CONFIGURACIÓN DE LOS SERES VIVOS GUIÓN DE PRÁCTICAS

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1 Prácticas - Configuración de los Seres Vivos 1 Universidad Miguel Hernández de Elche Facultad de Ciencias. Licenciatura en Ciencias Ambientales CONFIGURACIÓN DE LOS SERES VIVOS GUIÓN DE PRÁCTICAS Curso Alumno Apellidos: Nombre: Grupo: Ciencias Ambientales Curso

2 Prácticas - Configuración de los Seres Vivos 2 Práctica 1. El microscopio óptico. 1. Objetivo Aprender a usar correctamente el microscopio óptico compuesto, familiarizándose con sus componentes y con diferentes métodos de medición, mediante el estudio cualitativo y cuantitativo de distintas preparaciones microscópicas. 2. Introducción Desde su invención, el microscopio ha sido una herramienta útil en el desarrollo científico. Aunque las lentes de aumento han sido conocidas a lo largo de la historia, no fue hasta la llegada del moderno microscopio compuesto (s. XVII-XVIII) cuando este instrumento comenzó a ser aplicado al estudio biológico. Si para la mayoría de biólogos, el microscopio es una herramienta de trabajo importante, para los biólogos celulares es indispensable. El microscopio compuesto está formado por dos elementos; un sistema primario de lentes de aumento y un segundo sistema de lentes, similar a un telescopio. La luz es forzada a pasar a través de la muestra y es enfocada con los sistemas de lentes primarias y secundarias. Si reemplazados la fuente de luz por una fuente de electrones, el microscopio se convierte en un microscopio electrónico de transmisión. Si la luz es proyectada sobre la muestra y los sistemas de lentes captan la luz rebotada por la muestra el microscopio se convierte en un microscopio quirúrgico. Si son electrones los que son proyectados sobre la muestra, barriendo su superficie hablamos de un microscopio electrónico de barrido. La función de un microscopio es mejorar la resolución del ojo humano. El microscopio se usa para ampliar una imagen de un objeto de forma que podamos observar detalles que serían imposibles de observar a simple vista por el ojo humano. A causa de esta ampliación, la resolución se confunde a menudo con la magnificación o aumento que se refiere al tamaño de la imagen. En general, a mayor magnificación mayor resolución; aunque ésto no siempre es cierto. Hay limitaciones de carácter práctico en el diseño de las lentes que pueden resultar en un incremento de la magnificación sin incrementar la resolución. Considerando la figura 1.1, si una imagen de una célula es aumentada desde 10x a 45x, la imagen es más grande; pero no necesariamente más nítida. La imagen de la izquierda Ciencias Ambientales Curso

3 Prácticas - Configuración de los Seres Vivos 3 está aumentada sin mejorar la resolución, mientras que la imagen de la derecha tiene los mismos aumentos, pero la resolución ha mejorado. Cuando la imagen es aumentada 10 veces (desde 10x a 100x) es imposible usar la imagen de la izquierda; sin embargo, la imagen de la derecha nos da una información más detallada. Sin resolución la cantidad de detalles observables es fija y, a pesar de incrementar el tamaño de la imagen, no se observan más detalles. En este punto se alcanza el límite de resolución o poder de resolución del objetivo. Esta propiedad de los objetivos viene fijada por su diseño y construcción. Para cambiar la resolución, la única solución a menudo es usar objetivos diferentes. La razón de la dicotomía entre magnificación y poder de resolución es la capacidad del ojo humano para diferenciar entre dos objetos próximos. Es necesario que dos objetos estén separados 0,1 mm, aproximadamente, cuando los mantenemos a 25 cm de los ojos para poder detectarlos como objetos diferentes. Si están a menos de 0,1 mm los percibimos como un único objeto. Si los dos objetos están separados 0,01 mm no podremos discriminarlos como dos objetos; a menos que aumentemos su imagen por 10x, con lo que hemos alterado eficazmente nuestra capacidad de resolución desde 0,1 mm a 0,01 mm o, inversamente, nuestro poder de resolución a aumentado en un factor de 10. Figura 1.1. Magnificación frente a resolución. Sólo magnificación Magnificación y resolución Ciencias Ambientales Curso

