Clonación y transgénesis animal

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1 Agrobiotecnología Curso 2011 Clonación y transgénesis animal Lino Barañao Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires

2 Sumario Clonación Clonación en distintas especies Animales transgénicos Recombinación homóloga Aplicaciones Agrobiotecnología Animales transgénicos Referencias

3 Clonación Agrobiotecnología Animales transgénicos

4 La clonación consiste en la producción de individuos genéticamente idénticos En los animales, la clonación se basa en el uso de la técnica de transplante nuclear. Mediante esta técnica, una célula donante. del individuo a clonar se transfiere a un. ovocito previamente enucleado. célula donante ovocito embrión sintético Agrobiotecnología Enucleación Electrofusión Animales transgénicos TRANSPLANTE NUCLEAR

5 Células embrionarias (totipotenciales) Nuevo individuo X Células diferenciadas La La diferenciación es es un un proceso irreversible asociado a la la pérdida de de totipotencialidad. Sólamente las las células embrionarias tienen la la potencialidad de de generar un un organismo completo. De De ahí ahíel el estatus único del del embrión.

6 Dolly Dolly fue fue clonada a partir partir de de una una célula célulade de glándula mamaria, demostrando que que aún aún las las células somáticas diferenciadas pueden ser ser totipotenciales.

7 La diferenciación celular sería la consecuencia de la unión reversible de factores de transcripción tejidoespecíficos que regulan la expresión de un grupo particular de genes. Embrión Célula somática Corolario: La La potencialidad para para dar darun un nuevo nuevo individuo no no es es privativa del del núcleo núcleo de de las las células embrionarias

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9 Reprogramación: Los factores de transcripción originalmente presentes en la célula donante se diluyen y son reemplazados por aquellos presentes en el oocito

10 Cuáles son las aplicaciones de la clonación animal?

11 Clonación reproductiva de bovinos Para la clonación de bovinos suele partirse de células fetales como donantes del material genético. Los ovocitos pueden provenir de animales sacrificados para consumo ya que sólo aportan el ADN mitocondrial. El embrión obtenido en cultivo debe ser luego transferido a una hembra receptora para completar su desarrollo.

12 Células donantes Células adultas - La vida media es de 20 divisiones celulares. - La tasa de divisiones de 0,8 divisiones por día. - Son muy sensibles a la inhibición por contacto. - Se desarrollan en menor proporción. Células fetales - La vida media es de 35 divisiones celulares. Ello permite su manipulación genética. - La tasa de divisiones de 1,3 divisiones por día. - Son muy sensibles a la inhibición por contacto. - Se desarrollan en mayor proporción. cortar el tejido explanto

13 Ovocito recipiente 24 hs Expansión de las células del cúmulus OVOCITOS INMADUROS OVOCITOS MADUROS Primer cuerpo polar Los ovocitos obtenidos de ovarios de animales sacrificados para consumo deben ser madurados in vitro. Agrobiotecnología Animales transgénicos La maduración consiste en el avance de la división meiótica hasta la metafase II. En este estadío se observa la extrusión del primer cuerpo polar.

14 Transplante nuclear Para implementar la técnica de transplante nuclear se requiere disponer de micromanipuladores y de un microscopio con accesorios para visualizar fluorescencia. Agrobiotecnología Animales transgénicos Gentileza de Biosidus S.A.

15 Transplante nuclear Gentileza de Biosidus S.A. Ovocito en MII Enucleación Célula donante Transplante nuclear

16 Fusión celular Gentileza de Biosidus S.A.

17 Activación Post-fusión Post-activación Desarrollo embrionario y preñez

18 Aplicaciones de la clonación La clonación reproductiva tiene distintas aplicaciones en biotecnología animal. - Clonado con fines agropecuarios - Clonado de animales de zoológicos y mascotas - Clonado para introducir modificaciones genéticas Agrobiotecnología La clonación terapéutica se aplica en medicina humana. Animales transgénicos

19 Clonación en distintas especies Agrobiotecnología Animales transgénicos

20 Clonación en ovinos El primer mamífero clonado a partir de una célula somática fue una oveja, la ahora mundialmente conocida Dolly. Tomado de:

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24 Clonación de bovinos Uno de los primeros bovinos clonados fue Second chance Agrobiotecnología Animales transgénicos Tomado de: Hill et al., Biol. Reprod., 2000.

