FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES EXACTAS Y DE LA EDUCACIÓN DEPARTAMENTO DE QUIMICA BIORGÁNICA

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1 FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES EXACTAS Y DE LA EDUCACIÓN DEPARTAMENTO DE QUIMICA BIORGÁNICA PRÁCTICA 5: PRUEBAS GENERALES PARA CARBOHIDRATOS 1. INTRODUCCION Los carbohidratos contienen en su composición química los grupos funcionales hidroxilo -OH con propiedad de alcohol, y el carbonilo C=O que les da propiedades de aldehídos o cetonas, por lo que se les conoce como aldosas o cetosas. Su unidad básica son los monosacáridos que contienen distinto número de átomos de carbono en su cadena. El grupo carbonilo libre presente en monosacáridos y algunos disacáridos, es muy reactivo. La presencia de este grupo se emplea para diferenciar los que lo tienen libre, que tienen propiedad reductora y los que no lo tienen libre obteniéndose carbohidratos no reductores. Existen varias pruebas para caracterizar a los carbohidratos específicos dependiendo de las propiedades fisicoquímicas de los mismos. Algunas de ellas permiten identificar a los que son reductores, otras a los que no son reductores, otras a cualquier carbohidrato independiente de su poder reductor. Para tener idea de la sensibilidad de los distintos métodos deben probarse soluciones de concentraciones de 1-10 g/l. Se utilizan mezclas problemas comestibles tales como jugos de frutas, panela, miel, etc. 2. OBJETIVO Reconocer la presencia o ausencia de carbohidrato en una muestra a través de la ejecución de reacciones características de ellos. 3. CONSULTAS PRELIMINARES 3.1 Cómo se clasifican los carbohidratos de acuerdo al número de moléculas que contengan? 3.2 Qué tipos de enlace unen a los monosacáridos entre sí? 3.3 Cuándo un monosacárido es reductor y cuando no? 3.4 Investigue las coloraciones y aspectos de las soluciones cuando dan positiva las pruebas de Molisch, Seliwanoff, Bial, Benedict y Lugol? 3.5 Dibuje la estructura de los carbohidratos usados en la práctica. 3.6 Consultar las fichas de seguridad de los reactivos a manipular en la práctica.

2 4. MATERIALES MATERIALES Pipetas graduadas de 5 ml 2 Pipeta graduada de 1 ml 1 Vasos de precipitado de 250 ml 2 Vaso de precipitado de 100 ml 1 Varilla de vidrio 1 Tubos de ensayo 20 Gradilla 1 Pinza de madera 1 Goteros 3 Propipeta 1 Termómetro 1 Frasco lavador 1 Trípode 1 Mechero 1 Malla de asbesto 1 5. REACTIVOS SUSTANCIAS Glucosa, Galactosa, Fructosa, Ribosa, Lactosa, Sacarosa 2% Almidón 2% Jugo de fruta recién preparado (de color claro) Agua destilada Reactivo de Molisch (α-naftol en alcohol + H 2 SO 4 concentrado) Reactivo de Bial (orcinol + HCI concentrado) Reactivo de Barfoed (acetato de cobre + CH 3 COOH glacial) Reactivo de Benedict (CuSO 4, Na 2 CO 3, tartrato de sodio) Reactivo de Seliwanoff (resorcinol + HCl) Solución de lugol (0.01 M de I M de Kl) 100 ml c/u 5 ml 250 ml 30 ml 80 ml 100 ml 80 ml 6. EQUIPOS EQUIPOS Plancha de calentamiento 1 Vortex (agitador mecánico) 1

