PLANES DE SEGUIMIENTO AMBIENTAL DEL CULTIVO DE MAÍZ MODIFICADO GENÉTICAMENTE EN ESPAÑA

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1 PLANES DE SEGUIMIENTO AMBIENTAL DEL CULTIVO DE MAÍZ MODIFICADO GENÉTICAMENTE EN ESPAÑA 1

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3 PLANES DE SEGUIMIENTO AMBIENTAL DEL CULTIVO DE MAÍZ MODIFICADO GENÉTICAMENTE EN ESPAÑA

4 Título original: Planes de seguimiento ambiental del cultivo de maíz modificado genéticamente en España

5 PLANES DE SEGUIMIENTO AMBIENTAL DEL CULTIVO DE MAÍZ MODIFICADO GENÉTICAMENTE EN ESPAÑA Página ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN Antecedentes Iniciativas de planes de seguimiento de plantas modificadas genéticamente en España Planes de seguimiento financiados por las empresas Planes de seguimiento financiados por la Administración Central EVALUACIÓN DE LOS EFECTOS POTENCIALES DEL MAÍZ Bt SOBRE ORGANISMOS DIANA Centro de Investigaciones Biológicas (CIB-CSIC) Introducción Resistencia de los taladros al maíz Bt y manejo de la resistencia Seguimiento de la evolución de resistencia de taladros al maíz Bt Muestreos en áreas agro-ecológicas de interés Bioensayos de susceptibilidad a la toxina Cry1Ab Seguimiento de la susceptibilidad durante 10 años en poblaciones de campo Selección de resistencia en condiciones de laboratorio Conclusiones Publicaciones científicas EVALUACIÓN DE LOS EFECTOS POTENCIALES DEL MAÍZ Bt SOBRE FAUNA NO DIANA Centro de Investigaciones Biológicas (CIB-CSIC) Introducción Métodos para cuantificar las poblaciones de artrópodos en el cultivo del maíz Bt. 28 5

6 3.3. Estudios de campo para determinar los posibles efectos del maíz Bt sobre los artrópodos depredadores Ensayos de laboratorio con especies indicadoras Conclusiones Publicaciones científicas EVALUACIÓN DE LOS EFECTOS POTENCIALES DEL MAÍZ Bt SOBRE LOS MICROORGANISMOS DEL SUELO Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC) Transferencia de genes de maíz recombinante bt a la rizosfera de la planta y tipificación molecular de rizosferas Bacterias cultivables en rizosferas de maíz transgénico y no transgénico Diseño, validación y especificidad de cebadores para el gen de la beta-lactamasa Presencia del gen de la beta-lactamasa y del promotor 35S: Sensibilidad de detección Efecto estimulador de las bacterias del suelo Gram positivas en el crecimiento de plantas Caracterización microbiológica de la rizosfera: trazabilidad molecular de rizosferas Trazabilidad molecular de rizosferas: Hacia la determinación de un paisaje genómico Introducción Utilización de micromatrices de ADN de genomas bacterianos completos Sensibilidad de detección Efecto de la toxina Bt en las rizobacterias del maíz Huella molecular de rizosferas Conclusiones Publicaciones científicas

7 5. ENSAYOS DE CAMPO CON CULTIVOS TRANSGÉNICOS TOLERANTES A HERBICIDAS EN PROCESO DE APROBACIÓN: EVALUACIÓN DE LOS EFECTOS POTENCIALES DE LOS HERBICIDAS SOBRE LOS MICROORGANISMOS DEL SUELO. Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC) Introducción Estimación somera del efecto de los herbicidas Huella molecular de rizosferas Pirosecuenciación de la región V6 del rarn 16S Conclusiones Publicaciones científicas CONCLUSIONES DE LOS PLANES AGRADECIMIENTOS. 72 7

8 1. INTRODUCCIÓN 1.1. Antecedentes El uso de los organismos modificados genéticamente (OMG) y su liberación al medio ambiente están regulados específicamente mediante una legislación comunitaria y española exhaustiva y rigurosa. El objetivo de estas normas es el de garantizar la seguridad para el medio ambiente y la salud humana y animal, tanto para su utilización en etapas de investigación y desarrollo como para su comercialización. Para ello, en la Unión Europea se aplican procedimientos de autorización paso a paso y caso por caso basados en un análisis de riesgo integrado, en el que la fase de evaluación de los riesgos potenciales para la salud y el medio ambiente, fundamentada en el conocimiento científico, es uno de los pilares básicos de dicha regulación. En el caso de que un OMG concreto supere todos los controles de seguridad ambiental y sanitaria y sea aprobado para su comercialización en la Unión Europea, además estará sujeto a los requisitos establecidos en la Directiva 2001/18/CE 1 o en el Reglamento (CE) nº 1829/ por los cuales los titulares de los organismos modificados genéticamente deberán llevar a cabo Planes de Seguimiento sobre sus efectos medioambientales una vez que se liberan al medio ambiente a escala comercial. El objetivo de la ejecución de estos planes de seguimiento es profundizar en el conocimiento de los posibles efectos de los OMG sobre el medio ambiente y la salud con el fin de conocer el impacto a medio y largo plazo, así como implementar las medidas de gestión del riesgo necesarias para cada caso. Así, según el Anexo VII de la Directiva 2001/18/CE y las notas de orientación desarrolladas con posterioridad (Decisión 2002/811/CE) 3, los objetivos del plan de seguimiento serán: 1 Directiva 2001/18/CE del Parlamento Europeo y del Consejo relativa a la liberación intencional en el medio ambiente de organismos modificados genéticamente y por la que se deroga la Directiva 90/220/CEE (DOCE nº L106, de ). 2 Reglamento (CE) Nº 1829/2003 del Parlamento Europeo y del Consejo sobre alimentos y piensos modificados genéticamente (DOUE nº 268, de ). 3 Decisión 2002/811/CE del Consejo, de 3 de octubre de 2002, por la que se establecen unas notas de orientación complementarias al anexo VII de la Directiva 2001/18/CE del Parlamento Europeo y del Consejo sobre la liberación intencional en el medio ambiente de organismos modificados genéticamente y por la que se deroga la Directiva 90/220/CEE del Consejo (DO L 280, de , p ). 8