4 Prácticas - Configuración de los Seres Vivos 4 Así pues, una lente puede aumentar una imagen sin incrementar la resolución. Varios artefactos pueden ser inherentes al diseño de las lentes, provocando que el objeto aparezca con los límites desdibujados. Por lo que, incluso si aparecen separados 0,1 mm, los límites están tan desdibujados que perdemos la capacidad de diferenciar ambos objetos. Al igual que nos sucede al observar los optotipos oftalmológicos; podemos intuir las letras al incrementar el tamaño pero somos incapaces de identificarlas correctamente. Generalmente, se habla de la idoneidad de los objetivos microscópicos en términos de su magnificación o aumentos; mientras que el valor más importante es su resolución. Todos los microscopios poseen un objetivo que puede aumentar por 40x el tamaño normal de una muestra; pero sólo un objetivo de buena calidad permite observar correctamente una muestra. Como se ha mencionado el valor de la resolución puede ser determinado de dos formas: 1. La distancia más pequeña entre dos puntos, que permite observarlos como distintos. Con esta medida, conforme disminuye la distancia aumenta la resolución. Hay una correlación inversa entre el límite de resolución (Fórmula de Abbe) y lo que de hecho se resuelve: Límite de resolución = (0,61 λ)/an 2. Para cambiar esta fórmula a una correlación directa, se necesita sólo el reciproco del límite de resolución. El poder de resolución es inversamente reciproca al límite de resolución. Así, la resolución aumenta conforme aumenta la distancia. Consecuentemente, en la mayoría de microscopios hoy en día usan la resolución, en lugar del límite de resolución, para indicar la calidad de sus objetivos. Poder de resolución = AN/(0,61 λ) El poder de resolución de los objetivos es una característica de sus propiedades físicas y de la longitud de onda de la luz que pasa a través de sus lentes. Las propiedades físicas se resumen en un valor conocido como apertura numérica (AN), mientras que la longitud de onda es determinada por el color de la luz utilizada. Apertura numérica (AN) = n sen θ Figura 1.2. Apertura numérica e índice de refracción. Ciencias Ambientales Curso

5 Prácticas - Configuración de los Seres Vivos 5 La apertura numérica de una lente depende de dos parámetros. Del ángulo de incidencia de la luz en la lente y del índice de refracción del material óptico de fabricación de la lente. La mitad del ángulo del cono de luz incidente se designa por el símbolo θ. La mitad del ángulo de incidencia de la luz se usa para calcular el ángulo de luz subtendida relativa al eje óptico del microscopio. El ángulo de incidencia de la luz y, por tanto, θ pueden ser modificado por el condensador situado debajo de la platina. Si el condensador es móvil, el ángulo de incidencia puede variarse; así, conforme el condensador está más cerca del objeto más grande es el ángulo de incidencia de la luz. Traduciéndose en una mejora de la resolución del microscopio. Figura 1.3. Apertura numérica y ángulo de incidencia de la luz. Las propiedades refractivas de un objetivo se resumen en un valor conocido como índice de refracción (IR ó n). El índice de refracción está en función de la distorsión de la luz al pasar del aire a la lente y viceversa. En un microscopio, el material de fabricación de la lente está especialmente formulado para incrementar su índice de refracción; sin embargo, una vez fabricada esta propiedad no puede ser cambiada. Aunque el medio alrededor del objetivo si puede ser modificado; sustituyendo el aire entre el objetivo y el portaobjetos por aceite de inmersión, de índice de refracción superior al del aire. Ciencias Ambientales Curso

