metabilizzazione. L omocisteina esiste sia in forma libera sia prevalentemente in forma a legame proteico. Mutazioni nella codifica dei geni per gli enzimi coinvolti nel metabolismo dell omocisteina, es. MTHFR (5,10-metilen-tetraidrofolato-reduttasi) generano iperomocisteinemia 1,2. L acido folico, la vitamina B6 e la vitamina B12 sono cofattori necessari per il catabolismo dell omocisteina, carenze di queste vitamine sono associate con aumentati livelli plasmatici di omocisteina 1-3. La mutazione omozigote del gene della CBS (cistationina-β-sintetasi) causa grave iperomocisteinemia associata ad omocisteinuria. Si è riscontrato che iperomocisteinemia è associata con aumentato rischio di patologia cardiaca ischemica, ictus, patologie arteriose periferiche e trombosi venosa profonda 1-4, nonché difetti del tubo neurale e preeclampsia in gravidanza 3. L elevata concentrazione di omocisteina nel sangue induce disfunzione endoteliale, suggerendo un ruolo causale nella patologia vascolare 2,3. Un aumentata frequenza di iperomocisteinemia si osserva specialmente negli anziani, fumatori, pazienti con patologie renali, diabetici, o soggetti a dieta strettamente vegetariana 3. La determinazione dell omocisteina è raccomandata per la valutazione del rischio cardiovascolare e della trombofilia e per l esclusione di carenze di acido folico, vitamina B6 o B12 in pazienti ad alto rischio. Principio del metodo Test competitivo La omocisteina legata, presente nel campione, viene ridotta a omocisteina libera mediante ditiotreitolo e quindi trasformata in S-adenosil-omocisteina (SAH), attraverso l azione enzimatica. La S-adenosilcisteina coniugata (SAC), aggiunta alla miscela di reazione, concorre, con la SAH presente nel campione, a fissare gli anticorpi anti-sah fissati alla particelle di polistirene. In presenza di SAH, si osserva mancata aggregazione o aggregazione debole delle particelle. In assenza di SAH nel campione, avviene una aggregazione delle particelle di polisterene tramite la SAC coniugata. Più elevato è il contenuto di SAH nella miscela di reazione, minore è il segnale di scattering della luce. La valutazione del risultato avviene per confronto con uno standard a concentrazione nota. Reagenti Contenuto della confezione N Latex HCY, codice OPAX N Reagente HCY, 3 flaconi da 1,7 ml ciascuno N HCY RA, 3 flaconi da 2,2 ml ciascuno N HCY SR A, 3 flaconi da 0,6 ml ciascuno N HCY SR B, 3 flaconi da 1,1 ml ciascuno Composizione L N Reagente HCY è costituito da una sospensione di particelle di polistirene, ricoperte con anticorpi monoclonali anti-sah (murini) (< 0,1 g/l). L N HCY RA è costituito da una soluzione tamponata e stabilizzata dell agente riducente ditiotreitolo (< 0,5 g/l) ed adenosina (< 20 mg/l). L N HCY SR A è costituito da una soluzione tamponata e stabilizzata di enzima S-adenosil-L-omocisteina idrolasi (ricombinante) (< 100 ku/l). L N HCY SR B è costituito da una soluzione tamponata e stabilizzata di un coniugato di SAC e tireoglobulina suina (PTG-SAC) (< 0,1 g/l). Conservante N HCY SR dopo miscelazione di N HCY SR A e N HCY SR B. sodio azide: < 1 g/l Avvertenze e precauzioni 1. Solo per uso diagnostico in vitro. 2. Quando si impiegano diagnostici in vitro contenenti sodio azide, osservare le seguenti precauzioni: non ingerire ed evitare contatti con la cute e le mucose! La sodio azide, a contatto con metalli pesanti come rame e/o piombo, può formare azidi esplosive. Preparazione dei reagenti L N Reagente HCY e l N HCY RA vengono forniti pronti all uso. L N Reagente HCY deve essere mescolato delicatamente prima di iniziare il lavoro. N HCY SR: pipettare l intero contenuto di un flacone di N HCY SR A nel flacone dell N HCY SR B e mescolare, agitando delicatamente. Conservazione e stabilità Conservare i reagenti al riparo dalla luce! Stabilità a +2/+8 C: la data di scadenza è indicata sull etichetta del flacone. Stabilità dopo apertura: due settimane (Reagente N HCY, miscela N HCY RA e N HCY SR), se i flaconi vengono richiusi bene immediatamente dopo l uso e conservati da +2 a +8 C. Non congelare i reagenti. Stabilità sui sistemi BN*: Reagente N HCY, miscela N HCY RA e N HCY SR, un minimo di tre giorni, per otto ore al giorno, o per un periodo di tempo equivalente. Nota: la stabilità on-board dipende dal sistema BN* utilizzato e dalle condizioni del laboratorio. Per maggiori informazioni consultare il manuale d uso dei sistemi BN* II o BN ProSpec. Materiale necessario ma non fornito Sistema BN* II o BN ProSpec N Standard proteine SL (umano), codice OQIM N/T Controllo proteine SL/L (umano), codice OQIN N/T Controllo proteine SL/M (umano), codice OQIO N/T Controllo proteine SL/H (umano), codice OQIP N Diluente, codice OUMT Tappi antievaporazione per BN* II (facoltativo), codice OVLE Altro materiale ed attrezzature come descritto nel manuale d uso dei sistemi BN*. Campioni in esame Per minimizzare la sintesi eritrocitaria di HCY dopo il prelievo, è tassativo preparare i campioni dei pazienti nel seguente modo: Conservare i campioni di sangue in ghiaccio subito dopo il prelievo e centrifugare entro 1 ora, per separare il plasma o siero dalle cellule ematiche. Per il test si impiegano campioni di siero umano, plasma eparinizzato o plasma con EDTA possibilmente freschi (massimo 7 giorni a +2/+8 C) oppure conservati congelati. I campioni congelati entro 24 ore dal prelievo, possono essere utilizzati entro 3 mesi, purché conservati a temperature inferiori a -20 C, evitando ripetuti congelamenti e scongelamenti. I sieri devono essere completamente coagulati e, dopo centrifugazione, non devono presentare particelle o tracce di fibrina. I campioni lipemici e quelli che si presentano torbidi dopo lo scongelamento, devono essere chiarificati mediante centrifugazione (10 min. a x g) prima del test. L utilizzo di tipi diversi di campione non è raccomandato per il monitoraggio dei pazienti. Esecuzione del test Note: 1. Per maggiori informazioni sull uso dello strumento, consultare il manuale d uso del sistema BN*. 