9 - Confirmar cualquier hipótesis relativa a la posible aparición y consecuencias de los efectos adversos potenciales del OMG o de su uso identificados en la evaluación del riesgo para el medio ambiente (ERMA), e - Identificar si se producen otros efectos adversos del OMG o de su uso en la salud humana o el medio ambiente que no se hubieran contemplado en la ERMA. En cuanto a los principios generales, dicho seguimiento tendrá lugar desde el momento de la autorización para comercializar un OMG. Cuando se observen cambios relevantes en el medio ambiente, se deberá realizar una nueva evaluación que establezca si son una consecuencia del uso de OMG o no, ya que podrían ser debidos a factores medioambientales ajenos a éstos. El diseño del plan de seguimiento: - Se desarrollará en cada caso, teniendo en cuenta la ERMA realizada con anterioridad, y en función de las características del OMG y la escala de su uso previsto y la gama más completa posible de las condiciones medioambientales donde se espera que se libere el OMG. - Incluirá una vigilancia general para detectar los efectos adversos imprevistos así como, en caso necesario, un control específico centrado en los posibles efectos adversos identificados en la ERMA (son los llamados estudios de casos específicos). - Se determinará un plazo de duración suficiente para detectar los efectos inmediatos y directos, así como, si procede, los efectos diferidos e indirectos que se hayan identificado en la ERMA. - Se utilizarán, siempre que sea posible, redes de vigilancia existentes (supervisión de los cultivos agrícolas, la protección fitosanitaria o de medicamentos de uso humano y veterinario). - Se facilitará la observación, de manera sistemática, de la liberación de un OMG en el entorno receptor y la interpretación de dichas observaciones en lo que se refiere a la seguridad de la salud humana o del medio ambiente. - Se determinará la responsabilidad para llevar a cabo las diversas tareas que requiere el plan de seguimiento, y se asegurará un canal que permita que el titular de la autorización y la Autoridad competente estén informados sobre cualquier efecto adverso que se observe en la salud humana y el medio ambiente, así como permitir que el titular de la autorización o la Autoridad competente, en su caso, tomen las medidas necesarias para proteger la salud humana y el medio ambiente. 9

10 Una vez diferenciados conceptualmente los casos específicos y la vigilancia general, deben establecerse marcos y fijar estrategias para desarrollar los planes de seguimiento. Mientras que para los casos específicos es necesario desarrollar métodos y protocolos científicos estandarizados para cada tipo de OMG, para la vigilancia general será muy útil emplear las redes de vigilancia existentes, u otras herramientas de estudio y prospección con el fin de concentrar esfuerzos en aquello que debe ser preservado en el entorno, centrándose principalmente en los objetivos de protección establecidos en la normativa española y comunitaria y en determinadas especies indicadoras Iniciativas de planes de seguimiento de plantas modificadas genéticamente en España Los planes de seguimiento comenzaron a ser un requisito obligatorio a raíz de la entrada en vigor de la Directiva 2001/18/CE en abril de Sin embargo, cabe enfatizar que en España se comenzó a desarrollar y aplicar un Plan de Seguimiento para el cultivo de maíz modificado genéticamente desde el año 1998 cuando fueron aprobadas las primeras variedades comerciales procedentes del evento de transformación Bt176, que expresan la proteína insecticida Cry1Ab, y cuyo objetivo es contribuir al control selectivo de dos importantes plagas que afectan a este cultivo: los taladros del maíz Ostrinia nubilalis y Sesamia nonagrioides. Es decir, las Autoridades competentes en España, tomando en consideración el Principio de Precaución, exigieron un plan de seguimiento para estas variedades de maíz Bt desde su inclusión en el Registro Español de Variedades Comerciales (Orden de 23 de marzo de 1998) 4. Durante los 6 años posteriores a la aprobación de esta modificación genética se llevó a cabo un Plan de seguimiento post-comercialización ( ) de variedades de maíz Bt176 resistentes a taladros de la empresa Syngenta. Un segundo plan de seguimiento para variedades de maíz del evento de transformación MON810, igualmente resistente a taladros y de la empresa Monsanto, se inició en 2003 y sigue actualmente en curso, para todas las variedades actualmente en el Registro de Variedades Comerciales del Ministerio de Medioambiente, y Medio Rural y Marino (MARM). Estos planes fueron diseñados conjuntamente por el titular del evento de transformación y los expertos de la Comisión Nacional de Bioseguridad, que emitió los 4 BOE núm. 73, de , p

11 correspondientes informes favorables sobre los protocolos y estudios incluidos en dichos planes. Las variedades comerciales que contienen el evento de transformación fueron aprobadas finalmente por el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación (MAPA) con las correspondientes Órdenes ministeriales para el registro de variedades comerciales Planes de seguimiento financiados por las empresas Los planes de seguimiento para las variedades de maíz que contienen las transformaciones genéticas resistentes a insectos (eventos Bt176 o MON810) que se han llevado a cabo bajo responsabilidad de las empresas en cumplimiento con los requisitos establecidos en la legislación, incluyeron los siguientes estudios: - Evaluación de la efectividad del carácter insecticida de la modificación introducida en estas variedades. - Estudio de la posible aparición de resistencias a la toxina Cry1Ab en las poblaciones de las 2 especies mencionadas de taladros del maíz. - Posibles efectos sobre la entomofauna y sobre los microorganismos del suelo en las parcelas cultivadas con estas variedades. - Posibles efectos sobre la evolución de las poblaciones bacterianas de la flora digestiva de los animales que consumen este maíz y en especial en lo que concierne a la resistencia a la ampicilina 6. - Impacto sobre ciclos biogeoquímicos: medición de parámetros químicos (metabolismos del C y N) y biológicos (caracterización de microorganismos asociados a la rizosfera y variación poblacional a lo largo del periodo de duración del plan). Además, los planes de seguimiento incluyen los siguientes requisitos: - Indicación de la superficie que deberá sembrarse con variedades convencionales en relación con la superficie sembrada con variedades transgénicas, al objeto de que sirvan de refugio al taladro. - Programas de información a los agricultores, recomendando prácticas culturales para el control de plantas adventicias, así como de la necesidad de la siembra de 5 Reglamento general del Registro de variedades Comerciales, Orden de 23 de marzo de 1998 y sucesivas Órdenes APA y ARM ( 6 Este estudio sólo se realizó para el maíz Bt176, que contiene el gen marcador de resistencia a ampicilina. 11