6 Prácticas - Configuración de los Seres Vivos 6 Considerando todo lo anterior, en la práctica la máxima resolución se puede optimizar de tres formas: a) El método más fácil es aumentar el ángulo de la luz incidente, alterando la posición y/o diseño del condensador, situado debajo de la platina. b) El índice de refracción puede ser mejorado mediante el uso de lentes especialmente fabricadas y/o mediante el control del medio a través del cual pasa la luz, usando aceite de inmersión en objetivos diseñados para este propósito. c) Disminuir la longitud de onda de la luz usada. Por razones prácticas, la modificación de la longitud de onda tiene mayor efecto sobre la resolución del microscopio que cambios en el ángulo de incidencia de la luz (θ) o el índice de refracción (n). En microscopía óptica de campo claro es conveniente trabajar en el rango de luz visible y la longitud de onda más corta del espectro de luz visible es el azul. Por lo que, los microscopios incorporan un filtro azul en su diseño; que se conoce como filtro de luz día, generalmente. Aberraciones Las distorsiones o aberraciones cromáticas y esféricas son inherentes al diseño de las lentes; debido a que las lentes son esféricas y proyectan una imagen esférica. Sin embargo, la teoría óptica se basa en imágenes planas. Además, las diferentes longitudes de onda de luz son refractadas distintamente; la imagen esférica se distorsiona incluso en múltiples imágenes, debido a que cada longitud de onda forma una imagen separada. Una lente que está corregida para producir campos planos en vez de curvos se conoce como lente plan (plana), mientras que una lente corregida para campo plano y aberración cromática se denomina lente plan achromat (plana acromática). Si la lente está corregida para aberraciones cromáticas para el rojo y azul, mientras que la corrección esférica es sólo para el verde, es una lente achromat (acromática). Angulo de incidencia Aunque el ángulo θ puede ser alterado, existe un límite teórico (180º) a este ángulo para el paso de luz a la lente. Para cada objetivo hay una posición idónea del condensador en la que se presenta la luz al objetivo con un ángulo apropiado, permitiendo un máximo de intensidad de luz; mientras mantiene θ tan grande como sea posible. En los microscopios buenos se puede ver el diafragma del condensador en el campo de luz y permiten un ajuste preciso (vertical y horizontal) del condensador a su posición ideal. El diafragma de iris se usa para corregir las aberraciones esféricas de las lentes y debe ser ajustado para cada objetivo. No deben ser usados para controlar la intensidad de luz a menos que la resolución no sea importante para el observador. Ciencias Ambientales Curso

7 Prácticas - Configuración de los Seres Vivos 7 Alineación Un uso correcto de un microscopio requiere que la óptica y la fuente de luz estén correctamente alineadas en el eje óptico. Todas las correcciones de aberraciones dependen de una adecuada alineación del microscopio. Generalmente, se usan dos técnicas para alinear el microscopio: a) La primera se conoce como iluminación crítica. En este proceso una imagen de la fuente de luz (filamento de la lámpara) es proyectada en el plano del objeto, superponiéndose la imagen de la fuente de luz en el objeto. Sin embargo, tiene la desventaja de que exige el uso de una fuente de luz uniforme plana; lo que realmente no es posible con el filamento de una lámpara de tungsteno. b) El segundo procedimiento de alineación es conocido como iluminación Koehler y es el más común. En este procedimiento, una imagen del diafragma de campo se proyecta en el plano del objeto. Este procedimiento requiere un condensador de campo equipado con un diafragma de iris móvil (o centrable). Figura 1.4. Iluminación Koehler (August Koehler, 1893). Ciencias Ambientales Curso

8 Prácticas - Configuración de los Seres Vivos 8 Ejercicio 1. El microscopio óptico de campo claro. 1. Introducción El microscopio óptico compuesto es un instrumento que permite observar objetos no visibles a simple vista mediante un sistema óptico de lentes, que al ser atravesadas por la imagen de un objeto la amplifican. - Partes del microscopio En un microscopio óptico se distinguen una parte mecánica y otra óptica: a) La parte mecánica consta de las siguientes piezas: Pie de soporte o estativo: alberga la fuente de iluminación. Brazo: continuación del pie donde están insertadas el resto de piezas. Tubo: cilindro hueco por donde circulan los rayos luminosos. En la parte inferior tiene un revolver con los sistemas de lentes, llamados objetivos, y en la superior porta la lente llamada ocular. Platina: superficie horizontal para colocar la preparación microscópica. Esta se sujeta mediante una pinza, y puede moverse sobre la platina mediante un carro accionado por tornillos, en un plano inferior. Cualquier punto de la preparación puede ser fijado por el observador, tomando sus coordenadas con los nonios que porta el carro. La platina puede desplazarse en sentido vertical gracias a dos pares de tornillos situados a derecha e izquierda sobre el brazo: los tornillos macrométricos, que provocan desplazamientos rápidos, y los micrométricos, que mueven la platina muy lentamente. Mediante el desplazamiento de la platina se consigue el enfoque de la preparación. b) La parte óptica del microscopio óptico se compone de: Ocular: sistema de lentes convergentes situado en la parte superior del tubo. Objetivos: son tubos que albergan sistemas de lentes convergentes que proporcionan aumentos hasta 100x. Los objetivos están montados sobre una pieza base, llamada revolver, que permite intercambiarlos sobre la preparación. Cada objetivo lleva impresas sus características ópticas (aumentos, apertura numérica, etc.). Ciencias Ambientales Curso