25 Clonación en la Argentina (De cómo una sucesión de fracasos puede conducir al éxito)

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29 Clonación de bovinos Pampa fue la primera ternera nacida por clonación a partir de fibroblastos fetales en Argentina Agrobiotecnología Animales transgénicos Gentileza de Biosidus S.A.

30 Cerdos clonados obtenidos por transferencia nuclear de células somáticas de un animal adulto El clonado de cerdos requirió modificar la técnica habitual de transplante nuclear. Tomado de: Poleiaeva et al., Nature, 2000.

31 Clonación de mascotas A pesar de que su dueño invirtió más de 3 millones de dólares en ello, Missy murió en 2002 sin haber sido clonada. Agrobiotecnología Animales transgénicos

32 Clonación de mascotas Clon de Little Gizmo Clon de Rainbow Agrobiotecnología Animales transgénicos

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35 Clonación de primates Neti y Ditto Agrobiotecnología Animales transgénicos Tomado de: Meng et al., Biol. Reprod.,1997.

36 Clonación de humanos? La clonación reproductiva carece de justificación médica. Su aplicación masiva es totalmente improbable en las condiciones actuales Agrobiotecnología Animales transgénicos

37 Clonación terapéutica La denominada clonación terapéutica permite generar tejidos de reemplazo a partir de células del paciente. Autotransplante Tejido normal (ej. fibroblastos) Transplante nuclear Factores de crecimiento Matriz extracelular Ovocito (donado) Embrión (?) sintético Células embrionarias (pluri o totipotenciales) Células precursoras del tejido dañado

38 Animales transgénicos Agrobiotecnología Animales transgénicos

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40 Animales transgénicos Un animal transgénico es aquel que tiene una porción de ADN foráneo en su genoma. - Los primeros animales transgénicos producidos fueron. ratones, obtenidos mediante microinyección de cigotas Macho fértil X Hembra superovulada Colecta de embriones Inyección con ADN foráneo Promotor Implantación de los embriones en hembras seudopreñadas Agrobiotecnología Crías Animales transgénicos Extracción del ADN y detección de la presencia del transgen

41 Elementos requeridos en una construcción genética ADN genómico ARN mensajero Promotor original del gen a expresar exones intrones ADN copia Agrobiotecnología Gen recombinante Animales transgénicos Promotor regulable o tejido específico intrón

42 La técnica de microinyección de cigotas resulta muy poco eficiente en bovinos Microinyección de cigotas bovinos Agrobiotecnología Animales transgénicos Eficiencia en la la producción de animales Transgénicos por microinyección Cigotas microinyectadas Sobreviven la microinyección Embriones transferidos a receptoras 250 Preñeces 50 Terneros transgénicos 1

43 Clonación y transgénesis La introducción de genes por transfección y posterior selección de células totipotenciales permite producir animales transgénicos con muy alta eficiencia. Agrobiotecnología Animales transgénicos Gentileza de Biosidus S.A.

44 hgh g / day Day of milking after lactogenesis

45 Res non verba 25 profesionales, 2 empresas, 3 instituciones High level expression of bioactive recombinant human growth hormone in the milk of a cloned transgenic cow (J. Biotechnology, 2006) Daniel Salamone1,2, Lino Barañao3 Claudio Santos,1Jorge Artuso1, Carlos Werning1, Leonardo Bussmann6 Aida Prync1Cesar Carbonetto1,, Susana Dabsys1,, Carlos Munar5 Guillermo Berra4, Ignacio Berra, Roberto Salaberry1, Nahuel Fernández1, Mariana Papouchado, Marcelo Foti1, Norberto Judewicz1, Ignacio Mujica5,, Luciana Muñoz, Silvana Mannocci 1, Silvina Fenández Alvarez1, Eliseo González, Juan Zimmermann, Marcelo Criscuolo1, Carlos Melo1. 1. Biosidus S.A. 2. Facultad de Agronomía, Universidad de Buenos Aires 3. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires 4. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria 5. Munar y Asociados 6. Instituto de Biología y Medicina Experimental-CONICET

46 PAMPA August 6, 2002 PAMPA MANSA September 24, 2002 PAMPA MANSA II & III January 5, 2004 PAMPERO December 7, 2004

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48 Recombinación homóloga Agrobiotecnología Animales transgénicos

