Muerte Celular Programada Cascadas de Señales

Transcripción

1 Muerte Celular Programada Cascadas de Señales Dra. Mónica Kotler Departamento de Química Biológica FCEN UBA. IQUIBICEN-CONICET 2016

2 Tipos de Muerte Celular Insultos físicos, químicos y mecánicos Instancias fisiológicas de la MCR No puede prevenirse ni modularse No constituye un target para intervenciones terapéuticas

3 Muerte Celular Programada La muerte no es accidental el acto organizado, que es el suicidio celular, es seguido por un proceso de reparación. OTRA MIRADA: LA MUERTE PUEDE NO SER UN EVENTO ANORMAL

4 Muerte Celular Programada La muerte celular desempeña un rol relevante en los procesos fisiológicos de los organismos multicelulares, particularmente durante la embriogénesis y la metamorfosis (Lockshin y Williams, 1965) Desarrollo de los músculos larvales de las mariposas Observó la activación de los lisosomas antes de la muerte

5 Muerte Celular Programada Lockshin y Williams dicen que la muerte de las células musculares sigue un PLAN BIOLOGICO y describen al plan como un PROGRAMA y al proceso como MUERTE CELULAR PROGRAMADA Muerte Celular Programada: la muerte celular durante el desarrollo no era de naturaleza accidental sino que seguía una secuencia de pasos controlados que conducían a una autodestrucción definida local y temporalmente.

6 APOPTOSIS APO: separar PTOSIS: caer La muerte es una parte integral y necesaria del ciclo de vida de los organismos Kerr, Wyllie y Currie (1972): distingue células que mueren de una manera ordenada de aquellas que lo hacen en forma accidental o catastrófica (necrosis) Describe una serie de eventos morfológicos que sufren las células como consecuencia de una amplia variedad de estímulos

7 Eventos bioquímicos de la apoptosis 1) Degradación internucleosomal del DNA Ladder de DNA 2) Participación de una endonucleasa dependiente de Ca 2+ /Mg 2+ 3) Síntesis de novo de proteínas Nature (1980) 284,

8 La apoptosis es un proceso de muerte celular activo y definido que juega un rol importante en el desarrollo de organismos multicelulares y en la homeostasis de los tejidos bajo condiciones fisiológicas y patológicas Apoptosis: contraparte natural de las supervivencia celular

9 Tipos de Muerte Celular Fisiológica Proceso altruista de células individuales a favor del organismo como un todo

10 Apoptosis Fisiológica Metamorfosis de insectos y anfibios: la apoptosis es necesaria para la transformación de tejidos larvales en tejidos adultos En el sistema nervioso: las neuronas que fracasan en establecer las conexiones adecuadas mueren por apoptosis Remodelamiento del hueso y el cartílago Epitelio del intestino y epidemis: la apoptosis minimiza el riesgo de las células expuestas a agentes mutagénicos o radiaciones En el aparato reproductor: hay pérdida de células epiteliales en las fases del ciclo menstrual

11 Apoptosis en condiciones patológicas Enfermedad de Alzheimer Enfermedad de Parkinson Esclerosis lateral amiotrófica SIDA: apoptosis excesiva de células T Linfocito VIH Enfermedades linfoproliferativas: apoptosis insuficiente Muerte Cáncer: apoptosis insuficiente

12 Clasificación de la MCP (rol de los lisosomas) (rol de los lisosomas) Apoptosis: los restos celulares son destruídos en los lisosomas de otros tipos celulares (preservación general de las organelas hasta cierto punto, ruptura del citoesqueleto) Autofagia: intervienen los lisosomas de la propia célula moribunda (aparato de Golgi ensanchado, preservación del citoesqueleto, condensación de la cromatina menos marcada que en la apoptosis) Degradación no lisosómica: los lisosomas no intervienen. Muerte celular semejante a la necrosis (dilatación de las organelas, desintegración de la célula en fragmentos)