2. I reagenti e i campioni conservati a +2/+8 C, possono essere impiegati direttamente sul sistema BN* II e BN ProSpec. Protocollo analitico per i sistemi BN* Il protocollo analitico per il siero e il plasma è riportato nel manuale d uso del sistema BN* e nel software dello strumento. Tutte le fasi vengono eseguite automaticamente dallo strumento. Preparazione della curva di calibrazione Le curve di calibrazione vengono generate mediante calibrazione a più punti. Diluizioni seriali di N Protein Standard SL vengono preparate automaticamente dallo strumento utilizzando N Diluent. Le diluizioni dello standard devono essere utilizzate entro quattro ore. La curva di calibrazione è valida per due settimane e può essere utilizzata oltre tale periodo finché i controlli ed i corrispondenti valori target metodo-dipendenti, es. N/T Protein Control SL/L, M e H, rientrano nei rispettivi intervalli di accettabilità. Se viene utilizzato un lotto di reagente diverso, occorre generare una nuova curva di calibrazione. L intervallo di misura esatto dipende dalla concentrazione dell analita di ogni lotto di N Standard proteine SL. Per intervalli di misura tipici fare riferimento al rispettivo manuale d uso del sistema BN*. Misurazione dei campioni I campioni vengono diluiti automaticamente 1:5 con N Diluente. Le diluizioni devono essere misurate entro 4 ore. Se i risultati ottenuti si trovano al di fuori dell intervallo di misura, la misurazione deve essere ripetuta utilizzando una diluizione più alta del campione. Per maggiori informazioni sulla ripetizione della misurazione con altre diluizioni, consultare il manuale d uso del sistema BN*. Controllo di qualità interno Impiegare gli N/T Controlli SL/L, M e H dopo la preparazione di ogni curva di calibrazione, al primo impiego di un flacone di reagente e con ogni serie di campioni. I controlli vengono analizzati e valutati allo stesso modo dei campioni in esame. I valori di riferimento e l intervallo di accettabilità per i controlli sono elencati nelle rispettive Tabelle dei Valori Assegnati. Se il risultato del controllo si trova al di fuori dell intervallo di accettabilità, la determinazione deve essere ripetuta. Se anche questa seconda determinazione conferma la deviazione, è necessario preparare una nuova curva di calibrazione. Rilasciare i risultati dei pazienti solo dopo aver identificato e rimosso le cause della deviazione. Risultati I risultati vengono valutati automaticamente ed espressi in µmol/l o in altra unità selezionata dall Utilizzatore dei Sistemi BN*. Limitazioni della esecuzione del test Campioni contenenti particelle devono essere centrifugati prima dell analisi. Campioni lipemici che non possono essere chiarificati mediante centrifugazione (10 minuti a circa x g) non devono essere utilizzati. Non è stata rilevata interferenza da bilirubina fino a 600 mg/l, trigliceridi fino a 3,7 g/l, e da fattori reumatoidi fino a UI/mL. I seguenti farmaci: 6-azauridina-triacetato, carbamazepina, metotrexato, ossido d azoto e fenitoina, possono innalzare le concentrazioni di omocisteina 5. I campioni dei pazienti possono contenere anticorpi eterofili che possono portare a risultati falsamente elevati o falsamente bassi. Questo metodo è predisposto in modo tale da minimizzare l influenza degli anticorpi etrofili. Tuttavia, non è possibile garantire la completa eliminazione del loro effetto. Dade Behring ha validato l utilizzo di questi reagenti su vari analizzatori per ottimizzare i risultati e conformarsi alle specifiche del prodotto. Modifiche introdotte dagli Utilizzatori non sono supportate da Dade Behring perché potrebbero influire sulle prestazioni del sistema e sui risultati analitici. È responsabilità dell Utilizzatore validare modifiche apportate a queste istruzioni ovvero l impiego dei reagenti su analizzatori diversi da quelli elencati nei Protocolli Applicativi Dade Behring o nelle presenti istruzioni per l uso. I risultati di questo test devono essere interpretati unitamente all anamnesi clinica del paziente, il quadro clinico e altri referti. A causa dell effetto matrice, i risultati ottenuti per i campioni delle indagini inter-laboratori e per i campioni di controllo, possono differire a seconda del metodo usato. Pertanto è necessario valutare questi risultati in relazione ai valori di target specifici del metodo. Studi di confronto su siero/plasma utilizzando lo N Latex HCY hanno prodotto risultati che erano superiori di oltre il 10% rispetto a quelli ottenuti per il plasma EDTA. Pertanto non è consigliabile refertare scambievolmente i risultati dello stesso paziente utilizzando siero e plasma EDTA. Non è stata osservata differenza significativa per l omocisteina tra plasma EDTA e plasma eparinato. Intervallo di