k 11 N. de publicación: ES k 21 Número de solicitud: k 51 Int. Cl. 5 : C12N 7/02 k 74 Agente: Isern Jara, Nuria

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1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA k 11 N. de publicación: ES k 21 Número de solicitud: k 1 Int. Cl. : C12N 7/02 C12N 1/ k 12 PATENTEDEINVENCION B1 k 22 Fecha de presentación: k 43 Fecha de publicación de la solicitud: Fecha de concesión: k 4 Fecha de anuncio de la concesión: k 4 Fecha de publicación del folleto de patente: k Titular/es: Fernando Javier Bartolomé Nebrda C/ Bejar N 1 Madrid, ES Vicente Carreño García, Inmaculada Castillo Aguilar y kjuan Antonio Quiroga Estévez 72 Inventor/es: Bartolomé Nebrda, Fernando Javier; Carreño García, Vicente; Castillo Aguilar, Inmaculada y Quiroga Estévez, Juan Antonio k 74 Agente: Isern Jara, Nuria k 4 Título: Procedimiento para el aislamiento y clonaje de cdnas derivados del virus C de la hepatitis. k 7 Resumen: Procedimiento para el aislamiento y clonaje de cd- NAs derivados del virus C de la hepatitis. Procedimiento para el aislamiento y clonaje de cd- NAs derivados del virus C de la hepatitis, a partir de suero y tejidos humanos de pacientes de esta infección. Una parte del suero se mezcla con una solución de isotiacianato de guanidina, citrato sócido, 2 mercaptoetano, sarkosyl, fenol, una cantidad de trna y cloroformo. Tras incubar la mezcla en hielo, se centrifuga y se extrae la fase acuosa con cloroformo. Se trata el genoma viral con un inhibidor de R-Nasas y se precipita con isopropanol. Los ácidos nucléicos centrifugados se desnaturalezan por calor, y se utilizan como molde junto con oligonucleótidos sintéticos, para obtener el cdna sintético. Este se amplifica, se fracciona y se clonan los fragmentos en el vector pcr00, obteniéndose plásmidos recombinantes, que se propagan en una cepa bacteriana, para obtener los clones positivos. Aviso: Se puede realizar la consulta prevista por el art LP. Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 DESCRIPCION 1 2 Se describe un método para el aislamiento y clonaje de cdnas derivados del virus C de la hepatitis (VCH) a partir de suero y tejidos humanos de pacientes afectos de hepatitis No-A. No-B. La comparación de las secuencias de los cdnas obtenidos demuetra que se tiene homologia sustancial con los virus A, B y D de la hepatitis. La comparación de estos cdnas con las secuencias descritas del VCH aislados en Estados Unidos y Japón muestran una diferencia alrededor del % con el virus aislado en Estados Unidos y de aproximadamente un 1% con el aislado en Japón. Las secuencias cdnas aisladas por este procedimiento, son utiles para el diseño de sondas y para la síntesis de polipéptidos que pueden usarse en inmuno-ensayos para el diagnóstico, control y seguimiento terapéutico y desarrollos de vacunas de la hepatitis por virus C. Los polipéptidos codificados por las secuencias cdnas pueden usarse también para producir y purificar anticuerpos frente a antígenos del VCH, así como en inmunoensayos para detectar antígenos del virus C. Estos anticuerpos pueden usarse en la profilaxis de la infección. La hepatitis C es una enfermedad que progresa en la mitad de los casos a cronicidad y es agresiva a largo plazo ya que en el % de los casos crónicos se desarolla una cirrosis hepática. Uno de los virus responsables de esta enfermedad fue aislado en Estados Unidos a partir de suero e hígado de chimpancé que habia sido previamente inoculado con un suero procedente de un paciente afecto de hepatitis No-A, No-B (1). Posteriormente, se ha aislado en Japón un virus relacionado (2, 3). Aquí se describe un procedimiento para aislar secuencias derivadas del genoma del virus C, a partir de suero y tejido humano. Todas las investigaciones se han realizado de acuerdo con la declaración de Helsinki para experimentar en humanos Se utiliza suero procedente de pacientes diagnosticados de hepatitis N0-A, No-B Procedimiento A 0 µl de suero se añaden 0 µl de la solución compuesta por 4 M isotiocianato de guanidina, 2 mm citrato sódico, 0 mm 2-mercaptoetanol, 0.