Introducción.1 1. Relación de la planta con su entorno Identificación de Pathogen and Circadian Controlled

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1 Índice de contenidos Introducción.1 1. Relación de la planta con su entorno Identificación de Pathogen and Circadian Controlled La transición floral en Arabidopsis thaliana Ruta del fotoperiodo Percepción y transmisión del fotoperiodo en Arabidopsis Función de CONSTANS-FLOWERING LOCUS T en la regulación de la transición floral por la ruta del fotoperiodo Activación de FT por CO Función de FT en la activación de la transición floral Otras rutas para la activación de la transición floral en Arabidopsis Interacción planta-patógeno Respuesta de las plantas frente a patógenos Señalización por SA en la defensa frente a patógenos Señalización lipídica en la respuesta frente a patógenos Tipos y función de los lípidos en plantas Ácidos grasos y compuestos derivados Fosfolípidos Señalización por el ácido jasmónico El signalosoma COP9 en Arabidopsis thaliana Estructura del signalosoma COP9 (CSN) Función de CSN en la regulación de la degradación de proteínas Función de CSN en la regulación transcripcional Función fisiológica de CSN en Arabidopsis Función de CSN en el desarrollo de Arabidopsis CSN y fotomorfogénesis Otras alteraciones del desarrollo en plantas csn Función relacionada con la respuesta a estrés biótico Antecedentes... 33

2 Resultados Análisis in silico de la proteína PCC1 y sus homólogos en Arabidopsis Características generales de PCC Análisis de secuencia de genes homólogos a PCC1 en Arabidopsis Patrón de expresión de PCC Localización celular de PCC Localización celular de PCC1 fusionada a GFP en plantas de Nicotiana transformadas transitoriamente y en plantas transgénicas de Arabidopsis La aplicación de SA altera la localización de PCC1 de Arabidopsis Homodimerización de PCC El dominio CYSTM de PCC1 es el responsable de la homodimerización y del anclaje a la membrana plasmática Función de PCC1 en la transición floral en Arabidopsis CONSTANS no es un activador transcripcional de PCC PCC1 no interacciona con CONSTANS PCC1 no es necesario para la activación de FT por CO La expresión de PCC1 no depende de CO Implicación de PCC1 en la transición floral dependiente de vernalización y de giberelinas El fenotipo de floración tardía en plantas ipcc1 podría estar relacionado con alteraciones en la señalización por luz Interacción de PCC1 con otras proteínas de Arabidopsis Escrutinio de potenciales interactores de PCC1 mediante doble híbrido en levadura Localización subcelular de CSN5B Confirmación de las interacciones PCC1 con CSN5A y CSN5B in planta Detección de formas rubiladas de CUL1 en líneas ipcc Análisis transcriptómico de líneas ipcc Categorías funcionales sobrerepresentadas en el análisis transcriptómico Comprobación por RT-qPCR de los datos del análisis transcriptómico Hipersensibilidad al ABA de las líneas ipcc

3 6.4. Alteración de la composición lipídica en líneas ipcc Fenotipos de defensa de líneas ipcc1 frente a distintos tipos de patógenos Discusión Conclusiones.122 Materiales y métodos Material biológico y condiciones de cultivo Material vegetal y condiciones de cultivo Material vegetal Condiciones de cultivo Material microbiológico: cepas utilizadas y condiciones de cultivo Escherichia coli Agrobacterium tumefaciens Saccharomyces cerevisiae Pseudomonas psyringae Botrytis cinerea Phytophtora brassicae Tratamientos aplicados a las plantas Aplicación de dexametasona Tratamientos con hormonas Infección con microorganismos patógenos Infección con Pseudomonas syringae Infección con Botrytis cinerea Infección con Phytophtora brassicae Tratamiento de vernalización Manipulación del material biológico Generación de electro-competencia en células de E. coli y transformación genética Generación de termo-competencia en células de A. tumefaciens y transformación genética Generación de termo-competencia en células de S. cerivisiae y transformación genética

4 3.4. Transformación estable de plantas de Arabidopsis thaliana Transformación transitoria en plantas de Nicotiana benthamiana Aislamiento y manipulación de ácidos nucleicos Extracción y purificación de ácidos nucleicos Extracción de ADN genómico de Arabidopsis Extracción de ARN de Arabidopsis Extracción de ARN para el análisis transcriptómico Extracción de ADN de bacteria Manipulación de ácidos nucleicos Amplificación de fragmentos específicos de ADN por PCR Purificación de bandas de AND Retrotranscripción (RT) de ARN Cuantificación de transcritos por RT-qPCR Digestión de ADN con enzimas de restricción Reacciones de fosforilación y defosforilación de fragmentos de ADN y vectores Ligación de fragmentos de PCR y plásmidos Ligaciones convencionales Ligaciones mediante el uso de tecnología Gateway Obtención de plásmidos recombinantes Generación de fusiones ppcc1::gus Generación de fusiones traduccionales de proteínas con distintas etiquetas para su análisis en plantas Generación de fusiones traduccionales de proteínas con distintas etiquetas para su análisis en levaduras Analisis cuantitativo de ácidos grasos y lípidos polares Obtención de plantas transgénicas ipcc1 oxco-gr (co-2) Ensayos de doble hibrido en levadura Comprobación directa de interacciones por doble híbrido en levadura Escrutinio por doble híbrido en levadura para la búsqueda de proteínas interactoras

5 9. Manipulación de proteínas Análisis Western Inmunoprecipitación de proteínas con anticuerpos específicos Análisis fenotípicos Medida de la longitud de hipocotilos Ensayos de germinación y establecimiento de plántula Crecimiento de raíces Medida del cierre estomático Estimación de la pérdida de agua Tiempo de floración Obtención de protoplastos a partir de hojas de Nicotiana benthamiana Tinciones histoquímicas Tinción de actividad b-glucuronidasa (GUS) Tinción con yoduro de propidio Tinción con FM TM 4-64FX Técnicas microscópicas Toma de imágenes de plantas ppcc1 1100::GUS Microscopía confocal Aplicaciones bioinformáticas y bases de datos Herramientas básicas para el manejo de secuencias Predicción de modificaciones secundarias de proteínas Predicción de localización subcelular Bases de datos consultadas Herramientas utilizadas para el análisis de datos transcriptómicos Bibliografía...163