9 Prácticas - Configuración de los Seres Vivos 9 Condensador: es un sistema de lentes convergentes situado inmediatamente por debajo de la platina (en nuestro caso, es fijo y se desplaza junto con la platina). Su función es concentrar los rayos luminosos sobre la preparación. Diafragma: palanca montada en la misma pieza del condensador, que regula la entrada de luz a éste y a la preparación. Al igual que en las cámaras fotográficas, un diafragma abierto proporciona más luz, pero menor profundidad de campo (nitidez del enfoque a diferentes niveles horizontales de la preparación). Fuente luminosa: es una lámpara de tungsteno, montada en el interior del pie. Figura Componentes del microscopio óptico. Ciencias Ambientales Curso

10 Prácticas - Configuración de los Seres Vivos 10 - Principios de magnificación El principio de magnificación de un microscopio consiste en dos sistemas de lentes convexas que se combinan apropiadamente para magnificar las muestras. Junto a la muestra AB, un sistema de lentes convexas (Lo), llamado objetivo, se usa para magnificar de 1 a 100 veces y crear una imagen real A B. Junto al ojo un sistema de lentes llamado ocular es usado para magnificar de 5 a 20 veces y crear una imagen virtual A B a una distancia de visión nítida (aproximadamente a 250 mm del ojo). Es esta imagen aumentada A B la que vemos durante la observación microscópica (Figura 1.1.2). Figura Esquema óptico del microscopio. - Características ópticas del microscopio Aumento total (M): Es el producto de los aumentos del objetivo por los del ocular. Puede obtenerse un rango de aumentos variable. Se calcula como: M = M objetivo x M ocular (x M i ) Donde: M objetivo = aumento del objetivo. M ocular = aumento de los oculares (indicado en los oculares). M i = aumentos intermedios si corresponden (por defectos es 1) Ciencias Ambientales Curso

11 Prácticas - Configuración de los Seres Vivos 11 Apertura numérica (AN): Determina la eficiencia del condensador y el objetivo. Cuanto mayor es la AN, las imágenes resultan de mayor calidad. Se calcula como: Apertura numérica (AN) = n sen θ Donde: n = índice de refracción del medio entre el objetivo y la preparación. θ = la mitad del ángulo máximo con el que penetra en el objetivo el cono de luz, desde un punto enfocado en el eje óptico. Límite de resolución: Es la distancia mínima real que tiene que haber entre dos puntos para que el microscopio pueda mostrar dichos puntos como distintos y separados. Se calcula mediante la fórmula de Abbe: Límite de resolución = (0,61 λ)/an Donde: λ = longitud de onda de la luz incidente (400 nm para la luz azul). AN = apertura numérica. El poder de resolución del ojo humano es aproximadamente 70 µm. Distancia de trabajo: es el espacio entre el objetivo y la cara superior de la preparación, cuando la imagen está enfocada. Cuando mayor es el aumento del objetivo menor es la distancia de trabajo. Profundidad de campo: es el espesor de muestra de la preparación microscópica que aparece nítido por encima y por debajo del plano de enfoque. Cuanto mayor es la AN del objetivo (ó mayor es su aumento) menor es la profundidad de campo. 2. Material Microscopio binocular. Portaobjetos con preparaciones microscópicas. 3. Procedimiento