riferimento La concentrazione di omocisteina nel plasma o nel siero di individui sani dipende dall età, dal sesso, dall area geografica, dallo stato di nutrizione e dai fattori genetici. La bibliografia scientifica riporta intervalli di riferimento per maschi e femmine adulti compresi tra 5 e 15 µmol/l. In uno studio condotto su 800 individui apparentemente sani, il 95 percentile è stato determinato a 15,7 µmol/l di omocisteina 6. In uno studio su 193 campioni di plasma EDTA da soggetti sani dell Europa Centrale, i valori ottenuti con N Latex HCY sono risultati nell intervallo da 4,9 a 15,0 µmol/l (dal 2,5 al 97,5 percentile). Tuttavia, ogni laboratorio dovrebbe determinare il proprio intervallo di riferimento, poiché i valori possono variare a seconda della popolazione e tipo di campione esaminati. Caratteristiche specifiche del test Sensibilità La sensibilità analitica del test è data dal limite inferiore della curva di calibrazione e dipende, quindi, dalla concentrazione dell analita nell N Standard proteine SL. Tipicamente, il limite di rilevazione per l omocisteina è pari a 2 µmol/l per dosaggi eseguiti utilizzando una diluizione del campione di 1 : 5. Specificità Non si conoscono cross-reazioni dell anticorpo utilizzato. Campioni di plasma addizionati con concentrazioni diverse di adenosina (fino a 1mM), S-adenosil-L-metionina (fino a 0,5 mm), L-cistationina (fino a 2 mm), L-cisteina (fino a 5 mm), L-metionina (fino a 0,4 mm) o omocisteina-tiolattone (fino a 0,1 mm) hanno mostrato una deviazione dei risultati per la L-cisteina rispettivamente < 5,0% e < 1,0% in confronto ai rispettivi risultati dei campioni non addizionati. Precisione Sono stati ottenuti i seguenti coefficienti di variazione (CV) con N Latex HCY (n = 40) su un Sistema BN*: Precisione Valore medio Intra-ciclo Inter-ciclo Totale Campione (µmol/l) CV (%) CV (%) CV (%) N/T Protein Controllo SL/L 6,7 4,5 7,3 8,5 N/T Protein Controllo SL/M 11,0 3,4 5,6 6,6 N/T Protein Controllo SL/H 22,3 4,6 3,7 5,9 Pool Plasma EDTA 1 11,8 4,2 6,1 7,4 Pool Plasma EDTA 2 32,9 2,7 3,7 4,6 I risultati sono stati valutati mediante analisi della varianza. Confronto del metodo Lo N Latex HCY (y) è stato confrontato con un immunodosaggio del commercio (x) valutando 73 campioni di plasma con concentrazioni di omocisteina comprese tra 4,83 e 38,4 µmol/l. L analisi della regressione dei risultati ha prodotto la seguente equazione: y = 0,97 x + 0,06 µmol/l (r = 0,99). Nota: i valori indicati per le caratteristiche specifiche del test rappresentano valori tipici e non devono essere considerati come specifiche per l N Latex HCY. Bibliografia Vedi testo Inglese. BN ProSpec è un marchio registrato della Dade Behring Marburg GmbH negli USA, in Germania e negli altri Paesi. * BN è un marchio registrato della Dade Behring Marburg GmbH negli USA. Prodotto da Axis-Shield per Dade Behring. N Látex HCY Edizione Agosto 2005 Campos de aplicación Reactivos de diagnóstico in-vitro para la determinación cuantitativa de la homocisteína total (HCY), en sueros humanos y en plasmas heparínicos o EDTA, por medio de inmunonefelometría con partículas intensificadoras usando los sistemas BN* II y BN ProSpec. OPAX G03 C0541 H/CS 4

5 Significado diagnóstico La homocisteína es un aminoácido derivado de la metionina, requerido para la metabolización posterior del ácido fólico y de las vitaminas B6 y B12. La homocisteína existe en forma libre, sin embargo, predomina en forma combinada con proteínas. Las mutaciones de las enzimas pertenecientes al metabolismo de la homocisteína, como por ej., MTHFR (5,10-metilen-tetrahidrofolat-reductasa) conducen a hiperhomocisteinemia 1,2. El ácido fólico, así como las vitaminas B6 y B12 son cofactores importandes para la descomposición de la homocisteína; una deficiencia de estas vitaminas conduce a la elevación del nivel de homocisteína en el plasma 1-3. Mutaciones homocigotas en el gen de la CBS (cistationin-βsintasa) ocasionan una hiperhomocisteinemia fuerte con homocisteinuria. La hiperhomocisteinemia está asociada con el riego elevado a enfermedades isquémicas del corazón, infarto, enfermedades arteriales periféricas y trombosis venosa profunda 1-4, así como, con defectos del tubo neural y preclancia en el embarazo 3. Concentraciones elevadas de homocisteína en sangre ocasionan disfunciones endoteliales, las cuales sugieren un papel causal en enfermedades vasculares 2,3. Un aumento de la frecuencia de hiperhomocisteinemia se observa especialmente en ancianos, fumadores, pacientes con enfermedades de los riñones, diabetes y en dietas altamente vegetarianas 3. La determinación de homocisteína es recomendada en el marco de la evaluación de un riesgo cardiovascular, así como para aclarar una trombofilia y para excluir, en pacientes con riego, una deficiencia en ácido fólico, vitamina B6 o B12. Principio del método Ensayo competitivo La homocisteína enlazada en la muestra va a ser reducida a homocisteína libre por medio de ditioteitrol y en la siguiente etapa va a ser transformada enzimáticamente en S-adenocil-homocisteína (SAH). La S-adenocil-cisteína (SAC) conjugada, añadida al comienzo de la reacción, va a competir con el SAH de la muestra en la unión a los anticuerpos Anti-SAH unidos a las partículas de poliestireno. En presencia de SAH, o no hay agregación o solamente una agregación muy débil de partículas. En ausencia del SAH ocurre una