13 Características Necrosis Apoptosis Respuesta Patológica: Alto stress Fisiológica: genéticamente regulada, mediano stress Balance Osmótico Importante Desequilibrio: Entran iones (Ca 2+ ). Se inhibe la síntesis de ATP. Se activan proteasas y fosfolipasas. La célula se hincha y se desintegra. Respuesta inflamatoria. Menor desequilibrio: la célula se encoge, blebbing de la membrana, cuerpos apoptóticos, fagocitosis, ausencia de respuesta inflamatoria Ocurre en Grupos de células Células aisladas Organelas Citoplasmáticas Se hinchan tempranamente Condensación nuclear y citoplasmática (picnosis) Núcleo Desaparición (Cariolisis) Repliegue y ruptura (cariorrexis) Fragmentación Cromatina Nuclear Condensación no definida Condensación perinuclear Ruptura del DNA Random Internucleosomal Expresión Génica de novo No Si (con excepciones)

14 Fagocitosis sin respuesta inmune

15 Como los fagocitos descubren a las células apoptóticas? UN FUNERAL RÁPIDO. Sustancias quimioatractantes de los fagocitos LPC:lisofatidil colina S1P: sfingosina 1 fosfato Eflujo de ATP/UTP EMAPII: polipéptido 2 activador de monocitos endoteliales

16 Remoción de células apoptóticas Molecular Cell. (2004) 14:,

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18 Diferencias Estructurales entre Apoptosis y Necrosis N: normal cell A. Apoptosis 1: necrosis

19 Blebbing de la membrana plasmática

20 HeLa cells Carcinoma de cuello uterino (humano)

21 DNA Ladder

22 Detección de células apoptóticas

23 Morfología apoptótica

24 Células Tipo I y Células Tipo II Vías apoptóticas de muerte

25 Vía apoptótica lisosomal

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27 QUE PASA LUEGO DE LA PERMEABILIZACIÓN MITOCONDRIAL?

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29 CASPASAS

30 Caspase: Cysteine-Dependent Aspartate Specific Protease

31 Caspasas Especificidad dominante para sustratos conteniendo Asp (específico de caspasas) Excepción: Granzima B, serina proteasa activadora de caspasas Cisteína en el sitio activo Actividad proteolítica intrínseca (iniciadoras) Contienen un pentapéptido conservado: QACXG conteniendo la cisteína del sitio activo (común en cisteína proteasas)

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33 Sobreexpresión de CED-3 induce apoptosis

34 Estructura primaria de las caspasas

35 Mecanismo de activación de las caspasas

36 Mecanismos de activación de caspasas Homoactivación: eere del reclutamiento de zimógenos a proteínas adaptadoras caspasas iniciadoras 8 y 10: DISC, mediado por R de muerte caspasa iniciadora 9: Apoptosoma, compuesto por Apaf1, citocromo c, datp/atp y caspasa 9 Heteroactivación: ocurre por acción de otras proteínas (otras caspasas sobre los zimógenos caspasas

37 Sustratos de las Caspasas Elementos del citoesqueleto: actina, fodrina, laminas nucleares y catenina Enzimas encargadas de reparar (PARP) o degradar el DNA (DNAasa) Factores de transcripción: Rb, MDM2 Proteínas quinasa y fosfatasas: PKC, Akt, Pak Proteínas de la familia Bcl-2 (Bid) CAD-ICAD

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39 Cambios morfológicos dependientes de la actividad de caspasas Clivaje de laminas: disminución del tamaño del núcleo Clivaje de proteínas del citoesqueleto: reorganización citosólica Clivaje de PAK (P21-activated kinase 2): burbujeo de la MP Clivaje de ICAD: cambios en la cromatina

40 QUIENES COORDINAN LA DEMOLICION DE ESTRUCTURAS Y ORGANELAS CLAVE PARA LA CELULA??? Oh! my God! CASPASAS

41 Niveles de regulación de caspasas Nivel 1: conversión de los zimógenos a la forma activa Nivel 2: inhibidores de la actividad de caspasas