12 Prácticas - Configuración de los Seres Vivos Comprobar la magnificación y la apertura numérica de los objetivos que están en el revolver del microscopio y la magnificación de las lentes oculares. Estos valores están impresos en cada uno de los objetivos (Figura 1.1.3) y de los oculares. En la tabla anotar los valores de magnificación para cada objetivo y ocular y la AN para cada objetivo y el condensador. Calcular la magnificación total y el límite de resolución para cada objetivo y el límite de resolución máximo del microscopio usando aceite de inmersión (AN = 1,5). Asumir que la luz que atraviesa la muestra tiene una longitud de onda de 400 nm. Figura Características de los objetivos. Tabla Magnificación Apertura Numérica Aumento Total Límite de Resolución Magnificación de los oculares: Apertura numérica del condensador: Indica el objetivo de mayor AN: A.N. para una interfase de aire: 1,0 A.N para una interfase de aceite 1,5 Límite de resolución máximo del microscopio: (0,61xλ)/AN (µm)

13 Prácticas - Configuración de los Seres Vivos Girar el revolver porta objetivos hasta que el objetivo de menor aumento esté en posición de observación. Coger una preparación microscópica, colocarla en la platina asegurándose que queda correctamente fijada, y con el cubreobjetos hacia arriba. Encender el microscopio ajustar la intensidad de luz con el potenciómetro a un nivel confortable para el observador. Nunca controlar la intensidad de luz con el condensador, asegurarse que el condensador esté abierto y en posición correcta. 3. Ajustar los oculares a la posición neutra de dioptrías ( 0 ). Ajustar los oculares a la distancia interpupilar y dioptrías del observador. La mayoría de microscopios están equipados con un tirador entre los oculares para su ajuste y sólo se requiere empujar o tirar directamente de los oculares juntos o individualmente. Mover los oculares (derecha e izquierda) hasta ver un campo de visión uniforme. 4. Enfocar el microscopio sobre cualquier objeto dentro del campo de visión: Localizar un punto suficientemente contrastable en el centro del campo de visión y cerrar el ojo izquierdo. Usando los tornillos macro- y micrométrico enfocar hasta obtener una imagen nítida con el ojo derecho solamente. Ahora cerrar el ojo derecho y ajustar el foco del ocular izquierdo girando el dioptrio situado en él. No reajustar el foco del ojo izquierdo con los enfoques macrométrico y micrométrico, usar el anillo de ajuste del ocular. 5. Seguidamente todos los usos del microscopio sólo requerirán los ajustes de enfoque macrométrico y micrométrico. Por supuesto, será necesario y se deberá comprobar y reajustar el microscopio al inicio de cada sesión. 6. Comenzar siempre enfocando la preparación por el objetivo de menor aumento (4x). Incluso si se va a usar el objetivo de mayor aumento (40x ó 100x). Es más eficaz comenzar con el objetivo de menor aumento e ir aumentando gradualmente la magnificación del objetivo, afinando el enfoque de la muestra con cada uno de ellos. Si los objetivos son parafocales, una preparación microscópica enfocada con un objetivo también estará, prácticamente, enfocada con el resto de objetivos y sólo se tendrá que corregir levemente el enfoque micrométrico. 7. Manipular el control macrométrico de enfoque hasta ver la preparación enfocada. Mover los tornillos de desplazamiento horizontal (XY) de la platina, hasta situar la preparación en la región de estudio deseada. Entonces, centrar la preparación y enfocar cuidadosamente, usando los tornillos de enfoque macrométrico y micrométrico, partiendo del objetivo de menor aumento hasta el de mayor aumento, realizando el estudio de la muestra con cada

14 Prácticas - Configuración de los Seres Vivos 14 una de las magnificaciones. Usar el micrométrico para el ajuste fino y enfocar al máximo la imagen. 8. Durante el uso del microscopio, una mano debe de permanecer sobre el micrométrico reajustando el enfoque constantemente y la otra mano se usa para dirigir los movimientos de la platina. 9. Dibujar las imágenes que se observan con diferentes aumentos del microscopio, para cada preparación microscópica.