12 una banda con una variedad convencional de maíz con la anchura y características adecuadas en cada caso. Los resultados de estos estudios realizados tanto por instituciones científicas públicas como privadas han sido incorporados en los informes elaborados por las empresas Syngenta y Monsanto (Informe del Plan de Seguimiento maíz Bt176, 2005, e Informes del Plan de Seguimiento del MON810, 2006, 2007 y 2008) y alguno de ellos publicado en revistas científicas reconocidas. Dichos informes anuales son remitidos por las empresas a la Comisión Europea y a los Estados miembros para su consideración y si procede, para su revisión y adaptación, siendo, además, accesibles al público Planes de seguimiento financiados por la Administración Central Desde 1998 y mediante convenios de colaboración con Centros Públicos de Investigación, se están llevando a cabo estudios científicos encaminados a evaluar posibles efectos ambientales, directos e indirectos y a largo plazo derivados del cultivo de las variedades de maíz modificadas genéticamente resistentes a insectos (eventos Bt176 y MON810). Estos estudios de investigación han sido promovidos por la Comisión Nacional de Bioseguridad, financiados por el Gobierno Central y llevados a cabo por dos Centros del CSIC de reconocido prestigio científico, el Centro de Investigaciones Biológicas (CIB-CSIC) y el Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC). Con el propósito de desarrollar métodos y protocolos adecuados para el establecimiento de planes de seguimiento para aquellos cultivos que están en fase de aprobación, en el año 2007 comenzaron otros estudios relacionados con el impacto ambiental de maíz tolerante a herbicidas y de algodón, también tolerante a un herbicida en En relación con estos últimos, los resultados serán publicados en cuanto estén disponibles. Los estudios que se han efectuado o se están llevando a cabo por Centros públicos de investigación son los siguientes: - Evaluación de los efectos potenciales de maíz Bt resistente a insectos sobre organismos diana y fauna auxiliar. Centro de Investigaciones Biológicas (CIB-CSIC). 12

13 - Evaluación de los efectos potenciales de las plantas modificadas genéticamente sobre los microorganismos del suelo: transferencia genética del maíz transgénico a las poblaciones bacterianas en el suelo de cultivo (CNB-CSIC). - Evaluación científica del impacto ecológico sobre la biodiversidad del maíz tolerante a herbicida: evaluación de los efectos potenciales de los herbicidas sobre los microorganismos del suelo (CNB-CSIC) 7. En los capítulos sucesivos se presentan de forma detallada los principales resultados obtenidos de estos estudios financiados por el Ministerio de Medio Ambiente, y Medio Rural y Marino, y llevados a cabo por las instituciones científicas mencionadas. 7 Aunque hasta la fecha no se ha autorizado para el cultivo comercial ningún maíz tolerante a herbicida, sin embargo se ha iniciado este tipo de estudios anticipándose a un posible futuro cultivo utilizando material de un ensayo experimental autorizado. 13

14 2. EVALUACIÓN DE LOS EFECTOS POTENCIALES DEL MAÍZ Bt SOBRE ORGANISMOS DIANA. Félix Ortego, Gema P. Farinós, Pedro Castañera Departamento de Biología Medioambiental, Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC Ramiro de Maeztu 9, Madrid Introducción Existe un amplio consenso en cuanto a que los taladros o barrenadores del maíz, Ostrinia nubilalis (Lepidoptera, Crambidae) y Sesamia nonagrioides (Lepidoptera, Noctuidae), son las plagas de mayor importancia económica del cultivo del maíz en España. Las larvas penetran en el tallo de las plantas de maíz excavando largas galerías. Estos daños causan notables pérdidas de rendimiento debidas a la disminución en la disponibilidad de asimilados en la planta y al debilitamiento de su estructura (Figura 1), lo que incrementa aún más las pérdidas por la caída de plantas al impedir su cosecha. Este comportamiento larvario endófito limita notablemente la utilidad de las prácticas de control biológico y químico. Las cañas del maíz actúan como una barrera de protección dificultando la acción de depredadores y parasitoides, así como la de los insecticidas convencionales. Figura 1.- Adultos y larvas de los taladros del maíz Sesamia nonagrioides y Ostrinia nubilalis. Sesamia nonagrioides Ostrinia nubilalis 14

15 La utilización de variedades que expresan caracteres físicos y/o químicos de resistencia, obtenidas por mejora genética, ha sido durante décadas la estrategia de control más común y efectiva para la protección del maíz contra ambas especies de taladros. Una limitación de esta estrategia ha sido el escaso número de genes transferibles y el tiempo necesario para la obtención de variedades resistentes. El desarrollo de plantas transgénicas que expresan proteínas insecticidas ha permitido una vía más rápida y flexible para conseguir plantas de maíz con altos niveles intrínsecos de resistencia a las dos especies de taladro. La bacteria Bacillus thuringiensis (Bt) ha sido una fuente inagotable de toxinas específicas para el control de insectos, que expresadas en distintas plantas cultivadas han dado lugar a lo que se conoce genéricamente como plantas Bt (Sanchis y Bourguet, 2008). Entre ellas se encuentran diversas variedades de maíz modificado genéticamente (maíz Bt), altamente eficaces para el control de los taladros del maíz. Hasta la fecha, la Unión Europea ha aprobado para su cultivo dos eventos de maíz Bt que expresan la toxina Cry1Ab: Evento 176 (Syngenta) y MON810 (Monsanto). En España, el cultivo del maíz Bt se inició en 1998 con la aprobación de la variedad Compa CB (Evento 176) de Syngenta. La superficie cultivada con esta variedad se mantuvo en torno a las hectáreas, hasta su retirada del mercado en el año A partir del año 2003 comenzaron a comercializarse variedades derivadas del evento MON810 por distintas empresas de semillas. Su superficie ha ido en aumento hasta alcanzar las ha en la campaña 2008, lo que representa un 22% del total de la superficie de maíz cultivado en España (Figura 2). Actualmente, el número de variedades registradas de maíz Bt es superior a 120, lo que permite su cultivo en distintas zonas agro-ecológicas. La legislación europea en materia de plantas transgénicas exige la realización de estudios exhaustivos para determinar que su liberación no supone ningún tipo de riesgo sobre la salud humana o el medio ambiente (Evaluación de Riesgos Ambientales, ERA). Asimismo, contempla la posibilidad de implementar programas de seguimiento que permitan evaluar el impacto ecológico de su cultivo a gran escala. Estos planes de seguimiento sólo son requeridos a nivel europeo desde el año 2001 pero, ateniéndose al principio de precaución, las autoridades españolas exigen la realización de planes de seguimiento para el maíz Bt desde el año Como parte del plan de seguimiento se estableció un Convenio de colaboración entre el entonces Ministerio de Medio Ambiente (MMA) y el Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), a través del Centro de Investigaciones Biológicas (CIB), para evaluar los potenciales riesgos ecológicos derivados del cultivo a gran escala del maíz Bt (Castañera y Ortego, 2000; Bartsch et al., 2006; 15