agregación de las partículas de poliestireno por medio de la SAC conjugada. Entre más alto sea el contenido de SAH en la mezcla de reacción, más pequeña va a ser la señal de la luz dispersada. La valoración se efectúa por comparación con un estándar de concentración conocida. Reactivos Contenido del envase comercial N Látex HCY, N de pedido OPAX Reactivo N HCY, 3 frascos c/u con 1,7 ml N HCY RA, 3 frascos c/u con 2,2 ml N HCY SR A, 3 frascos c/u con 0,6 ml N HCY SR B, 3 frascos c/u con 1,1 ml Composición El Reactivo N HCY está compuesto por una suspensión de partículas de poliestireno recubiertas con anticuerpos monoclonales anti-sah (ratón) (< 0,1 g/l). El N HCY RA está formado por una solución tamponada y estabilizada del medio de reducción ditiotreitol (<0,5 g/l) y de adenosina (<20 mg/l). El N HCY SR A está compuesto por una solución tamponada y estabilizada de la enzima S-adenocil-Lhomocisteín- hidrolaza (recombinante) (< 100 ku/l). El N HCY SR B está compuesto por una solución tamponada y estabilizada de un conjugado de SAC y tireoglobulina de cerdo (PTG-SAC) (< 0,1 g/l). Agente de conservación: N HCY SR después de mezclar N HCY SR A y N HCY SR A: Azida de sodio < 1 g/l Advertencias y medidas de seguridad 1. Sólo para ser utilizado en diagnósticos in-vitro. 2. En el manejo de diagnósticos in-vitro que contengan azida sódica debe observarse la siguiente regla: No ingerir y evitar contacto con la piel y mucosas!. Al eliminar en las aguas residuales lavar con bastante agua. La azida sódica puede formar azidas explosivas con metales como cobre y plomo. Preparación de los reactivos El reactivo N HCY y el N HCY RA vienen listo para ser usados y pueden usarse directamente sin necesidad de ningún tratamiento. N HCY SR: Pipetear el contenido total de un frasco de N HCY SR A en un frasco de N HCY SR B y mezclar por agitación suave. Estabilidad y condiciones de almacenamiento Almacene los reactivos protegidos de la luz! Almacenamiento entre +2 y +8 C: La fecha de vencimiento viene indicada en la etiqueta; Estabilidad después de abierto: dos semanas, (reactivo N HCY, N HCY RA y la mezcla N HCY SR), siempre que después de usarse, se mantengan perfectamente cerrados y almacenados entre +2 y +8 C. Los reactivos no se deben congelar. Estabilidad en los sistema BN* II y BN ProSpec : El reactivo N HCY, el N HCY RA y la mezcla N HCY SR minimo tres días, 8 horas por día o un periodo de tiempo comparable. Advertencia: La estabilidad on board depende del sistema BN* utilizado, así como de las condiciones del laboratorio. Para más información consultar los manuales de operación de los sistemas BN* II y BN ProSpec. Material adicional necesario Sistemas BN* II o BN ProSpec N Proteína estándar SL (humana), N de pedido OQIM N/T Proteína control SL/L, (humana), N de pedido OQIN N/T Proteína control SL/M, (humana), N de pedido OQIO N/T Proteína control SL/H, (humana), N de pedido OQIP N Diluyente, N de pedido OUMT Tapón protector de evaporación para el BN* II (opcional), N de pedido OVLE Otros materiales y equipos necesarios vienen descritos en los manuales de operación de los Sistemas BN*. Material a investigar Para minimizar la síntesis de HCY en los eritrocitos después de la toma de sangre, las muestras de pacientes deben ser tratadas de la siguiente manera: Las muestras de sangre deben colocarse sobre hielo inmediatamente después de su toma y deben ser centrifugadas dentro de la siguiente hora, para poder separar el plasma o el suero de las células sanguíneas. Para las medidas se deben usar, en lo posible, muestras de sueros humanos frescas (máx. conservadas 7 días entre +2 y +8 C) o muestras almacenadas congeladas de sueros humanos, plasmas con heparina o con EDTA. Si las muestras de suero se congelan dentro de las 24 horas subsiguientes a su toma, se pueden almacenar por debajo de -20 C durante 3 meses, siempre que se evite su repetida congelación y descongelación. Las muestras de suero deben estar perfectamente coaguladas y no presentar partículas o restos de fibrina después de centrifugadas. Las muestras lipémicas o las muestras congeladas, que presenten turbidez después de su descongelación, deben ser aclaradas por centrifugación (10 min. a aprox x g) antes de empezar con la determinación. Al monitorear los pacientes se debe evitar el uso de diferentes tipos de muestras. Procedimiento Advertencias 1. Para una detallada información sobre el manejo de los Sistemas BN* consultar el manual de operaciones del sistema correspondiente. 2. En los sistemas BN* II y BN ProSpec se pueden utilizar los reactivos almacenados entre +2 y +8 C y las muestras directamente en la determinación. Protocolo del ensayo en los sistemas BN* Los protocolos de ensayo para sueros y plasmas vienen descritos en los correspondientes manuales de operación, así como también, en el software del aparato correspondiente. Todas las etapas van a ser realizadas por el sistema de forma automática. Preparación de la curva de referencia Las curvas de referencia se hacen sobre una calibración de varios puntos. Para su elaboración se preparan automáticamente una serie de diluciones del N Proteína estándar SL con el N Diluyente. Las diluciones deben ser usadas dentro de las cuatro horas siguiente. La curva de referencia es válida por dos semanas. Esta curva puede ser utilizada por más tiempo, siempre que los control, con valores OPAX G03 C0541 