15 Prácticas - Configuración de los Seres Vivos 15 Práctica 2. Microanálisis estereológico: Estudio de suspensiones celulares Habitualmente los tejidos de organismos se pueden disociar en sus componentes celulares, a partir de los cuales pueden purificarse diferentes tipos celulares individuales, los cuales pueden utilizarse para su análisis bioquímico o para establecer cultivos celulares. Frecuentemente, es necesario conocer el número exacto de células en suspensión que hay en un medio biológico, para lo que se emplean técnicas de recuento celular. Ejercicio 1. Preparación de extensiones celulares y recuento celular 1. Introducción Se entiende por extensión o frotis celular, a la formación de una fina película de células sobre un portaobjetos, de tal manera que las células no se superpongan entre sí. Se utilizan para la visualización de células en suspensión (p. ej., células sanguíneas, células en suspensión, etc.), para lo cual tras la extensión de la muestra procederemos a su tinción; entendiendo por tal, la coloración diferencial de las distintas células presentes en la suspensión celular. Un diagnóstico válido no puede ser establecido más que sobre frotis perfectamente extendidos y teñidos. Las preparaciones de extensiones celulares se utilizan fundamentalmente para el estudio morfológico de las células y la obtención de fórmulas de recuento celular. 2. Fundamento El uso de suspensiones celulares de sangre entera permite observar de forma rápida, fácil, económica y nítida diferentes tipos celulares con características morfológicas peculiares y con una notable heterogeneidad nuclear y citoplásmica. Estos tipos celulares se ponen fácilmente de manifiesto con técnicas histológicas de microscopía óptica, que por su metodología y sistemática suponen un entrenamiento ideal para el estudio de suspensiones

16 Prácticas - Configuración de los Seres Vivos 16 celulares de cualquier tipo; ya que raramente se trabaja con suspensiones celulares con una diversidad celular tan elevada. Para teñir las extensiones de sangre se emplean compuestos derivados de anilina, por los que tienen una gran afinidad los distintos orgánulos de las células sanguíneas. Según la naturaleza química de estos colorantes, distinguimos tres tipos: ácidos, básicos y neutros. Los colorantes ácidos tiñen estructuras celulares básicas, tales como la hemoglobina, los gránulos de los eosinófilos, etc.; los elementos celulares que se tiñen se denominan acidófilos o eosinófilos (un colorante ácido típico es la eosina). Los colorantes básicos por el contrario, tiñen estructuras celulares ácidas, tales como el ADN nuclear y el ARN; denominándose las estructuras asi teñidas basófilas (entre los más utilizados está el azul de metileno). Finalmente, los colorantes neutros son los más utilizados en hematología, están formados por la combinación de un colorante ácido y otro básico y su afinidad tintorial es el resultado de la combinación de los anteriores. La sangre es un tejido que posee diversas células suspendidas en un medio fluido denominado plasma. Las células sanguíneas son fundamentalmente de tres tipos: Células rojas, eritrocitos o hematíes, células blancas o leucocitos y plaquetas o trombocitos. Que con microscopía óptica muestran la siguiente apariencia: Eritrocitos: Esta célula anucleada (en la mayoría de mamíferos) se tiñen de color rosado debido a su alto contenido en hemoglobina. La zona central pálida, escasamente teñida, es el resultado de su forma de disco biconcavo, poco corriente. Es el componente celular mayoritario de la sangre, 4-6 millones/ml. Neutrófilos: Son el tipo de leucocito más frecuente en sangre. El detalle más característico es su núcleo multilobulado. En los neutrófilos maduros existen generalmente 5 lóbulos conectados por finas bandas de materia nuclear, pero en los neutrófilos inmaduros el núcleo generalmente es poco lobulado. En los neutrófilos de las hembras, el cromosoma X inactivo o cuerpo de Barr aparece formando un pequeño apéndice en forma de palillo de tambor, condensado, en uno de los lóbulos del núcleo. Se ve en el 3% de los neutrófilos de las hembras. El citoplasma de los neutrófilos está ligeramente punteado con gránulos de color púrpura que se denominan gránulos azurófilos, que se corresponden con lisosomas primarios grandes.