16 Ortego et al., 2009). Entre los diferentes aspectos que se contemplan, hay uno de especial relevancia en relación a la interacción del cultivo con las plagas diana. Esto es, la posible aparición de poblaciones de taladros resistentes a la toxina Cry1Ab, expresada en el maíz Bt, debido a una alta exposición continuada a la toxina. Figura 2.- Superficie cultivada con variedades de maíz Bt, procedentes de los eventos Bt176 y MON810, entre los años 1998 y 2009 en España. Fuente: MARM: Superficie (hectáreas) MON810 Bt Resistencia de los taladros al maíz Bt y manejo de la resistencia Los niveles de toxina expresados en el maíz Bt suponen una elevada presión de selección para ambas especies de taladro, por lo que su cultivo a gran escala podría favorecer un rápido proceso de selección de resistencia. El desarrollo de resistencia es un fenómeno complejo, ligado a la interacción de factores genéticos y ambientales, y está considerado como uno de los riesgos principales del uso comercial de plantas Bt (Tabashnik et al., 2009). Para poder mantener la eficacia del maíz Bt a largo plazo es necesario detectar cambios en la susceptibilidad de los taladros a la toxina, así como la utilización de estrategias de manejo de la resistencia que permitan prevenir o retrasar la aparición de poblaciones resistentes. En España, al igual que en otros países donde se cultiva el maíz Bt, la estrategia mayoritariamente recomendada para el manejo de la resistencia en campo se basa en el uso de variedades con un alto grado de expresión de la toxina en la planta, junto con el establecimiento de campos adyacentes no transgénicos 16

17 (20% de la superficie) que actúen como reservorio para poblaciones susceptibles a las toxinas (Figura 3). Esta estrategia es conocida como de dosis alta / refugio (Bravo y Soberón, 2008). Para que dicha estrategia sea efectiva, se requieren tres requisitos esenciales: una baja frecuencia de alelos de resistencia para que el número de homocigotos resistentes sea muy reducido; que los insectos resistentes que provienen de los campos de maíz Bt se crucen con los insectos susceptibles que se preservan en los refugios; y que la resistencia sea funcionalmente recesiva para que los descendientes heterocigotos no sobrevivan. Todos estos aspectos han sido estudiados de forma exhaustiva en S. nonagrioides, por ser la plaga diana de mayor importancia económica en nuestras condiciones y por no disponer de datos previos. Estudios similares se han realizado en otros países Europeos y en Estados Unidos con O. nubilalis, por su mayor importancia como plaga en estos países (Bourguet et al., 2003; Leniaud et al., 2006). Figura 3.- La siembra de zonas de maíz convencional denominadas refugios, próximas a los campos de maíz Bt, posibilita que los escasos individuos resistentes (RR) que sobrevivan en el campo con maíz Bt puedan aparearse con los individuos susceptibles (SS), procedentes de los refugios, para dar descendientes (RS) sensibles. Los estudios dirigidos a determinar la frecuencia de alelos de resistencia en poblaciones de campo de S. nonagrioides se han realizado mediante la técnica denominada F 2 screen. Por este procedimiento se pueden estimar las frecuencias de los alelos de resistencia de una población, exponiendo la generación F 2, descendiente de parentales capturados en campo, a una dosis discriminante de toxina. Estos estudios han 17

18 contado con la colaboración de los grupos del Dr. Andow (University of Minnesota) y la Dra. Savopoulou-Soultani (University of Thessaloniki), dentro del marco de un proyecto Europeo en el que se han abordado distintos aspectos relacionados con la resistencia. Los resultados muestran una frecuencia de alelos resistentes < 8.6 x 10-3 para las poblaciones españolas y < 9.7 x 10-3 para las griegas, valores compatibles con la estrategia de dosis alta / refugio (Andreadis et al., 2007). Otro aspecto muy importante para un correcto manejo de la resistencia es la determinación del flujo génico entre poblaciones de taladros. En este sentido, se han analizado la estructura genética de poblaciones de S. nonagrioides procedentes de España, Francia, Italia, Grecia y Turquía (De la Poza et al., 2006, 2008). Los resultados obtenidos son indicativos de poblaciones genéticamente diferenciadas, con unos niveles moderados, pero significativos, de flujo génico entre poblaciones. Asimismo, se han realizado estudios sobre las enzimas digestivas en S. nonagrioides y su interacción con la toxina Cry1Ab, expresada en el maíz Bt, por su papel fundamental en la activación proteolítica de la toxinas y porque pueden ser responsables de su degradación (Díaz-Mendoza, 2006; Díaz-Mendoza et al., 2005, 2007). Estos estudios permitirán identificar potenciales mecanismos de resistencia mediados por proteasas que se pudieran desarrollar en poblaciones de campo Seguimiento de la evolución de resistencia de taladros al maíz Bt La detección precoz de insectos resistentes en poblaciones naturales de taladros es de enorme utilidad para el manejo de la resistencia. Por consiguiente, el seguimiento de la resistencia debe realizarse de forma regular en aquellas zonas donde existe un mayor riesgo, de forma que ésta pueda detectarse cuanto antes y así poder aplicar de forma rápida las medidas de manejo oportunas. Por otra parte, es preciso contar con una metodología fiable y repetitiva que permita discriminar entre las variaciones interpoblacionales y la adquisición de resistencia moderada o baja, puesto que se han encontrado grandes diferencias en la susceptibilidad de poblaciones naturales en ambas especies de taladros. Coincidiendo con el inicio del cultivo del maíz Bt en España en 1998, se puso en marcha el programa de seguimiento de la resistencia en taladros, como una parte del Convenio de Colaboración entre el MMA y el CIB-CSIC (Farinós et al., 2001, 2004a). Los 18