42 Niveles de regulación de caspasas Unión específica de inhibidores naturales: FLIP (Flice like inhibitory protein) IAPs (Inhibitors of apoptotic proteins) p35, CrmA A diferencia de la familia Bcl-2, IAPs, p35 y CrmA bloquean tanto la vía mitocondrial como la del R por unión a caspasas iniciadoras y efectoras

43 Regulación de las vías apoptóticas Bcl-2 Family

44 Regulación de MOMP por miembros de la familia Bcl-2 Bax y/o Bak constitutivamente activos

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46 PTP: Poro de Permeabilidad Transitoria

47 Formación del Apoptosoma y Activación de la Caspasa 9 Formación del apoptosoma y activación de caspasas Ledgerwood E C, Morison I M Clin Cancer Res (2009;15:

48 Receptores de Muerte

49 Receptores de Muerte: Transducción de señales Superfamilia de Receptores TNF- alfa

50 Los receptores de muerte mejor caracterizados son: CD-95/Fas/Apo1: señal generalmente apoptótica (independiente de la síntesis de novo de proteínas) TNFR1/p55/CD120a: apoptosis, proliferación diferenciación DR3/Apo3/WSL-1/TRAMP/LARD: estructural y funcionalmente similar a TNF-R1; abundantemente expresado en linfocitos T DR4/Apo2/TRAIL-R1, DR5/Apo2/TRAIL-R2: Función semejante a FasR. Involucrados en apoptosis de células tumorales

51 Receptores y Ligandos de Muerte RECEPTOR CD-95 TNFR1 DR3 DR4 DR5 LIGANDO CD95L TNF y linfotoxina α Apo3L/TWEAK Apo2L/TRAIL APO2L/TRAIL

52 Receptores de Muerte DISC Modelo de Proximidad Inducida

53 Desde la unión del ligando a la activación de caspasas

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55 HASTA AQUÍ HEMOS HABLADO DE APOPTOSIS, VÍA MITOCONDRIAL, VÍA DE RECEPTORES DE MUERTE Y CASPASAS

56 Apoptosis intrínseca independiente de caspasas

57 MITOCONDRIA Controlador Maestro de la MCP CASPASAS Decisión del tipo de muerte celular

58 Diferentes líneas celulares de fibroblastos mueren de distinta forma frente al mismo tratamiento: TNF 500U/ml. El concepto de necroptosis F17 L-M NORMALES TRATADAS TRATADAS Estructura posterior al blebbing Laster et al., J Immunol,

59 Señales de necrosis regulada emergen del receptor TNFR1 Necroptosis como muerte celular necrótica regulada Necrostatin 1 Inhibidor de RIP1 La administración de TNF puede resultar en supervivencia, apoptosis o necroptosis dependiendo del tipo celular, factores del microambiente y el estímulo

60 4 modelos de muerte: desde la apoptosis hasta la necrosis Four deaths and a funeral: Leist and Jaattela, Nat. Rev. Cell Biol. (2001) 2, Apoptosis Apoptosis-like PCD Necrosis-like PCD Necrosis

61 Apoptosis-like PCD Condensación de la cromatina menos compacta y completa, con forma abultada. Moléculas de reconocimiento para fagocitosis Mayormente independiente de caspasas (catepsinas, calpaínas, AIF, ENDO-G) Necrosis-like PCD Ausencia de condensación de la cromatina o condensación punteada Puede ocurrir externalización de PS Independiente de caspasas Subgrupo: Aborted Apoptosis: apoptosis interrumpida por inhibición de caspasas, finalizando por una vía independiente de caspasas

62 Apoptosis vs. Apoptosis Independiente de Caspasas (e-f) f, i: cromatina en forma de grumos

63 CONCEPTO!!!! La inhibición de caspasas no necesariamente inhibe la muerte celular Apoptosis-like PCD Autofagia Necrosis- like PCD Necrosis

64 AHORA... UN POCO MAS DE PACIENCIA PLEASE!!!!!

65 Ahora la cosa no es tan lineal.. Apoptosis Necrosis Oncosis Necroptosis Autofagia Anoikis Autoschizis Catástrofe Mitótica Paraptosis Excitotoxicidad Senescencia Cornificación Y ahora quién podrá salvarme??????????????????