49 Recombinación homóloga promotor gen endógeno exones contrucción conteniendo un gen de resistencia a antibiótico flanqueado por secuencias homólogas al exón a eliminar secuencias homólogas Neo intrones gen de resistencia a antibiotico Neo recombinación Neo el alelo en el que se ha producido la recombinación homologa no produce proteína activa

50 Recombinación homóloga La recombinación homóloga elimina un alelo por vez. Los animales resultantes son heterocigotas. recombinación homóloga linea celular de partida Neo se ha eliminado uno de los alelos del gen transferencia nuclear el animal resultante posee todavía una copia activa del gen

51 Recombinación homóloga Para obtener homocigotas (que no expresen la proteína) es necesario el cruzamiento de machos y hembras genéticamente modificados. Neo X Neo Neo Neo Neo Neo Homocigota

52 Recombinación homóloga Cupido y Diana, primeros corderos producidos por la técnica de gene targeting Agrobiotecnología Tomado de: McCreath et al., Nature, Animales transgénicos

53 Estrategias alternativas para la supresión de una proteína Proteína a suprimir Traducción Silenciamiento por RNAi X ARNm Agrobiotecnología Animales Recombinación homóloga X Transcripción ADN transgénicos

54 Silenciamiento génico La introducción de secuencias cortas (22pb) de ARNs homólogos de doble cadena desencadena un proceso que degrada al ARNm blanco y conduce a la supresión de la proteína respectiva Degradación del ARNm ARN doble cadena Agrobiotecnología Transcripción Animales transgénicos ADN

55 Características de los métodos usados para suprimir proteínas Recombinación homóloga - Afecta al ADN (suprime el gen) - Requiere dos generaciones para obtener el fenotipo deseado - La supresión es total - Proteínas candidatas: PrP, lactoglobulina Silenciamiento por ARNi - Afecta al ARN (suprime al mensajero) - El fenotipo deseado se obtiene en la primera generación - Pueden obtenerse niveles intermedios - Proteínas candidatas: lactoglobulina, proteínas de la leche, miostatina

56 Aplicaciones Agrobiotecnología Animales transgénicos

57 Aplicaciones Producción de alimentos: - Incremento en en la la velocidad de de crecimiento y/o y/o masa muscular en en cerdos y peces - Introducción de de genes de de resistencia a enfermedades Producción de órganos para xenotransplante: - Producción proteínas humanas que que bloquean la la acción del del complemento en en cerdos (ejemplo, CD59) - Transplantes temporaríos de de corazón o hígado hasta la la obtener donantes compatibles Fines ornamentales: - Peces que que expresan proteinas fluorescentes Producción de fármacos ( molecular pharming ) - Producción de de proteínas recombinantes humanas en en leche y suero Modelos animales para patologías humanas - Efectos de de sobreexpresión de de genes - Eliminación de de genes ( knock out ) out )

58 Transgénesis en bovinos. Producción de alimentos Agrobiotecnología Cambios cualitativos en la producción de leche: - Producción de lactoferrina en leche bovina - Producción de leches humanizadas - Modificación de las caseínas para la producción de. quesos especiales Cambios cualitativos en la producción de carne: - Producción de carne bovina libre de riesgo de BSE - Modificaciones cualitativas Animales transgénicos

59 Transgénesis en bovinos. Producción de alimentos Bovinos genéticamente modificados para mejorar la producción láctea Agrobiotecnología Animales transgénicos

60 Transgénesis en peces. Producción de alimentos La introducción de copias extra del gen de hormona de crecimiento aumenta notablemente la velocidad de desarrollo de truchas y salmones. Agrobiotecnología Animales transgénicos Tomado de: Devlin et al., Nature, 2001.

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63 Transgénesis en peces. Fines ornamentales Expresión de proteínas fluorescentes en peces cebra Agrobiotecnología Animales transgénicos

64 Transgénesis en peces. Modelos experimentales El uso de promotores específicos permite detectar patrones de expresión durante el desarrollo Agrobiotecnología Animales transgénicos Tomado de: Wittbrodt et al., Nat. Rev. Genet., 2002.

65 Transgénesis en insectos: transformación de gusanos de seda Agrobiotecnología Animales transgénicos Tomado de: Tomita et al., Nat. Biotechnol., 2003.