17 Prácticas - Configuración de los Seres Vivos 17 Eosinófilos: Son menos frecuentes que los neutrófilos. Los eosinófilos poseen, como dato morfológico característico, un núcleo bilobulado y un citoplasma repleto de granos grandes, eosinófilos (de color rosado oscuro) y de tamaño uniforme. Monocitos: Son los elementos mayores de todas las células de la serie blanca. Se caracterizan porque poseen un gran núcleo, situado excéntricamente, que se tiñe menos intensamente que los otros leucocitos. El núcleo generalmente es dentado haciéndose más dentado a medida que la célula madura y adopta finalmente una morfología de herradura o aspecto bilobulado. El amplio citoplasma está ocupado por pequeños lisosomas que con microscopía óptica, le dan el típico aspecto de vidrio mate. Basófilos: Son los leucocitos menos frecuentes. En general el núcleo bilobulado está eclipsado por numerosos gránulos grandes, intensamente basófilos (azul oscuro). Linfocitos: Son las células más pequeñas de la serie blanca, presentando un tamaño ligeramente mayor que los hematíes. Se caracterizan porque tienen un núcleo redondeado, muy teñido, y un pequeño anillo de citoplasma agranular, ligeramente basófilo. La cantidad de citoplasma varía según el estado de actividad de la célula; así, se observan linfocitos pequeños, medianos y grandes. Plaquetas: Son pequeñas células anucleadas (en el hombre), que se forman en la médula ósea a partir de los megacariocitos, su número varía de /ml. Son discos biconvexos redondos u ovales. En los frotis sanguíneos suelen aparecer agrupadas y el citoplasma teñido de púrpura, tiene aspecto granular debido a la gran cantidad de orgánulos que se disponen en el centro de la célula, el citoplasma periférico se tiñe muy poco y por eso es apenas visible. 3. Material Microscopio. Suspensión celular de sangre entera con anticoagulante. Portaobjetos. Extensor o portaobjetos esmerilado. Cubreobjetos. Cubetas de tinción. Capilares. Metanol. Colorante de tinción.

18 Prácticas - Configuración de los Seres Vivos 18 Medio de montaje. Papel de filtro. 4. Procedimiento Se distinguen tres etapas: A. Preparación de los portaobjetos Antes de su empleo, los portaobjetos deben ser tratados para eliminar posibles impurezas de su proceso de fabricación y manipulación (desengrasado) aplicando el siguiente tratamiento: 1. Lavar con agua y detergente. 2. Una vez aclarado con agua corriente, se depositará en un recipiente que contenga una de las tres soluciones: - Mezcla sulfocrómica. - Etanol. - Etanol-eter (1:1). 3. Se mantienen minutos, tras lo cual, si hemos usado mezcla sulfocrómica los aclararemos con agua destilada, mientras que con las otras simplemente dejaremos evaporar el disolvente. 4. Finalmente, los secaremos con papel de filtro o en estufa. B. Confección de las extensiones 1. Colocamos los portaobjetos sobre una superficie plana y con ayuda de un capilar depositamos una gota de suspensión celular en un extremo (aproximadamente a 0,5 cm). 2. Con los dedos pulgar e índice de la mano izquierda, se sostiene los dos ángulos de la parte izquierda del portaobjetos. Con la mano derecha, se coge el portaobjetos esmerilado, colocamos el pulgar en uno de los bordes y el índice sobre el otro. Situar este último portaobjetos esmerilado delante de la gota de sangre, de forma que ambos portaobjetos formen un ángulo de 45º aproximadamente. El grosor de la preparación depende del ángulo (a menor ángulo menor espesor, y viceversa). El portaobjetos esmerilado nunca debe pasar por encima de la muestra al hacer la extensión.