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67 NOMENCLATURE COMMITTEE ON CELL DEATH ( , 2013,2015) RECOMENDACIONES Cell and Death Differentiation

68 Clasificación de la Muerte Celular Apariencia Morfológica: apoptosis, necrosis, autofagia Criterio Enzimológico: con o sin participación de nucleasas o proteasas (caspasas, calpaínas, catepsinas) Aspectos Funcionales: programada o accidental, fisiológica o patológica Características Inmunológicas: inmunogénica o no-inmunogénica

69 Recomendaciones de los Muertólogos % necrosis, apoptosis, supervivencia, etc. deben reemplazarse % de células con fragmentación del DNA % de células con cromatina condensada % de células con bajo Δφm % de células TUNEL positivas % de células autofágicas debe reemplazarse % de células vacuoladas % células marcadas con GFP-LC3

70 Alteraciones que tienen lugar durante la necrosis Mitocondria: desacople, generación de ROS y RNS, permeabilización de la membrana Lisosomas: generación de ROS, permeabilización de la membrana Núcleo: hiperactivación de PARP-1 Degradación lipídica: activación de fosfolipasas, lipooxigenasas y esfingomielinasas Incremento de calcio citosólico: activación de calpaínas y catepsinas

71 Necrosis: No existe consenso en cuanto a cambios bioquímicos. A veces se identifica por ausencia de apoptosis y autofagia cuando la permeabilización de la membrana plasmática es temprana. Oncosis: ganancia de volumen celular característica de la necrosis. Necroptosis: necrosis regulada opuesta a la accidental (puede ser evitada inhibiendo la quinasa RIP 1) Autoschizis: ocurre en células tumorales tratadas con vitaminas C y K3. Corte de piezas citoplasmáticas, el núcleo disminuye su tamaño, las organelas rodean al núcleo intacto en un estrecho borde de citoplasma, no hay depleción de ATP, aumenta el calcio intracelular, degradación de ADN independiente de caspasa 3, se libera citocromo c.

72 Autoschizis

73 Autoschizis

74 Cornificación=Queratinización: PCD que ocurre en la epidermis, morfológica y bioquímicamente diferente de la apoptosis. Conduce a la formación de corneocitos (queratinocitos muertos) conteniendo proteínas y lípidos necesarios para la capa de piel cornificada (resistencia mecánica, elasticidad, repelencia al agua, estabilidad estructural). Es un programa de diferenciación terminal. Interviene la caspasa 14. Catástrofre Mitótica: muerte celular que ocurre durante un mitosis desregulada. Morfología: micronúcleos, multinucleación (morfología apoptótica o necrótica). Recomendaciones del NCCD muerte celular precedida por multinucleación muerte celular que ocurre durante la metafase

75 Catástrofe Mitótica con eventos de apoptosis Castedo et al., Oncogene (2004) 23,

76 Anoikis: apoptosis inducida por pérdida de adhesión celular al sustrato o a otras células. El término se seguirá empleando por razones históricas pero Resta investigar ni no existe necrosis o muerte independiente de caspasas debida a este mecanismo. Excitotoxicidad: ocurre en neuronas desafiadas con aminoácidos excitatorios (glutamato). Apertura de canales permeables a calcio (NMDA). Puede solapar con necrosis o apoptosis e involucra MMP. No se considera otro tipo de muerte. Paraptosis: PCD morfológica y bioquímicamente diferente a la apoptosis. Disparada por IGFR1 Vacuolización del citoplasma, swelling mitocondrial. En general no puede prevenirse con inhibidores de caspasas o proteínas antiapoptóticas Bcl-2. Involucra a MAPKs.

77 Muchas gracias!!!!