19 objetivos establecidos en el mismo son: a) determinar las áreas agro-ecológicas de interés; b) establecer la susceptibilidad basal de las poblaciones de taladros en estas áreas; y c) realizar un seguimiento sistemático de la susceptibilidad para detectar la aparición de poblaciones resistentes Muestreos en áreas agro-ecológicas de interés Se espera que la resistencia al maíz Bt se desarrolle más rápidamente en aquellas zonas donde la presión de selección sea mayor, lo que se corresponde con las zonas con mayor superficie sembrada de este cultivo. Considerando los niveles de infestación de las dos especies de taladros en las diferentes zonas maiceras y la evolución de las superficies sembradas con maíz Bt, se establecieron tres áreas agro-ecológicas de interés para el seguimiento de la resistencia: Suroeste (Andalucía y Extremadura), Centro (Castilla-La Mancha y Madrid) y Ebro (Aragón y Cataluña). La superficie sembrada con maíz Bt en estas zonas representa el 94% del total del maíz Bt en España en el año Además, se ha realizado, en determinados años, un seguimiento de poblaciones procedentes de Galicia, por tratarse de una de las zonas de España donde hasta la fecha no se ha cultivado maíz Bt. El método de muestreo establecido consiste en recoger anualmente, en otoño, entre 300 y 500 larvas, procedentes de dos o tres campos comerciales distintos, en cada una de las áreas agro-ecológicas (Figura 4). La elección de los campos a muestrear ha variado dependiendo de las variedades transgénicas cultivadas. Cuando las poblaciones de taladros se recogían en campos de la variedad Compa CB (evento Bt176), que expresa concentraciones subletales de la toxina a partir de la maduración del grano, los muestreos se realizaban dentro del propio campo de maíz Bt. Sin embargo, cuando éstas proceden de campos cultivados con variedades procedentes del evento MON810, los muestreos se realizan en los refugios adyacentes a estos campos, ya que la alta expresión de la toxina durante todo el ciclo de la planta, impide la supervivencia de larvas dentro del propio campo. En el momento de la recogida, si las larvas no se encuentran en diapausa (periodo de crecimiento o desarrollo suspendido) se les induce en el laboratorio para sincronizar su ciclo biológico y facilitar su manejo. Una vez pupan, se sexan y se disponen en ponederos donde emergen los adultos. 19

20 Figura 4.- Recogida de taladros en campos comerciales de maíz Bioensayos de susceptibilidad a la toxina Cry1Ab Los bioensayos para determinar la evolución de la susceptibilidad de los taladros a la toxina han de ajustarse a una metodología consistente para que sean comparables entre años y entre laboratorios. Es necesario, pues, estandarizar la toxina, la forma de administración y la determinación de la mortalidad. Esto ha sido posible mediante el uso del protocolo elaborado conjuntamente con un grupo de expertos de la Unión Europea. Los bioensayos se realizan con larvas neonatas descendientes de las recogidas en campo, que son expuestas a la toxina mediante la técnica de tratamiento en superficie (Castañera et al., 2004). Básicamente, la técnica consiste en dispensar la dieta semisintética usada para la cría de cada especie en bandejas de ensayo con 128 celdas (1 ml/celda) y tratar en superficie con la toxina Cry1Ab, utilizando entre 7 y 9 concentraciones. Sobre cada celda se deposita una larva neonata (<24 h) que se confina con una película de plástico adherente (Figura 5). Para cada dosis se utiliza un total de 3-4 repeticiones de larvas tomadas al azar de cada una de las jaulas de oviposición, para garantizar la máxima variabilidad de las poblaciones recogidas. Las larvas se mantienen a 25 ± 0,3ºC, 70 ± 5 % r.h., y oscuridad constante, evaluándose la mortalidad a los 7 días. Para cada población, los datos de mortalidad permiten determinar la susceptibilidad a la toxina (CL50 y CL90, 20

21 concentraciones de la toxina que matan al 50 y 90% de las larvas, respectivamente) mediante la realización de un análisis probit. Figura 5.- Bandejas de 128 celdas utilizadas para los bioensayos de susceptibilidad a la toxina Cry1Ab. En cada celda se deposita una larva neonata (ver detalle) que se confina con una película de plástico transparente Seguimiento de la susceptibilidad durante 10 años en poblaciones de campo La susceptibilidad basal a la toxina Cry1Ab en poblaciones españolas de S. nonagrioides y O. nubilalis se estableció en 1998 y 1999, con poblaciones recogidas en campos sembrados con maíz no transgénico (González-Núñez et al., 2000). Los resultados de este estudio mostraron que para las dos especies de taladros existían diferencias de susceptibilidad entre poblaciones procedentes de diferentes áreas geográficas (Suroeste, Centro, Ebro y Galicia). Estas diferencias deben atribuirse a variaciones naturales, puesto que estas poblaciones no habían estado previamente expuestas a insecticidas Bt y, además, todas ellas se recogieron en campos de maíz distantes de aquellos en los que se cultivó por primera vez maíz Bt en Para el seguimiento de la resistencia, se han realizado muestreos anuales ( ) de las dos especies de taladros en campos de maíz Bt en las áreas agro-ecológicas mencionadas (Suroeste, Centro y Ebro), con objeto de comparar la evolución de la susceptibilidad a la toxina a lo largo del tiempo y en relación al nivel basal de 21