H/CS 5 teóricos dependientes del proceso, como por ej., los N/T Proteína controles SL/L, M y H se encuentren dentro de su respectivo rango de confianza al repetir la medida. Al utilizar un nuevo lote de reactivos se debe hacer una nueva curva de referencia. El rango exacto de medida depende de la concentración del analito en cada lote del N Proteína estándar SL. Los rangos de medida típicos vienen dados en el manual de operaciones del sistema BN* respectivo. Medida de las muestras de pacientes Las muestras van a ser automáticamente diluidas 1:5 con N Diluyente y deben ser medidas dentro de las 4 horas siguientes. Para los valores medidos que se encuentren por encima del rango de medida, se puede repetir la medida en una dilución mayor de la muestra. La repetición de las medidas a otras diluciones de las muestras vienen descrita en los manuales de operaciones de los sistemas BN*. Control de calidad interno Los N/T Proteína controles SL/L, M y H se debe usar, después de cada elaboración de una curva de referencia, después de abrir un frasco del reactivo por primera vez, así como, con cada serie de muestras. Los controles se deben tratar en su preparación y medida como las muestras de pacientes. Los valores teóricos y los rangos de confianza se deban tomar de la Tabla de valores teóricos de los correspondientes controles. Si los resultados de las medidas del control se encuentran por fuera de su rango de confianza, se debe repetir la determinación del control. Si después de la repetición, se comprueba la desviación, se debe realizar una nueva curva de referencia. Los resultados de los pacientes deben ser entregados únicamente cuando la causa de esta desviación sea conocida y eliminada. Resultados La valoración se efectúa automáticamente en µmol/l o en una unidad escogida por el usuario en el sistema BN*. Limitaciones del procedimiento Las muestras que contengan partículas, deben ser centrifugadas antes de empezar con la determinación. Las muestras lipémicas que no se puedan aclarar mediante centrifugación (10 min., a aproximadamente x g) deben excluirse de la determinación. No se pudo establecer una alteración por medio de bilirrubina hasta 600 mg/l, trigliceridos hasta 3,7 g/l, así como, por el factor reumatoídeo hasta 1200 UI/ml. Medicamentos como 6-azauridina-triacetato, carbamazepina, oxido de nitrógeno, metotrexato y fenitoína, pueden elevar la concentración de homocisteína 5. Las muestras de pacientes pueden contener anticuerpos heterófilos, los cuales pueden conducir a resultados falsos elevados o falsos disminuidos del ensayo inmunológico. Este ensayo está preparado de tal forma que la influencia de los anticuerpos heterófilos se encuentra minimizada. Sin embargo, no se puede garantizar una completa supresión de su efecto. Dade Behring ha comprovado el uso de estos reactivos en diferentes aparatos de análisis, para optimizar el rendimiento del producto y el cumplimiento de sus especificaciones. Las variaciones realizadas por el usuario no son apoyadas por Dade Behring, ya que estas pueden influir sobre el rendimiento del sistema y los resultados del ensayo. Es la responsabilidad del usuario la validación de las modificaciones de estas intrucciones,o del uso de estos reactivos en otros aparatos de análisis diferentes a los dados por Dade Behring en estas etapas de aplicación o en los aparatos nombrados en este boletín informativo. Los resultados de esta prueba deberán interpretarse siempre de acuerdo con la historia clínica del paciente, la sintomatologia clínica y otras observaciones. Debido a los efectos matriz, las muestras para analizar inter-laboratorios y las muestras control pueden producir resultados diferentes, dependiendo del método utilizado para la determinación. Por esta razón, es necesario evaluar estos resultados en relación con valores objetivo específicos del método. Estudios de comparación de sueros/plasmas utilizando el N Látex HCY, dieron para los sueros un 10% de resultados más elevados que los plasmas con EDTA. Por lo tanto, se recomienda con este ensayo no reportar los resultados para un paciente cambiando entre suero y plasma con EDTA. Entre plasma con EDTA o heparina no se encontró ninguna diferencia significante de la concentración de homocisteína. Rango de referencia La concentración de homocisteína en plasmas o sueros de individuos sanos puede variar dependiendo de la edad, sexo, región geográfica, estado nutricional y de factores genéticos. En la literatura se encuentran intervalos de referencia para hombres y mujeres adultos de 5 hasta 15 µmol/l. En un estudio de 800 sujetos visiblemente sanos el 95. Percentil para homocisteína fue de 15,7 µmol/l 6. En una investigación de muestras de plasma con EDTA de 193 adultos sanos procedentes de Europa Central los resultados determinados con el reactivo N Látex HCY se encontraron en un rango entre 4,9-15,0 µmol/l (2,5 hasta 97,5 Percentile). No obstante, cada laboratorio deberá determinar su propio rango de referencia, ya que los resultados pueden variar dependiendo de la colectividad estudiada y del tipo de muestra. Características de la determinación Sensibilidad La sensibilidad analítica de la determinación se fija con el límite inferior de la curva de referencia y depende por lo tanto de la concentración del analito en el N Proteína estándar SL. Un límite de determinación típico para homocisteína es de 2 