19 Prácticas - Configuración de los Seres Vivos 19 Figura 2.1. Esquema de la realización de un frotis sanguíneo por el método de los dos portaobjetos. La flecha indica la dirección en la que debe deslizarse el portaobjetos esmerilado. Punto de colocación de la muestra. 3. Se hace retroceder el portaobjetos esmerilado en dirección a la gota de la suspensión celular. Tan pronto como ambos entren en contacto, la sangre comenzará a extenderse sobre el borde del portaobjetos esmerilado. 4. Cuando la sangre, por capilaridad, llega hasta aproximadamente 2 mm de los bordes del portaobjetos esmerilado, efectuar un movimiento suave y rápido de éste sobre toda la longitud del portaobjetos horizontal. 5. Dejar el frotis secar a temperatura ambiente y en posición horizontal durante un mínimo de 10 minutos. 6. Fijar las extensiones introduciendo el portaobjetos en alcohol metílico durante 5 minutos y dejar secar a temperatura ambiente. 7. Teñir durante 30 minutos con una solución de Giemsa al 10% en agua destilada (preservar de la luz). 8. Lavar las extensiones celulares con abundante agua destilada. 9. Dejar secar a temperatura ambiente y montar con medio de montaje. C. Examen de la extensión celular Como es lógico el examen microscópico variará dependiendo de la muestra procesada. Seguidamente, describiremos el examen de una extensión sanguínea, por ser un tipo de muestra que con frecuencia se tiene que realizar y de gran aplicación en diferentes áreas

20 Prácticas - Configuración de los Seres Vivos 20 científicas. Además, sirve de referencia para el estudio microscópico de otros tipos de suspensiones celulares; por estar normalizada su realización y examen microscópico. 1. En primer lugar examinaremos la preparación mediante el objetivo de 4x ó 10x. Las células deben estar homogéneamente distribuidas en el frotis, de lo contrario lo desecharemos. 2. Seguidamente pasamos a examinar la muestra a 40x. Realizaremos un recorrido por la preparación tal y como se indica en la figura 2.2 dentro de las zonas ideales de la extensión; identificando correctamente los distintos tipos celulares que aparecen en la preparación, con ayuda de la descripción morfológica (ver introducción). Estudiando con detalle su morfología. Figura 2.2. Esquema de un frotis sanguíneo de las diferentes áreas que lo componen y la distribución celular de las mismas. La líneas punteada indica la dirección a seguir en el recuento diferencial de leucocitos (n=100). Origen Zona de linfocitos Zona de neutrófilos y monocitos Sentido de la extensión Zona ideal de recuento 3. Una vez identificados los distintos tipos celulares proceder a realizar la fórmula leucocitaria de la muestra. Esta fórmula consiste en un recuento diferencial de los leucocitos o células de la serie blanca de la sangre. Para ello realizar un recuento de 100 leucocitos, moviéndonos por la preparación, buscar en la región ideal del frotis (tal y como se indica en la figura 2.2), identificar cada uno de los tipos y anotar su número. Para poder determinar el porcentaje de cada tipo de leucocito en el total de la muestra. Indicando su porcentaje en la tabla 2.1. Suponiendo que la población total de leucocitos de la muestra analizada es de leucocitos/ml. Cuántas células/ml de cada unos de los tipos de leucocitos hay en la muestra?. Indicar los resultados en la tabla 2.1.

21 Prácticas - Configuración de los Seres Vivos Responder a las siguientes preguntas: a. Qué función tiene el baño previo de metanol a la tinción con Giemsa en las extensiones de sangre? b. Las estructuras basófilas son de naturaleza ácida o básica? c. Qué función tiene el mantener los portaobjetos en un baño de etanol-éter antes de usarlos para realizar extensiones celulares? d. Qué es el cuerpo o corpúsculo de Barr? e. A que orgánulo corresponde la ligera granulación púrpura citoplásmica de los neutrófilos? f. Ordena de menor a mayor espesor los siguientes frotis según el ángulo de inclinación aplicado al portaobjetos esmerilado con el que se hizo la extensión: a) 45º; b) 30º; c) 55º; d) 35º; e) 60º. g. En la raza humana en estado de salud normal los eritrocitos son anucleados. Existen especies con eritrocitos nucleados, en caso afirmativo enunciarlas?. Si existen, que significados funcional y/o evolutivo puede tener la presencia de núcleo en los eritrocitos?

22 Prácticas - Configuración de los Seres Vivos 22 Tabla 2.1. Esquema de los distintos tipos celulares característicos de sangre humana. Tipos celulares Tamaño (µm) Recuento leucocitario Célula s/ml Plaquetas 2-3 Monocitos Linfocitos 7-8 Basófilos 9-10 Eosinófilos Neutrófilos Eritrocitos 6-8