% sarkosyl, 0 µl defenol:dh 2 O (1:1), 1 µg/ml trna y 0 µl de cloroformo, incubándose la mezcla 1 minutos en hielo. Se centrifuga a xg, 1 minutos a 4 C y se reextrae la fase acuosa con igual volumen de cloroformo en las mismas condiciones. El genoma viral se trata con 1 U de inhibidor de RNasas aislado de placenta humana y se precipita con un volumen igual de isopropanol a -70 C durante toda la noche. Los ácidos nuleicos obtenidos se recuperan por centrifugación y se disuelven en µl deh 2 O bidestilada y estéril. El ácido nucléico obtenido se desnaturaliza por calor a 94 C durante minutos. El cdna se sintetiza utilizando el ácido nucléico desnaturalizado como molde y un oligonucleotido sintético durante la sintesis de la primera cadena del cdna mediante una transcriptasa en reverso (4). Un ejemplo de los oligonucleotidos sintéticos que se pueden utilizar en este paso es el siguiente: TAC CTA GTC ATA GCC TCC GTG AAG 3. El cdna se amplifica mediante la técnica conocida como reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (), utilizando oligonucleotidos sintéticos. Las condiciones de la PCR pueden variar entre 3 y 0 ciclos, con una duración cada ciclo entre 1 segundo y 2 horas a temperaturas que pueden variar entre 4 Cy 1 C. Un ejemplo de los oligonucleotidos y de las condiciones que se pueden utilizar para la PCR es: Oligonucleotidos sintéticos: ATG GGG CAA AGG ACG TCC G 3 TAC CTA GTC ATA GCC TCC GTG AAG 3 2 ciclos de PCR consistente cada uno en: 36 segundos a 94 C 42 segundos a 0 C 180 segundos a 68 C Los cdnas de doble cadena amplificados se fraccionan de acuerdo a su tamaño mediante electroforesis en gel de agarosa al 1.%. Los fragmentos de cdna se aislan del gel mediante protocolos estándar 2

3 descritos en la literatura (4). Estos fragmentos se clonan en el vector pcr00 que forma parte del kit TA Clonign Kit comercializado por Investrogen Corporation (San Diego, CA, EE.UU.). Los procedimientos para el clonaje son los recomendados por la casa suministradora y están reflejados en la literatura (4). Los plásmidos recombinantes se propagaron en una cepa bacteriana apropiada. Tras la transformación de las bacterias, las colonias de células que llevan los plásmidos recombinantes se identifican siguiendo los métodos convencionales descritos en la literatura (4). Siguiendo el procedimiento descrito anteriormente, se han aislado 4 clones positivos a los que se ha denominado: c4, cl3, clyc Para caracterizar estos clones se secuencian mediante la técnica de terminación de la cadena por incorporación de dideoxinucleotidos (6), utilizando los reactivos suministrados en el Kit Sequenase Version 2.0 comercializado por United States Biochemical (Cleveland, OH, EE.UU.). Las secuencias obtenidas se detallan en la lista de secuencias incluida. El análisis y comparación de las secuencias descritas en la lista de secuencias con las variantes del VCH aisladas en EE.UU. y Japón se realiza mediante el programa de ordenador PC/GENE (IntelliGenitcs, Ginebra, Suiza). Estos análisis revelas una diferencia de alrededor de % con la variante de Estados Unidos y de aproximadamente un 1% con la variante japonesa. Referencias 1. Choo, Q-L y col. Science 1989; 244: Takeuchi, K. y col. Gene 1990; 91: Kato, N. y col. PNAS USA 1990; 87: Maniatis, T. y col. Molecular Cloring: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, Saiki, RK. y col. Science 198; Sanger F y col. PNAS USA 1977; 74:

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6 REIVINDICACIONES Procedimiento para el aislamiento y clonaje de cdnas derivados del virus C de la hepatitis (VCH), caracterizado porque se parte de suero humano, añadiendo al suero una solución compuesta por isotiacianato de guanidina; citrato sódico 2-merceptoetanol, sarkosyl, solución acusa de fenol, una cantidad de trna y cloroformo, se incuba la mezcla en hielo, se centrifuga y se extrae la fase acuosa con cloroformo, tratando el genoma viral con un inhibidor de RNasas que se precipita con isopropanol, recuperando los ácidos nucléicos por centrifugación, los cuales se disuelven en agua bidestilada y estéril, y se desnaturalizan por calor, utilizando el ácido nucléico desnaturalizado como molde y un oligonucleótido sintético para obtener de cdna sintético, el cual se amplifica, se fracciona y se aislan los fragmentos de cdna mediante técnicas estándar, clonando estos fragmentos en el vector pcr00, obteniéndose plásmidos recombinantes, los cuales se propagan en la cepa bacteriana, obteniéndose así los clones positivos. 2. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque la solución que se añade a 0 µl desuerodelpacienteesde0µl de 4 M isocianato de guanidina, 2 mm citrato sódico, 0 mm 2-mercaptoetanol, 0,% sarkosyl, 0 µl de fenol;dh 2 O (1:1), 1 µg/ml trna y 0 µl de cloroformo. 3. Procedimiento, según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque la mezcla suero-solución se incuba en hielo durante 1 minutos. 4. Procedimiento, según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la mezcla incubada se centrifuga a xg durante 1 minutos, a 4 C, reextrayendo la fase acuosa con una solución igual de cloroformo en las mismas condiciones.. Procedimiento, según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el genoma viral obtenido se trata de 1 U de inhibidor de RNasas aislado de placenta humana, y se precipita con isorpropanol a-70 C durante toda la noche, recuperando por centrifugación los ácidos nucleícos obtenidos, los cuales se disuelven en agua bidestilada y estéril. 6. Procedimiento, según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los ácidos nucléicos obtenidos se desnaturalizan por calor a 94 C, durante minutos. 7. Procedimiento, según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el cdna se sintetiza utilizando el ácido nucléico desnaturalizado como molde y el oligonucleótido sintétito durante la síntesis de la primera cadena del cdna mediante una transcriptasa en reverso. 8. Procedimiento, según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el cdna se amplifica por técnica conocida (PCR), utilizando ATG GGG CAA AGG ACG TCC G 3, llevándose a cabo 2 ciclos consistentes cada uno en 36 segundos a segundos a 0 C 180 segundos a 68 C 9. Procedimiento, según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los cdna de doble cadena amplificada se fraccionan de acuerdo a su tamaño mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,%.. Procedimiento, según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los fragmentos de cdna se clonan en el vector pcr Procedimiento, según las reivindicaciones anteriores, caracterizados porque los plásmidos recombinantes se propagan bacteriana apropiada cuyo genotipo es: end A 1,recA 1, hsd R17 (r-k,m + k), sup E 44, 1-, thi-1, gyr A, rel Al, f 80 lac Z m 1 (lac ZYA-arg F), deo R+, F. 12. Procedimiento, según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las coloniasde células que llevan los plásmidos recombinantes se identifican con métodos convencionales, obteniéndose 4 clones positivos, denominado c4, c13, c1 y c17 cuyas secuencias, comparándolas con las del VCH aislado en EE.UU. revelan una diferencia alrededor del %, y de un 1% con las de la variante japonesa. 6

7 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA k 11 ES k 21 N. solicitud: k 22 Fecha de presentación de la solicitud: k 32 Fecha de prioridad: INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA k 1 Int. Cl. : C12N 7/02, 1/ DOCUMENTOS RELEVANTES Categoría Documentos citados Reivindicaciones afectadas Y EP-A (CHIRON CORPORATION) 1- *Pág. 42, líneas 1-3 * Y ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 162, (1987) PIOTR CHOMCZYNSKY 1- AND NICOLETA SACCHI: Single-step method of RNA ISOLATION by acid guanidium Thiocyanate-Phenol-Chloroform-extraction. *Pág * Y HENRY A. ERLICH ed. PCR TECHNOLOGY (1989) M. STOCKTON PRESS 6-9 RANDALL K. SAIKI The design and optimization of the PCR. *Pág. 8, * Y EP-A (CHIRON CORPORATION) 6-9 *Pág. 42, líneas 36-3; pág. 43, líneas 14- * A * Todo el documento * 1-12 Y GENE, 91 (1990) pg KENJI TAKEUCHI et al. Hepatitis C Viral cdna clones isolated from a healthy carrier donor implicated in post-transfusion non-a, non-b hepatitis. * Todo el documento * Y T. MANIATIS et al. MOLECULAR CLONING 1982 COLD SPRING HARBOR LABORATOY *Pág. 0 * Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud El presente informe ha sido realizado para todas las reivindicaciones para las reivindicaciones n : Fecha de realización del informe Examinador Página N. Urquía Fernández 1/1