mmol/l, para medidas hechas a una dilución de 1:5. Especificidad No se conoce ninguna reacción cruzada con los anticuerpos utilizados. Las muestras de plasma a las que se les agregó diferentes concentraciones de adenosina (hasta 1 mm), S-adenosil-L-metionina (hasta 0,5 mm), L-cistationina (hasta 2 mm), L-cisteína (hasta 5 mm) o homocisteína-tiolactona (hasta 0,1mM), mostraron una desviación de los resultados en comparación con los resultados de la muestra sin aditivos de <5,0% y <1,0% para L-cisteína, respectivamente. Precisión Los siguientes coeficientes de variación (CV) fueron obtenidos con N Látex HCY (n = 40) en el sistema BN*: Precisión Valor promedio Intra-assay Inter-assay Total Muestra (µmol/l) CV (%) CV (%) CV (%) N/T Proteína Control SL/L 6,7 4,5 7,3 8,5 N/T Proteína Control SL/M 11,0 3,4 5,6 6,6 N/T Proteína Control SL/H 22,3 4,6 3,7 5,9 EDTA Plasma pool 1 11,8 4,2 6,1 7,4 EDTA Plasma pool 2 32,9 2,7 3,7 4,6 Estos resultados fueron obtenidos por analísis de varianza. Comparación de métodos El N Látex HCY (y) fue comparado con un ensayo inmunoenzimático existente en el comercio (x), mediante la determinación de 73 muestra de plasmas en un rango de concentración de homocisteína de 4,8 hasta 39,4 µmol/l. El análisis de regresión de los resultados dio la siguiente línea: y = 0,97 x 0,06 µmol/l (r= 0,99) Nota: Los valores dados para las características de la determinación representan resultados típicos y no se deben tomar como especificaciones para el N Látex HCY. Literatura Ver texto en inglés. BN ProSpec es una marca de fábrica registrada de Dade Behring Marburg GmbH en USA, Alemania y en otros países. * BN es una marca de fabrica de Dade Behring Marburg GmbH en USA. Fabricado por Axis-Schield para Dade Behring Edición Agosto 2005 N Latex HCY Campo de aplicação Diagnósticos in vitro para determinação quantitativa do total de homocisteína (HCY), no soro humano, plasma heparinizado e plasma EDTA, através da imunonefelometria de partículas reforçadas, com os sistemas BN* II e BN ProSpec.

6 Significado diagnóstico A homocisteína é um aminoácido derivado da metionina, que necessita de ácido fólico e das vitaminas B6 e B12 para o metabolismo ulterior. A homocisteína existe numa forma livre, mas existe, predominantemente, numa forma ligada às proteínas. As mutações das enzimas participantes na metabolização da homocisteína, p. ex., MTHFR (5,10-Metileno-Tetrahidrofolato-Reductase) provocam a hiperhomocisteinemia 1,2. O ácido fólico e as vitaminas B6 e B12 são factores importantes para a decomposição da homocisteína; uma deficiência destas vitaminas provoca níveis elevados de homocisteína 1-3 no plasma. As mutações homozigóticas do gene CBS (Cistationina-β-sintetase) provocam uma hiperhomocisteinemia grave com homocisteinuria. A hiperhomocisteinemia está associada a um risco elevado de doenças cardíacas isquémicas, apoplexia, doenças arteriais periféricas e tromboses venais profundas 1-4, bem como defeitos do tubo neural e pré-eclampsia na gravidez 3. As concentrações elevadas de homocisteína no sangue provocam disfunções endoteliais, indiciando um papel causal nas doenças vasculares 2,3. O aumento da frequência da hiperhomocisteinemia é observado, sobretudo, nas pessoas idosas, nos fumadores, nos pacientes com doenças renais, na diabetes e em caso de alimentação 3 rigorosamente vegetariana. A determinação da homocisteína está indicada no âmbito da avaliação do risco cardiovascular, bem como para a clarificação da trombofilia e para a exclusão da deficiência de ácido fólico, vitaminas B6 ou B12 nos pacientes de risco elevado. Princípio metodológico Ensaio competitivo A homocisteína ligada à mostra é reduzida em homocisteína livre pela acção do Dithiothreitol e é convertida enzimaticamente em S adenosina homocisteína (SAH) na fase seguinte. A S adenosina cisteína (SAC) conjugada, adicionada à mistura básica da reacção, compete com a SAH da amostra em relação à ligação dos anticorpos anti-sah ligados às partículas de poliestireno. Na presença de SAH, a agregação das partículas não se efectua, ou efectua-se, apenas, de forma ténue. Em caso de ausência de SAH na amostra, efectua-se uma agregação das partículas de poliestireno, provocada pela SAC conjugada. Quanto maior for o teor de SAH na mistura básica, mais pequeno é o sinal de luz dispersa. A interpretação é efectuada por comparação com um padrão de concentrações conhecidas. Reagentes Conteúdo da embalagem comercial N Latex HCY, ref. OPAX N HCY Reagente, 3 frascos com 1,7 ml cada N HCY RA, 3 frascos com 2,2 ml cada N HCY SR A, 3 frascos com 0,6 ml cada N HCY SR B, 3 frascos com 1,1 ml cada Composição N HCY Reagente é constituído por uma suspensão de partículas de poliestireno, revestidas de um anticorpo monoclonal anti-sah (rato) (< 0,1 g/l). N HCY RA é constituído por uma solução tamponada estabilizada do agente redutor ditiotreitol (< 0,5 g/l) e adenosina (< 20 mg/l). N HCY SR A é constituído por uma solução tampão estabilizada da enzima hidrolase da S-adenosilo- L-homocisteína (recombinante) (< 100 ku/l). N HCY SR B é constituído por uma solução tampão estabilizada de um conjugado de SAC com tireoglobulina porcina (PTG-SAC) (< 0,1 g/l). Conservante N HCY SR após mistura de N HCY SR A e N HCY SR B: Azida de sódio: < 1 g/l Advertências e medidas de precaução 1. Só para uso diagnóstico in vitro. 