22 susceptibilidad. Hasta la fecha no se ha obtenido un aumento significativo de la tolerancia de las poblaciones de O. nubilalis y S. nonagrioides a la toxina Cry1Ab en ninguna de las regiones muestreadas, aunque se han observado oscilaciones entre años en algunas de éstas (De la Poza, 2004; Farinós et al., 2004b; Castañera et al., 2005). Sin embargo, estas variaciones no indican cambios en la susceptibilidad de las poblaciones a lo largo del tiempo, por estar dentro del rango de las diferencias poblacionales dentro de un mismo año. Estos resultados demuestran la enorme importancia de utilizar toxinas cuya actividad permanezca estable en el tiempo, así como de disponer de poblaciones de referencia de laboratorio que nos permitan estandarizar los resultados obtenidos Selección de resistencia en condiciones de laboratorio Un método para evaluar el potencial de una plaga para desarrollar resistencia es la selección de resistencia en laboratorio. La comparación de la susceptibilidad entre las poblaciones seleccionadas, después de varias generaciones de selección, y las de referencia no-seleccionadas permite evaluar anticipadamente el riesgo de aparición de resistencia. Las larvas de las poblaciones seleccionadas se alimentan en una dieta de cría sobre la que se dispensa una concentración de toxina Cry1Ab capaz de matar el 80% de los individuos (CL80). Para cada generación de selección se utilizaron unas 2000 larvas neonatas de O. nubilalis y unas 1500 de S. nonagrioides. El proceso de selección se repite en cada generación, y la comparación de la CL50 entre las poblaciones seleccionadas y de referencia se efectúa cada cuatro generaciones mediante análisis probit. Los resultados obtenidos muestran un aumento de la tolerancia a la toxina después de tan solo ocho generaciones de selección (21 veces más tolerante en el caso de S. nonagrioides y 10 veces para O. nubilalis), lo que indica una respuesta a la presión selectiva en ambas especies de taladros (Farinós et al., 2004b). Sin embargo, estos resultados no han supuesto una disminución de la efectividad del maíz Bt, puesto que ninguna de las larvas procedentes de las líneas seleccionadas fue capaz de completar su ciclo sobre plantas de maíz Bt. Además, cada dos generaciones las pupas procedentes de las poblaciones sometidas a selección y de las de referencia, son pesadas y sexadas para determinar los posibles costes biológicos asociados al proceso de selección para resistencia. No se han detectado cambios significativos en la proporción sexual o el peso de las pupas en ninguna de las dos especies. 22

23 2.4. Conclusiones El convenio de colaboración entre el MMA y el CIB-CSIC ha permitido realizar un seguimiento de la aparición temprana de líneas de taladros resistentes en las zonas de cultivo de maíz Bt y ha contribuido a validar la estrategia de manejo de la resistencia adoptada de forma obligatoria en nuestras condiciones. Las aportaciones más relevantes en relación al seguimiento de la resistencia son: a) Se ha desarrollado conjuntamente con grupos de trabajo europeos un método estándar habiéndose validado mediante la comparación de la evolución de la resistencia de los taladros a toxinas expresadas en la planta de maíz en distintas zonas agro-ecológicas de España y de la UE. b) La selección de resistencia en condiciones de laboratorio sugiere que las poblaciones de ambas especies de taladros tienen el potencial de desarrollar niveles moderados de tolerancia a la toxina Cry1Ab, aunque insuficiente para sobrevivir en maíz Bt. c) El seguimiento de la evolución de la resistencia en poblaciones de campo permite concluir que las poblaciones de taladros no han desarrollado resistencia a la toxina Cry1Ab después de 12 años de cultivo continuado del maíz Bt en grandes áreas, puesto que actualmente el maíz Bt representa el 20-22% de la superficie total de maíz cultivado en España. d) La existencia de un flujo génico limitado pero suficiente, junto con la baja frecuencia de alelos de resistencia encontrada en poblaciones de Sesamia nonagrioides es compatible con la aplicación de la estrategia de dosis alta / refugio. No obstante, el cultivo a gran escala del maíz Bt implica un riesgo de aparición de resistencia, por lo que es obligado continuar con los trabajos de investigación contemplados en el programa de seguimiento en curso, realizados por el CIB-CSIC y financiados por el Ministerio de Medio Ambiente, y Medio Rural y Marino (MARM). 23

24 2.5. Publicaciones Científicas Andreadis S.S., Álvarez-Alfageme F., Sánchez-Ramos I., Stodola T.J., Andow D.A., Milonas P.G., Savopoulou-Soultani M., Castañera P Frequency of resistance to Bacillus thuringiensis toxin Cry1Ab in Greek and Spanish population of Sesamia nonagrioides (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Economic Entomology 100: Bartsch D., Bigler F., Castañera P., Gathmann A., Gielkens M., Hartley S., Lheureux K., Renckens S., Schiemann J., Sweet J., Wihelm R Concepts for general surveillance of Genetically Modified (GM) plants: The EFSA position. Journal fur Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (Journal of Consumer Protection and Food Safety), Supplement 1: Bourguet, D., Chaufaux, J., Seguin, M., Buisson, C., Hinton, J.L., Stodola, T.J., Porter, P., Cronholm, G., Buschman, L.L., Andow, D.A Frequency of alleles conferring resistance to Bt maize in French and US corn belt populations of Ostrinia nubilalis. Theoretical and Applied Genetics 106: Bravo, A., Soberón, M How to cope with insect resistance to Bt toxins? Trends in Biotechnology 26: Castañera, P., Ortego, F El maíz transgénico en España. Mundo Científico 20: 43- Castañera P., Ortego F., Farinós G.P., Hernández-Crespo P., de la Poza M Métodos de evaluación de los efectos potenciales del cultivo del maíz transgénico en insectos diana y en artrópodos depredadores. Phytoma 164: Castañera P., Farinós G.P., de la Poza M., Hernández-Crespo P., Ortego F Estimación de la resistencia al maíz Bt de poblaciones españolas de taladros. Phytoma 173: De la Poza M Maíz Bt: Seguimiento de la resistencia de Sesamia nonagrioides (Lepidoptera: Noctuidae) y Ostrinia nubilalis (Lepidoptera: Crambidae) y efectos en artrópodos depredadores. Universidad Politécnica de Madrid (Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos). De la Poza M., Farinós G.P., Ortego F., Hernández-Crespo, P., Castañera P Genetic structure of Sesamia nonagrioides populations: Implications for Bt-maize resistance management. OILB/wprs Bulletin 29 (5):