3 7. PROCEDIMIENTO 7.1 Prueba de Molisch: El ácido sulfúrico concentrado hidroliza el enlace glucosídico y forma monosacáridos que pueden ser deshidratados formándose furfural e hidroximetilfurfural, ellos se combinan después con la α-naftol originando un complejo que puede ser de color purpura, morado, rojo violeta. Montaje de trabajo: Añadir 1 ml de cada una de las soluciones de carbohidrato seleccionadas a tubos de ensayo rotulados y agregar 5 gotas del reactivo de Molisch a cada tubo, agitar la solución. Añada cuidadosamente por las paredes del tubo 0.5 ml de ácido sulfúrico concentrado, de tal forma que el ácido forme una capa por debajo de la solución de carbohidrato, no mezclar. Observe cuidadosamente la aparición de color en la interface de los líquidos. 7.2 Prueba de Seliwanoff: las cetosas se deshidratan más rápidamente que las aldosas dando furfural e hidroximetilfurfural, que se condensan con resorcinol para formar un complejo que según la concentración puede ser rosado cereza; por lo tanto debe de evitarse un calentamiento prolongado de la muestra que se estudia. Montaje de trabajo: Añadir 1 ml de solución de Seliwanoff a 1 ml de solución de carbohidrato en tubos de ensayos rotulados; mezclar la solución y colocar los tubos en un baño de maría hirviendo por 5 minutos; observar la aparición de color rosado cereza, si se prolonga el calentamiento las aldohexosas también dan positiva la prueba con el mismo color; las pentosas dan (+) con un color verde. Por qué la sacarosa da (+)? 7.3 Prueba de Bial o de orcinol: Cuando se calientan pentosas con ácido clorhídrico concentrado se forma furfural que se condensa con el orcinol en presencia de iones férricos y se obtiene un complejo de color verde azulado o verde oliva. El calentamiento prolongado de algunas hexosas forma hidroximetilfurfural que con el orcinol da un complejo de color amarillo oscuro. Montaje de trabajo: añadir 1 ml de reactivo de Bial y 1 ml de la solución de carbohidrato, en tubos de ensayo debidamente rotulados se mezcla la solución y se deja en un baño maría hasta que ella comience a hervir. Dejar enfriar los tubos y adicionar 3 ml de agua y mezclar. Añadir 1 ml de alcohol butílico o 1-butanol, mezclar fuertemente, dejar reposar y examinar la concentración de color que se da en la parte superior en la franja de alcohol butílico. 7.4 Prueba para determinar azucares reductores. Reacción de Benedict: Los carbohidratos que son reductores reaccionan con una solución CuSO 4, en un medio alcalino permitiendo que se forme el óxido cuproso Cu 2 O de color amarillo rojizo. Los diferentes colores que pueden aparecer se deben al tamaño de las partículas formadas. Montaje de trabajo: A 2 ml del reactivo de Benedict añadir 1 ml de solución de carbohidrato en tubos de ensayo debidamente rotulados; mezclar y calentar la solución en un baño de agua hirviendo durante 5 minutos. Observar el cambio y formación de color de las soluciones.

4 7.5 Prueba de yodo para polisacáridos. Reactivo de lugol: El yodo forma complejos coloreados de adsorción con algunos polisacáridos; el almidón da un color azul con yodo, mientras que el glucógeno y el almidón parcialmente hidrolizado (dextrinas grandes) reaccionan dando una coloración parda rojiza. Montaje de trabajo: Añadir 3 gotas de lugol a 1 ml de solución de carbohidrato (cuando el carbohidrato sea el almidón, se debe de mezclar bien esta solución, antes de usar) en tubos de ensayo rotulados, mezclar bien las soluciones. Preparar un blanco con agua destilada más el lugol. Observar los cambios de color. 8. OBSERVACIONES, CÁLCULOS Y RESULTADOS. En la tabla 1 coloque el signo + para prueba positiva o el signo para prueba negativa para cada una de los diferentes experimentos realizados en los tubos de ensayo. Cuando realice el informe, coloree cada círculo con los colores observados en cada prueba. TABLA 1. Registro de pruebas colorimétricas para la identificación de carbohidratos. CARBOHIDRATO Molisch Seliwanoff Bial Benedict Lugol Almidón Lactosa Sacarosa Glucosa Galactosa Ribosa Fructosa Blanco Muestra problema OBSERVACIONES:

5 9. preguntas complementarias. 9.1 Cómo reacciona el lugol (yodo) con el almidón para producir el color azul característico? 9.2 Cuál es la reacción química que se da con el reactivo de Benedict para una prueba positiva? 9.3 Por qué la fructosa da positiva la prueba con el reactivo de Benedict, el cual es específico para azucares reductores? 9.4 Qué carbohidratos se pueden identificar con la prueba de Molisch? 9.5 Por qué se dice que la lactosa tiene un grupo aldehído potencial? 9.6 Por qué el glucógeno y el almidón dan resultados negativos como azucares reductores? 10. RECUPERACIÓN, DESACTIVACIÓN Y/O ALMACENAMIENTO TEMPORAL DE LOS RESIDUOS QUIMICOS RECUPERACIÓN. No aplica DESACTIVACIÓN. No aplica ALMACENAMIENTO TEMPORAL. Los residuos generados en el procedimiento 7.1 deben depositarse en el recipiente para ácidos y bases, los generados en 7.2 y 7.5 en el recipiente de hidrocarburos no halogenados, los del 7.3 en el recipiente para solventes orgánicos y los residuos de las pruebas 7.4 y 7.6 deben depositarse en el recipiente de agroquímica. 11. BIBLIOGRAFIA LOZANO. J.A. Y TULEDA. J. "Prácticas de Bioquímica 1era. Ed. Síntesis, S. A Madrid ISBN PLUMMER. D. T. Bioquímica Practica 2da. Ed. Mc Graw -Hill Latinoamericana, Bogotá, ISBN: