Purificación de RNA IG 2010

Transcripción

1 Purificación de RNA IG

2 Purificación de RNA Para qué sirve? Cómo se trabaja con RNA? Pasos generales: Homogeneizar células Purificar el RNA (total o no total, ej mrna) Cuantificar el RNA purificado Calidad del RNA 2

3 Purificación de RNA Para qué sirve? Cómo se trabaja con RNA? Pasos generales: Homogeneizar células Purificar el RNA (total o no total, ej mrna) Cuantificar el RNA purificado Calidad del RNA 3

4 Usos del RNA purificado Para identificar un RNA en particular, dentro de la población total de RNA de la célula Northern blot RPA (RNase protection assay) RT-PCR (transcripción reversa y posterior PCR) Otras cosas: traducción in vitro, construcción de cdna library, etc. 4

5 1- Northern blot La sonda es complementaria al RNA que se busca Es un método lento y semicuantitativo Se ve el tamaño del RNA de interés 5

6 2- RPA o ensayo de protección de ribonucleasas 1. La sonda es complementaria al RNA que se busca. Hibridación 2. Digestión con RNasa: degrada simple cadena, se protege RNA de interés (doble cadena con la sonda) 3. Corrida electroforética Más rápido y cuantitativo (relación 1 a 1 sonda-rna) que NB No se ve el tamaño del RNA de interés (depende de la sonda) 6

7 3- RT-PCR 1. Transcripción reversa (RT): de RNA a cdna 2. PCR: con primers específicos se puede amplificar una región de interés 3. Corrida electroforética El producto de PCR indica presencia del RNA de interés 7

8 Purificación de RNA Para qué sirve? Cómo se trabaja con RNA? Pasos generales: Homogeneizar células Purificar el RNA (total o no total, ej mrna) Cuantificar el RNA purificado Calidad del RNA 8

9 Manipulación del RNA El RNA es degradado por RNasas, que están por todos lados. Las RNasas son mucho más poderosas que las DNasas: Son termorresistentes en gral (autoclavar soluciona parcialmente) No requieren cationes divalentes (así que EDTA no tiene efecto, a diferencia de lo que pasa con DNAsas) 9

10 Manipulación del RNA Cómo vencer a las RNasas? Evitar la contaminación con RNasas: - trabajar con material libre de RNasas (autoclavar soluciones, material descartable especial, etc. - trabajar con guantes en todo momento Impedir (o disminuir) la acción de las RNasas: - utilizar inhibidores específicos - trabajar con rapidez y precisión y a veces en frío, especialmente cuando no hay inhibidores presentes 10

11 Dónde están las RNasas y cómo luchamos contra ellas? PROBLEMA 1. En uno. (Manos, saliva, etc) 2. Tips, epps, etc. 3. Agua y buffers 4. Superficies del labo (por presencia de bact, hongos, céls humanas, etc.) SOLUCIÓN 1. Guantes, trabajo prolijo 2. Todo RNasa-free 3. Agua mq autoclavada, o tratada con DEPC (DISCUTIR) 4. Evitar contacto, limpiar con soluciones comerciales (ej RNase zap de Ambion) o al menos con alcohol 11

12 Dónde están las RNasas y cómo luchamos contra ellas? (cont.) PROBLEMA 5. RNasas endógenas 6. Muestras RNA se contaminan o las RNasas copurifican 7. Plásmidos que se usan para transcripción in vitro 8. Pipetas contaminadas con RNasas SOLUCIÓN 5. Frío (hielo, congelar en N2 líq) y rápido 6. Usar inhibidores de RNasas (RNase-out de Invitrogen, etc) 7. Si en la mini/maxi prep se utilizó RNasa, usar proteinasa K y extracción con fenol cloroformo 8. Tener pipetas para RNA, aspirar alcohol, usar tips con filtro, etc. 12

13 Purificación de RNA Para qué sirve? Cómo se trabaja con RNA? Pasos generales: Homogeneizar células Purificar el RNA (total o no total, ej mrna) Cuantificar el RNA purificado Calidad del RNA 13

14 Purificación de RNA Para qué sirve? Cómo se trabaja con RNA? Pasos generales: Homogeneizar células Purificar el RNA (total o no total, ej mrna) Cuantificar el RNA purificado Calidad del RNA 14

15 Homogeneizar las células Es lo primero que hay que hacer para obtener RNA Tener en cuenta: la lisis libera RNasas endógenas y las pone en contacto con RNA endógenos. Además, hay RNasas exógenas Este paso es crítico para el rendimiento y la integridad del RNA obtenido. Entonces, hay que hacer una LISIS COMPLETA Y RÁPIDA Lisis lenta: RNasas endógenas se contactan con RNA endógeno Lisis incompleta: mucho RNA queda atrapado y baja rendimiento final 15

16 Homogeneizar las células Células o tejidos? Tejidos blandos o duros? Animal, vegetal, levaduras, bacterias? Lisis mecánica o enzimática? Por ej, algunos tejidos, como páncreas o bazo, son especialmente ricos en RNasas endógenas Lisis mecánica: con homogeneizador, vortex, sonicador, etc. Lisis enzimática (ej lisozima) para por ej bacterias o levaduras, normalmente seguido de lisis mecánica 16

17 Homogeneizar las células TEJIDOS: Tejidos frescos: procesar en frío y que no pasen más de 30 min. Ej RNA later (Ambion) mantiene el tejido fresco protegiendo al RNA Si no, congelar: problemas y ventajas (ej huesos). Mortero para pulverizar, temperatura baja. No descongelar. CÉLULAS en cultivo: En suspensión: centrifugar y resusp en sc desnat. Pegadas : lisis en placa o despegar células y lavar con PBS 17

18 Purificación de RNA Para qué sirve? Cómo se trabaja con RNA? Pasos generales: Homogeneizar células Purificar el RNA (total o no total, ej mrna) Cuantificar el RNA purificado Calidad del RNA 18

19 Purificación de RNA En condiciones desnaturalizantes fuertes que inactivan a las RNasas, por ej: tiocianato de guanidinio Agente caotrópico (desnaturaliza prots, DNA y RNA) poderosísimo LiCl SDS fenol El RNA está en riesgo antes de este paso (lisis celular), y después de este paso, pero no durante. 19

20 Purificación de RNA 1. Tiocianato de guanidinio y extracción con fenol-cloroformo 2. Tri-Reagent (Ambion. SIGMA), TRI-zol (Invitrogen), etc. Todos Tri. 3. RNeasy-kit (Qiagen): para RNA total 4. Purificación de mrna: Kits enteros ej bolitas o columnas con oligo dt pegado (SIGMA, Roche, Invitrogen, Agilent, Amersham, Ambion, etc) 20

21 Purificación de mrna El mrna representa 1-5 % del RNA total de la célula. Se elige purificar mrna para: Detectar RNAs que están en poquísima cantidad Sintetizar sondas para usar en arrays Generar libraries de cdna Eliminar trna y rrna aumenta 30 veces una señal de mrna Usar mrnas para esto permite que no se generen cdnas complementarios a rrna y trna, que diluyen lo que uno busca. 21

22 Purificación de RNA con guanidinio 1. Homogeneización/Lisis: Solución de tiocianato de guanidinio 2. Extracción RNA: extracción con fenol ácido y luego cloroformo:isoamílico 3. Precipitación RNA: fase acuosa a otro tubo, precipitar con isopropanol y lavar con etanol 75% 4. Solubilización RNA: resuspender el pellet de RNA en algo TRI-zol, Tri- Reagent y similares 22

23 Chomczynski & Sacchi Analytical Biochemistry, April 1987 Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction Nature Protocols, June 2006 QuickTime and a decompressor are needed to see this picture. 23

24 Cómo se separa el RNA? El medio ácido hace que el RNA quede en fase acuosa, el DNA en la interfase, y las proteínas desnaturalizadas en fase orgánica. Fenol ácido: ph 4,5 (fenol saturado en agua en vez de en Tris). Es crítico que sea ácido. CUIDADOS! (por la muestra y por uno) - Fenol:cloroformo:isoamílico 25:24:1, ph 7 o más en Tris: ác nucleicos quedan en fase acuosa (oxhidrilos negativos). Si es en 2 partes, primero fenol, y luego clorof:isoamílico 24:1 - Antioxidante en el fenol: discutir - Cloroformo afina la interfase y disuelve lípidos, y el alcohol isoamílico reduce espuma 24

25 Guardado del RNA purificado Este es el otro paso crítico, además de la lisis celular, que afecta el rendimiento y la integridad del RNA purificado Opciones para resuspender el pellet: Buffer TE (Tris-EDTA) EDTA 0,1 mm Agua libre de RNasas Agua tratada con DEPC (dietilpirocarbonato, inactiva RNasas porque hace modif. covalentes en -OH, -SH y -NH, pero DEPC es incompatible con Tris por ej y hay que eliminarlo autoclavando mín. 1 h y queda CO2 y etanol) Por poco tiempo: a -80 C (muy poco tiempo a -20 C) Por mucho tiempo: precipitando en alcohol 25

26 Purificación de RNA Para qué sirve? Cómo se trabaja con RNA? Pasos generales: Homogeneizar células Purificar el RNA (total o no total, ej mrna) Cuantificar el RNA purificado Calidad del RNA 26

27 Cuantificación del RNA Absorbancia a 260 nm (espectrofotómetro): Barato y fácil, pero proteínas, nucleótidos libres y DNA también absorben No medir RNA en agua sino en Tris ph neutrish 1 A 260 nm = 40 ug RNA/ml Fluorescencia (fluorómetro): ej RiboGreen (Invitrogen) se pega a ácidos nucleicos y emite fluorescencia Más caro pero contaminación por proteínas no afecta y es más sensible. Como no mide prots, se puede poner DNasa para medir sólo RNA 27

28 Purificación de RNA Para qué sirve? Cómo se trabaja con RNA? Pasos generales: Homogeneizar células Purificar el RNA (total o no total, ej mrna) Cuantificar el RNA purificado Calidad del RNA 28

29 Calidad del RNA: integridad RNA total: - Se puede chequear en un gel de agarosa nativo o desnaturalizante. - Idealmente se espera una relación 2 a 1 de rrna 28S respecto del 18S (menos que eso indica comienzo de degradación). - ALTERNATIVA A GEL: Agilent 2100 Bioanalyser Data (electroferograma) mrna: - Se puede chequear haciendo un Northern con sonda de housekeeping gene (ej actina o GAPDH). - No degradación se ve banda definida de tamaño correcto. 29

30 Calidad del RNA: contaminación Absorbancia a 260 nm vs Absorbancia a 280 nm (espectrofotómetro): Ácidos nucleicos absorben con pico en 260 nm y proteínas con pico en 280 nm Relación A260/A280 de 1,8 o más indica pureza. Menos de 1,6 indica presencia de proteínas contaminantes o trazas de fenol (ojo, absorbancia a 280 depende mucho del ph - la baja fuerza iónica aumenta A280- así que diluir en TE o Tris) Agilent 2100 Bioanalyser Data también da info sobre presencia de contaminantes 30

31 Qué haremos nosotros? Estudiar la inducción del gen p21 en células tratadas con un agente de daño al ADN (doxorubicina) P21 se induce por p53 Utilizaremos células HCT116 wt y mutadas para p53 Algunos grupos trabajarán con células wt (con y sin doxo) y otros con células mut (con y sin doxo) Preparar RNA de las células tratadas y no tratadas, hacer una RT, y hacer una real time PCR para levantar p21 31

32 Extracción de RNA IG 2010 Discutir protocolo pág 42 y 43: Modo de trabajar: guantes, cuidado, etc Solución D y acetato de sodio: se preparan y se guardan a temp amb Fenol saturado en agua: saturar!!!, guardar a 4C, CUIDADO! Clorof:isoamílico 49:1 ojo, se evapora! Vidrio, CUIDADO! No usamos agua DEPC para las soluciones sino agua mili Q autoclavada. Ojo Epps buenos (tapa, fenol) y RNase-free, tips, etc 32

33 Reacción de transcripción reversa: de RNA a cdna Se suele usar la enzima MMLV-RT tiene menor actividad RNasa H (degrada híbridos RNA- DNA) que otras RT. Esta actividad es una gran desventaja al utilizar primers de DNA Versiones mutantes ej Superscript (Invitrogen) más procesivas y que actúan a mayor temp, lo que desarma estruct secundarias) Primer para la RT Oligo-dT (reconoce mrnas) Primer específico para un mrna Hexámeros al azar dntps Inhibidor de RNasas 33

34 Transcripción reversa IG 2010 Discutir protocolo pág 44: Mezclar RNA total con dntps, oligo-dt Calentar a 65 C por 5 min: el calor desarma estructura secundaria del RNA Dejar unos minutos a temp ambiente: el oligo-dt se aparea con las colas de polia Agregar mix con buffer, DTT, RNAse-out (inhibidor de RNasa) y enzima MMLV-RT Reacción de RT 1 hora a 37 C Calentar a 70 C para terminar la reacción 34

35 -Fin- 35