25 De la Poza, M., Farinós, G.P., Beroiz, B., Ortego, F., Hernández-Crespo, P., and Castañera, P Genetic structure of Sesamia nonagrioides (Lefebvre) populations in the Mediterranean area. Environmental Entomology 37: Díaz Mendoza, M.M Proteasas digestivas de tipo tripsina del taladro del maíz, Sesamia nonagrioides (Lepidoptera: Noctuidae): caracterización e interacción con la proteína insecticida Cry1Ab. Universidad: Politécnica de Madrid (Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos). Díaz-Mendoza M., Ortego F., García de Lacoba M., Magaña C., de la Poza M., Farinós G.P., Castañera P., Hernández-Crespo P Diversity of trypsins in the Mediterranean corn borer Sesamia nonagrioides (Lepidoptera: Noctuidae), revealed by nucleic acid sequences and enzyme purification. Insect Biochemistry and Molecular Biology 35: Díaz-Mendoza M., Farinós G.P., Castañera P., Hernández-Crespo P., Ortego F Proteolytic processing of native Cry1Ab toxin by midgut extracts and purified trypsins from the Mediterranean corn borer Sesamia nonagrioides. Journal of Insect Physiology 53: Farinós G.P., de la Poza M., Ortego F., Castañera P Monitoring corn borers resistance to Bt-maize in Spain. Proceedings EU Workshop: Monitoring of Environmental Impacts of Genetically Modified Plants, Berlin, 9th and 10th November pp: Miklau, M., Gaugitsch, H., and Heissenberger, A. (Eds.). German Federal Environmental Agency, Berlin, Germany. Farinós G.P., de La Poza M., González-Núñez M., Hernández-Crespo P., Ortego, F., Castañera P. 2004a Research programme to monitor corn borers resistance to Bt-maize in Spain. OILB/wprs Bulletin 27 (3): Farinós G.P., de la Poza M., Hernández-Crespo P., Ortego F., Castañera P. 2004b. Resistance monitoring of field populations of the corn borers Sesamia nonagrioides and Ostrinia nubilalis after five years of Bt maize cultivation in Spain. Entomologia Experimentalis et Applicata 110: González-Núñez M., Ortego F., Castañera P Susceptibility of Spanish populations of the corn borers Sesamia nonagrioides (Lepidoptera: Noctuidae) and Ostrinia nubilalis (Lepidoptera: Crambidae) to a Bacillus thuringiensis endotoxin. Journal of Economic Entomology 93: Leniaud, L., Audiot, P., Bourguet, D., Frerot, B., Genestier, G., Lee, S.F., Malausa, T., Le Pallec, A.H., Souqual, M.C., Ponsard, S Genetic structure of European and Mediterranean maize borer populations on several wild and cultivated host plants. Entomologia Experimentalis et Applicata 120:

26 Ortego, F., Pons, X., Albajes, R., and Castañera, P European commercial genetically modified plantings and field trials. En: Environmental Impact of Genetically Modified Crops pp Ferry, N., and Gatehouse, A.M.R. (Eds.). CAB International. Sanchis, V., Bourguet D Bacillus thuringiensis: applications in agriculture and insect resistance management. A review. Agronomy for Sustainable Development 28: Tabashnik, B., Van Rensburg, J.B.J., Carrière, Y Field-evolved insect resistance to Bt crops: definition, theory and data. Journal of Economic Entomology 102: En negrita aparecen las publicaciones del grupo CIB-CSIC, financiados en su totalidad o en parte por el Convenio de colaboración entre el entonces Ministerio de Medio Ambiente (actualmente MARM) y el Consejo Superior de Investigaciones Científicas. 26

27 3. EVALUACIÓN DE LOS EFECTOS POTENCIALES DEL MAÍZ Bt SOBRE LA FAUNA NO DIANA Gema P. Farinós, Félix Ortego y Pedro Castañera Departamento de Biología Medioambiental, Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC Ramiro de Maeztu 9, Madrid 3.1. Introducción El maíz transgénico resistente a insectos (maíz Bt) cultivado en España expresa una toxina insecticida, Cry1Ab, procedente de la bacteria del suelo Bacillus thuringiensis. Esta toxina posee una alta especificidad hacia dos plagas de lepidópteros, Sesamia nonagrioides Lefebvre y Ostrinia nubilalis Hübner, que penetran en el tallo del maíz originando importantes pérdidas de rendimiento y a las que se denomina comúnmente taladros del maíz. Sin embargo, los cultivos no solo albergan a insectos plaga. Una diversa fauna de artrópodos habita también estos agroecosistemas, en los cuales se refugian, se reproducen y se alimentan. A los artrópodos que se alimentan de las plagas se les conoce con el nombre de enemigos naturales, denominación que engloba a depredadores y parasitoides. Los depredadores, tanto larvas como adultos, se alimentan de otras especies animales o presas, a las que matan para completar su desarrollo, y pueden encontrarse en muchos órdenes de insectos o incluso en otros grupos, como arañas y ácaros. Los parasitoides son insectos, generalmente himenópteros y dípteros, cuyos estados inmaduros se desarrollan en un solo huésped al que habitualmente matan antes de la emergencia del adulto. Esta biodiversidad asociada al cultivo cumple un importante papel, ya que contribuyen de forma significativa a mantener el equilibrio en el ecosistema agrícola, jugando, además, un importante papel en la regulación de las poblaciones de plagas (Kromp, 1999; Nyffeler y Sunderland, 2003). Una de las primeras razones para el desarrollo de plantas transgénicas resistentes a insectos plaga es reducir la dependencia actual de plaguicidas convencionales. Esto supondría una gran ventaja para la conservación de los enemigos naturales, ya que a la reducción del uso de insecticidas habría que añadir la especificidad de la toxina hacia las plagas a las que está destinada, lo cual debería traducirse en una mayor abundancia de la fauna asociada al cultivo (Castañera y Ortego, 2000). Sin embargo, la complejidad de las interacciones entre los distintos niveles tróficos de la cadena alimenticia (la planta, las plagas asociadas, sus enemigos naturales y otros artrópodos no diana) hace necesario 27