2. Precauções a observar ao lidar com reagentes para diagnóstico in vitro com teor de azida de sódio: Evitar ingerir e todo o contacto com a pele ou mucosas. Com metais pesados, como o cobre ou o chumbo, a azida de sódio pode formar azidas explosivas. Preparação do reagente N HCY Reagente e o N HCY RA estão prontos para uso e podem ser utilizados sem tratamento prévio. N HCY SR: o conteúdo total de um frasco de N HCY SR A deverá ser pipetado para um frasco de N HCY SR B e misturado agitando ligeiramente. Estabilidade e condições de conservação Os reagentes deverão ser conservados ao abrigo da luz! Conservação entre +2 e +8 C: A data de expiração está indicada no rótulo; Estabilidade após abertura: duas semanas (reagente N HCY, mistura N HCY RA e N HCY SR), desde que fechados, hermeticamente, imediatamente após o uso e conservados entre +2 a +8 C. Os reagentes não podem ser congelados. Estabilidade nos sistemas BN* II e BN ProSpec : Reagente N HCY, mistura N HCY RA e N HCY SR, três dias, no mínimo, com oito horas por dia, ou período de tempo comparável. Nota: A estabilidade on-board depende do sistema BN* utilizado e das condições laboratoriais. Indicações mais pormenorizadas estão contidas nos manuais de utilização do sistema BN* II e BN ProSpec. Outros materiais necessários Sistema BN* II ou BN ProSpec N Proteína standard SL (humana), ref. OQIM N/T Controlo de proteína SL/L (humana), ref. OQIN N/T Controlo de proteína SL/M (humana), ref. OQIO N/T Controlo de proteína SL/H (humana), ref. OQIP Diluente N, ref. OUMT BN* II Evaporation Stoppers (facultativamente), ref. OVLE Material de consumo e equipamento descritos nos manuais de instrução dos sistemas BN*. Amsotras Para minimizar a síntese HCY nos eritrócitos após a colheita do sangue, as amostras do paciente deverão ser tratadas da seguinte maneira: Depois da colheita, as amostras de sangue deverão ser imediatamente conservadas em gelo e centrifugadas no período de tempo de uma hora após a colheita, para separar o plasma ou o soro das células sanguíneas. Para a medição deverão ser utilizadas amostras de soro humano ou de plasma heparinizado, tão frescas quanto possível, (conservadas 7 dias, no máximo, entre +2 e +8 C) ou amostras de soro humano, plasma heparinizado ou plasma EDTA conservadas congeladas. Se as amostras forem congeladas num período de tempo de 24 horas após a colheita, podem ser conservadas durante 3 meses a uma temperatura inferior a -20 C, se se evitar que as mesmas sejam descongeladas e congeladas repetidamente. As amostras de soro devem estar completamente coaguladas e não apresentar partículas ou vestígios de fibrina após a centrifugação. As amostras lipémicas ou as amostras congeladas que se apresentem turvas após a descongelação, deverão ser clarificadas através de centrifugação (10 min. a aprox x g). A utilização de vários tipos de amostras deverá ser evitada nos controlos de monitorização. Procedimento Notas 1. Os detalhes para a operação dos sistemas BN* deverão ser consultados no respectivo manual de utilização. 2. Os reagentes e as amostras conservadas entre +2 e +8 C podem ser utilizadas directamente no sistema BN* II e BN ProSpec para determinação. Protocolo de ensaio nos sistemas BN* O protocolo de ensaio para o soro e o plasma está contido no manual de utilização e no Softwaredo aparelho respectivo. Todos os passos são executados automaticamente pelo sistema. Preparação da curva de referência As curvas de referência são obtidas através de uma calibração de pontos múltiplos. Para o estabelecimento da curva de referência, são efectuadas automaticamente séries de diluição do N Protein Standard SL com o diluente N. As diluições têm de ser utilizadas dentro de quatro horas. A curva de referência permanece válida durante duas semanas. Pode ser utilizada para além desse período de tempo, desde que os controlos com valores nominais dependentes do processo, tais como, p. ex., o N/T Controlo de proteína SL/L, M e se encontrem, novamente, compreendidos dentro do seu intervalo de confiança. Se se utilizar um novo lote de reagente, é necessário estabelecer uma nova curva de referência. O intervalo de medição exacta depende da concentração da substância analisada de cada lote de N Protein Standard SL. Os intervalos de medição típicos estão indicados no respectivo manual de utilização do sistema BN*. Medição das amostras de pacientes As amostras são diluídas automaticamente na relação de 1:5 com Diluente N. As diluições têm de ser medidas dentro de 4 horas. Para os valores medidos que se situem acima do intervalo de medição, a medição pode ser repetida a partir de uma diluição de amostra superior. As repetições de medição feitas a partir de outras diluições de amostras estão descritas no manual de utilização dos sistemas BN*. Controlo de qualidade interno Os Controlos de Proteína SL/L, M e H deverão ser utilizados após a preparação de uma curva de referência, após a primeira abertura de um frasco de reagente ou em cada série de amostras séricas. Na estimativa e na interpretação do teste, os Controlos são tratados como as amostras de pacientes. O valor teórico e o intervalo de confiança dos controlos deverão ser consultados nas respectivas tabelas de valores teóricos. Se o resultado da medição do controlo se situar fora do intervalo de confiança, a medição do controlo deverá ser repetida. Se o desvio for confirmado através da repetição da medição, deverá ser