66 Transgénesis en insectos: mosquitos Se está intentando producir mosquitos resistentes al parásito de la malaria. Agrobiotecnología Animales transgénicos Tomado de: Catteruccia et al., Nature, Larvas de mosquitos transgénicos (izquierde y centro) que expresan el gen de la proteína GFP. Panel de la izquierda: luz UV; panel de la derecha: luz blanca

67 Transgénesis en aves La expresión de proteínas en la clara de huevo tiene un enorme potencial. La transgénesis en aves se enfrenta todavía con notables dificultades técnicas derivadas de los problemas del aislamiento de ovocitos y cigotas y el posterior cultivo embrionario. Se ha logrado expresar enzimas en la clara del huevo y se obtuvieron quimeras que expresan genes marcadores. La heredabilidad de estos caracteres es baja. Agrobiotecnología Animales transgénicos

68 Transgénesis en cabras La empresa Nexia (Canadá) ha logrado producir cabras que expresan fibroína (proteína de la tela de araña) en su leche. Agrobiotecnología Tomado de: Keefer et al., Biol. Reprod., Animales transgénicos

69 Transgénesis en cerdos Se han transformado cerdos con el gen de la Green Fluorescent Protein mediante transfección de células somáticas en cultivo y posterior clonado. Xenotransplante: - La eliminación de genes para la alfa 1-3 galactosil transferasa permitiría obtener cerdos que no posean el residuo galactosa en su endotelio y, por lo tanto, sean menos proclives al rechazo agudo. Agrobiotecnología Animales transgénicos Universidad de Missouri-Colombia Immerge BioTherapeutics Inc

70 ENVIROPIG University of Guelph

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72 Aplicaciones Producción de proteínas recombinantes humanas en la leche animal Capacidad de producción de proteínas recombinantes en la leche en distintas especies Cerdo Cabra Oveja Vaca Litros/año Proteína Agrobiotecnología Animales transgénicos

73 Aplicaciones. Producción de fármacos Volumen del mercado mundial en proteínas humanas: - U$S millones Ejemplos: - Antitrombina 3: 3: U$S 200 millones - Albúmina sérica: U$S millones Requerimientos mundiales de proteínas humanas y número de animales transgénicos necesarios para satisfacerlo Agrobiotecnología Animales transgénicos Factor VIII 120 g 2 vacas ovejas Alfa-1-antitripsina kg ovejas cabras Factor IX 2 kg 13 ovejas 22 cerdos Albúmina sérica 1000 kg 300 vacas cabras Activador tisular del plasminógeno 75 kg 600 cabras

74 Aplicaciones Producción de proteínas recombinantes humanas en la leche animal Agrobiotecnología Animales transgénicos 1 huevo de oro (1,3 kg) por día U$S /día Vaca transgénica 2 g/l htpa U$S/g 30 L por día U$S /día

75 Aplicaciones El uso de animales transgénicos como bioreactores permitiría suplir la demanda de proteínas recombinantes, en particular de aquellas que requieren producción masiva. Demanda de capacidad productiva instalada (datos a nivel mundial) Agrobiotecnología Animales transgénicos

76 Aplicaciones Producción de proteínas recombinantes en leche de animales transgénicos: Productividad de 1 animal transgénico: 1,5 kg de proteína terapéutica/año = equivalente a L de fermentación o sea 1 animal transgénico = 4 fermentadores de 500 L Agrobiotecnología Animales transgénicos Demanda anual de hormona de crecimiento (hgh): - Mercado latinoamericano: producción de 2 animales transgénicos - Mercado mundial: producción de 40 animales transgénicos

77 ANDi

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82 Referencias Agrobiotecnología 1. Palma, G.A. Biotecnología de la Reproducción. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA, Argentina), Hwang, W.S., Ryu, Y.J., Park, J.H., Park, E.S., Lee, E.G., Koo, J.M., Jeon, H.Y., Lee, B.C., Kang, S.K., Kim, S.J., Ahn, C., Hwang, J.H., Park, K.Y., Cibelli, J.B., Moon, S.Y. Evidence of a pluripotent human embryonic stem cell line derived from a cloned blastocyst. Science, 303: , Cristophides, G.K. Transgenic mosquitoes and malaria transmission. Cellular Microbiology, 7: , Wilmut, I. Cloning for Medicine. Scientific American, 279:58-63, Sitios relacionados con clonación animal: Animales transgénicos

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