28 evaluar caso por caso los efectos potenciales directos o indirectos de los cultivos Bt y contar con un gran número de datos obtenidos en distintos agroecosistemas con una metodología semejante (Romeis et al., 2006; Icoz y Stotzky, 2008; Perry et al., 2010). Se han descrito tres vías principales mediante las cuales la fauna no diana puede entrar en contacto con la toxina insecticida que expresa el maíz Bt: ingiriendo la toxina directamente al alimentarse de polen o materia vegetal, alimentándose de insectos que han ingerido la toxina o por la liberación de las toxinas a través de los exudados de la raíz, acumulándose en el suelo hasta alcanzar niveles tóxicos para los organismos que viven en él (Saxena et al., 1999; Groot y Dicke, 2002). Asimismo, los efectos del Bt sobre la fauna no diana pueden ser de dos tipos: a) directos, debidos a la toxicidad de la proteína insecticida adquirida directamente o a través de la presa y b) indirectos, al disminuir la cantidad o la calidad de las presas ingeridas. En este contexto se enmarca el Convenio de Colaboración suscrito en el año 2000 entre el entonces Ministerio de Medio Ambiente (MMA) y el Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC). Como parte del plan de seguimiento, desde el año 2000 se han realizado estudios para determinar experimentalmente los posibles efectos adversos del cultivo del maíz Bt sobre la fauna de artrópodos depredadores que forman parte del cultivo (Ortego et al., 2009). Con el fin de determinar los posibles efectos a corto y medio plazo que puede tener el cultivo continuado del maíz Bt en España sobre los depredadores que coinciden espacial y temporalmente con el cultivo, se han llevado a cabo distintas aproximaciones mediante estudios de campo y de laboratorio. En primer lugar se ha realizado un estudio a gran escala en campos comerciales de maíz durante varios años con el propósito de obtener datos suficientes que nos permitan evaluar la fauna habitual presente en campos de maíz Bt con respecto al no Bt. Una vez conocidas las especies de artrópodos depredadores más representativas del cultivo se han analizado sus niveles de exposición a la toxina durante distintos estados fenológicos del cultivo. Por último, se han llevado a cabo experimentos en el laboratorio en condiciones controladas para estudiar los efectos potenciales de la toxina adquirida a través de la presa sobre dos de las especies de artrópodos depredadores más abundantes Métodos para cuantificar las poblaciones de artrópodos en el cultivo del maíz Bt La elección del método más adecuado para estudiar los artrópodos presentes en el cultivo del maíz fue una de las primeras cuestiones que se plantearon al abordar el estudio 28

29 de los efectos del maíz Bt sobre la fauna no diana. El objetivo era conocer las poblaciones de artrópodos depredadores del cultivo de maíz, tanto especialistas como generalistas, de la planta y del suelo. Teniendo en cuenta las características del cultivo se estimó que la mejor forma de llevar a cabo este estudio era mediante el uso de trampas para los depredadores del suelo y del conteo directo de los artrópodos sobre la planta (Castañera et al., 2004). Las trampas de gravedad o caída ( pitfall ) consisten básicamente en un recipiente que se entierra, cuya abertura queda a ras de suelo, al que caen los artrópodos y del que no pueden salir (Figura 1a). Esta técnica de captura se halla ampliamente extendida en los estudios de ritmos de actividad estacionales, patrones de distribución espacial y comparación de abundancias relativas. Los datos procedentes de estas trampas se basan no solo en la densidad de la población, sino también en su actividad, así como en el comportamiento (en sentido amplio) de cada especie y su probabilidad de encontrar una trampa. Por ello, a la estima de abundancia relativa de una población obtenida con este método se la denomina actividad-densidad. Hasta el momento estas trampas son el método mejor conocido y más ampliamente utilizado en el estudio de poblaciones de artrópodos del suelo en los ecosistemas agrícolas (Duelli et al., 1999). El conteo visual de los artrópodos sobre las plantas es un método de muestreo absoluto mediante el cual se obtienen estimas precisas de la fauna existente sobre la planta. Para llevarlo a cabo es necesario elegir la unidad de muestreo adecuada a cada caso (árbol, rama, fruto, etc.). En el caso del maíz la unidad de muestreo era la planta completa. El muestreo se realiza observando detalladamente las hojas, el tallo, la inflorescencia masculina y las espatas que recubren la mazorca y anotando todos los artrópodos y su estado de desarrollo (adultos, pupas, ninfas o larvas) encontrados sobre cada planta (Figura 1b). Con ambas metodologías se obtienen datos que permiten cuantificar la fauna y compararla en parcelas de cultivo con distintas características (Bt vs. no Bt). Sin embargo, el estudio de comunidades de insectos basado solo en la abundancia puede dar lugar a imprecisiones, ya que la abundancia de artrópodos se puede ver afectada por otros muchos factores. Por ello es necesario estudiar otros índices, tales como la riqueza y la diversidad de especies, que han demostrado ser eficaces para su uso en la evaluación de cambios en la estructura de comunidades de insectos. El estudio de estos parámetros sólo es posible en el caso de conocer las especies que integran cada uno de los grupos encontrados. De 29

30 este modo sólo se llevó a cabo con los grupos de artrópodos del suelo más abundantes de los maizales del centro peninsular: arañas, carábidos y estafilínidos (De la Poza, 2004). Figura 1. Métodos de muestreo utilizados para determinar las especies de depredadores más abundantes en los maizales. a) Trampas de gravedad b) Conteo visual 3.3. Estudios de campo para determinar los posibles efectos del maíz Bt sobre los artrópodos depredadores El estudio de los efectos que las variedades transgénicas pueden tener sobre los depredadores presentes en el cultivo requiere estudios de campo para determinar los efectos a corto o medio plazo (Ortego et al., 2009). Con este fin nuestro grupo (CIB, CSIC) realizó simultáneamente un estudio coordinado con el grupo del Dr. Ramón Albajes de la UdL-IRTA, en parcelas comerciales y en dos localidades con distintas características agroecológicas: uno en la zona Centro (Madrid) y otro situado en el Valle del Ebro (Lérida), siguiendo la misma metodología. Se establecieron tres tratamientos: maíz Bt (variedad Compa CB ) y la variedad isogénica Dracma, con y sin el insecticida imidacloprid (Gaucho ) incorporado en su semilla. El estudio se llevó a cabo en parcelas de gran tamaño ( 0.6 ha) con tres repeticiones de cada tratamiento, dispuestas en bloques al azar. De esta forma se puede comparar el efecto de los tres sistemas de producción sobre la abundancia y diversidad de artrópodos (De la Poza et al., 2005). El ensayo de la zona Centro se realizó en un campo comercial en Estremera (Madrid), entre 2000 y Un ensayo similar se repitió en el año 2005 en los mismos campos con el fin de ver los efectos a medio plazo. Entre 2000 y 2002, la única variedad de maíz Bt cultivada en España fue Compa CB (evento Bt176), cuya concentración de toxina 30