registada uma nova curva de referência. Os resultados dos pacientes só deverão ser divulgados quando a causa do desvio for identificada e eliminada. Resultados A interpretação é efectuada automaticamente em mmol/l ou numa unidade derivada seleccionada pelo utilizador no sistema BN*. Limitações do procedimento As amostras que contêm partículas têm de ser centrifugadas antes da determinação. As amostras lipémicas que não se conseguem clarificar com a centrifugação (10 minutos a aprox x g) deverão ser excluídas da determinação. Não foi observada nenhuma interferência pela acção da bilirubina até 600 mg/l, triglicéridos até 3,7 g/l ou factores reumatóides até 1200 IU/ml. Os medicamentos como o 6-azauridina-triacetato, a carbamazepina, o óxido nitroso, o metotrexato e a fenitoína podem provocar concentrações elevadas de homocisteína 5. As amostras de pacientes podem conter anticorpos heterófilos que podem provocar resultados elevados ou baixos falsos nos ensaios imunológicos. Este teste foi concebido de modo a que a influência dos anticorpos heterófilos seja mínima. Todavia, não se pode garantir a supressão completa dos seus efeitos. A Dade Behring controlou a utilização destes reagentes em vários analisadores, em termos de performance e manutenção das especificações do produto. As alterações efectuadas pelo utilizador não são promovidas pela Dade Behring, uma vez que podem afectar a performance do sistema e os resultados do teste. As alterações destas instruções ou a utilização destes reagentes noutros analisadores que não os validados nas instruções de aplicação da Dade Behring ou nestas instruções de utilização são da responsabilidade do utilizador. Os resultados deste teste deverão ser sempre interpretados em conexão com o historial antecedente do paciente, o quadro clínico e os outros resultados de análise. Devido aos efeitos matriciais, as amostras de controlo ou amostras de investigação interlaboratorial podem apresentar resultados diversos, em função dos métodos de determinação utilizados. Por isso, poderá ser necessário proceder à avaliação destes resultados com base em valores alvo específicos do método. Estudos comparativos de soro/plasma utilizando N Latex HCY, revelaram resultados para o soro superiores em mais de 10% do que para o plasma EDTA. Por isso, não é aconselhável recolher resultados para o mesmo paciente alternando entre o soro e o plasma EDTA. Não foi observada qualquer diferença significativa da concentração de homocisteína entre o plasma EDTA e o plasma heparinizado. Intervalo de referência As concentrações de homocisteína no plasma ou soro de indivíduos saudáveis podem variar em função da idade, sexo, área geográfica, status nutricional e factores genéticos. Na literatura científica são reportados resultados de 5 a 15 µmol/l para os homens e as mulheres adultas. Num estudo com 800 indivíduos testados aparentemente saudáveis, o 95. percentil foi de 15,7 µmol/l homocisteína 6. Num estudo de amostras de plasma EDTA de 193 indivíduos adultos saudáveis da Europa Central, os resultados obtidos com o reagente N Latex HCY situaram-se no intervalo de 4,9-15,0 µmol/l (2,5. a 97,5. percentis). Para além disso, cada laboratório deverá determinar os seus intervalos de referência próprios, uma vez que os resultados podem variar em função do colectivo analisado e do tipo de amostra. Características do teste Sensibilidade A sensibilidade analítica da determinação é definida pelo limite inferior da curva de referência e depende, assim, da concentração da substância a analisar no N Standard de Proteína SL. O limite de detecção típico para a Homocisteína é 2 µmol/l para uma medição a partir de uma diluição de amostra de 1:5. Especificidade Não se conhecem reacções cruzadas do anticorpo utilizado. As amostras de plasma às quais foram adicionadas várias concentrações de adenosina (até 1 mm), S-adenosil-L-metionina (até 0,5 mm), L-cistationina (até 2 mm), L- cisteína (até 5 mm), L- metionina (até 0,4 mm) ou homocisteína - tiolactona (até 0,1 mm), apresentaram um desvio dos resultados em comparação com os respectivos resultados das amostras sem aditivos < 5% ou <1 % para a L - cisteína. Precisão Os seguintes coeficientes de variação (CV) obtiveram-se com N Latex HCY (n = 40) num sistema BN*: Precisão Valor médio Intra-ensaio Inter-ensaio Total Amostra (µmol/l) CV (%) CV (%) CV (%) N/T Controlo de proteína SL/L 6,7 4,5 7,3 8,5 N/T Controlo de proteína SL/M 11,0 3,4 5,6 6,6 N/T Controlo de proteína SL/H 22,3 4,6 3,7 5,9 Pool de plasma EDTA 1 11,8 4,2 6,1 7,4 Pool de plasma EDTA 2 32,9 2,7 3,7 4,6 Os resultados foram obtidos pela análise da variância. Comparação de métodos N Latex HCY (y) foi comparado com um ensaio imunoenzimático (x) obtido no mercado, determinando 73 amostras de plasma no intervalo de 4,8 a 39,4 µmol/l de homocisteína. A análise de regressão dos resultados forneceu a seguinte equação: y = 0,97 x + 0,06 µmol/l (r = 0,99). Nota: Os valores de performance da determinação indicados representam resultados típicos e não deverão ser considerados como especificação para o N Latex HCY. Bibliografia V. Folheto Informativo em inglês. BN ProSpec é uma marca registada da Dade Behring Marburg GmbH nos EUA, Alemanha e noutros países. * BN é uma marca registada da Dade Behring Marburg GmbH in den USA. Produzido por Axis-Shield para Dade Behring Edición Agosto 2005 OPAX G03 C0541 H/CS 6