Vida una receta para hacer proteínas

Transcripción

1 Transcriptómica

2 Vida una receta para hacer proteínas Transcripción Traducción DNA RNA proteína

3 El Dogma Central de la Biología Molecular

4 El Dogma Central de la Biología Molecular

5 Qué es la Información Biológica? Genoma -> Transcriptoma ->Proteoma

6 Qué es la Información Biológica? Tres niveles básicos de información biológica: Genoma: la información genética común a todas las células del organismo. Transcriptoma: la parte del genoma que se expresa en una célula en una etapa específica de su desarrollo. Proteoma: las proteínas que interactuan para dar a la célula su carácter individual. Del GENOMA estático, único al PROTEOMA dinámico, múltiple.

7 La era de la genómica

8 La genómica se ha desarrollado como consecuencia de los avances en Biología Molecular e Informática. La introducción y popularización de las tecnologías de alta procesividad ha cambiado drásticamente la manera en que se abordan los problemas biológicos y se prueban las hipótesis.

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10 Genómica funcional El objetivo de la genómica funcional es generar un catálogo de todos los genes y de su función. Para comprender el comportamiento de los sistemas biológicos y de los algoritmos genéticos que permiten el funcionamiento celular y el desarrollo de los organismos.

11 Genómica funcional La genómica funcional engloba el estudio del: Transcriptoma: conjunto completo de transcritos. Proteoma: conjunto de proteínas codificadas por un genoma. Interactoma: interacción de estos productos.

12 Genómica funcional Planteamiento clásico: Dirigido por una hipótesis. Limitado el número de genes estudiados. Planteamiento genómico: No hay hipótesis de partida. Información sobre miles de genes.

13 El paradigma pre-genómico Genes en el DNA... codifican proteínas... >protein kunase acctgttgatggcgacagggactgtatgctgatct atgctgatgcatgcatgctgactactgatgtgggg gctattgacttgatgtctatc... Del genotipo al fenotipo producen el fenotipo final cuya estructura influye en la función... además el ambiente...

14 La visión post-genómica Quién? Secuenciación genoma Espectrometría de masas para complejos proteícos Y quién más? SNPs Literatura, bases de datos Qué sabemos? Microarrays de DNA En qué manera? Donde, cómo y cuanto?

15 Transcriptoma

16 Estudio de los perfiles de expresión de todos los genes presentes en el genoma. El método más utilizado es el de microarrays de DNA, que permite el análisis simultaneo de la expresión de miles de genes.

17 Transcripción DNA G T A A T C C T C C A T T A G G A G RNA polimerasa mrna G U A A U C C

18 Regulación de la expresión génica Varios niveles de regulación: transcripción, maduración, transporte al citoplasma, degradación, traducción, post-traducción. Los genes no actúan de forma aislada. Existen redes de interacción: Física (directa o indirecta). Funcional.

19 Sistemas de detección de la expresión génica Pasado: técnicas tradicionales para medir la expresión génica, como Northern y RT-PCR. Desarrollo tecnológico: Expressed Sequenced Tags (ESTs). Serial analysis gene expression (SAGE). Suppression substractive hybridization (SSH). Microarrays de DNA.

20 Cambio de escala: del gen al genoma

21 Cambio de escala: del gen al genoma

22 Tecnicas genómicas de alta procesividad Independientes de conocimiento previo: ESTs SAGE SSH Dependientes de conocimiento previo: Microarrays de DNA

23 ESTs (Expressed Sequenced Tags) Generación de colecciones de ESTs (etiquetas de secuencia expresadas). La complejidad de los genomas eucariotas hace aconsejable no abordar inicialmente el estudio del genoma completo. Es preferible estudiar aquellos genes que se están expresando en un momento determinado de la vida del organismo.

24 ESTs

25 ESTs Genoteca de cdna: colección de fragmentos de DNA clonados que representan el conjunto de genes que se están expresando en un órgano o tejido determinado, o bajo una situación particular o momento de desarrollo. Las genotecas de cdna se secuencian de forma masiva para generar miles de secuencias parciales o ESTs de bp.

26 ESTs

27 ESTs Las diferencias en la expresión de genes pueden ser identificadas considerando el número de veces en que aparece representada una EST particular. Las ESTs por su propia naturaleza, son incompletas y, hasta cierto punto, imprecisas. Las ESTs también suelen ser suficientes para la identificación de los genes mediante comparación con las bases de datos.

28 Tecnología SAGE (Serial Analysis Gene Expression) Versión acelerada de la secuenciación de ESTs. Un segmento corto procedente de un mrna (etiqueta SAGE) es suficiente para identificar inequívocamente a un gen completo. La etiqueta corta tiene que estar ubicada en una posición definida dentro de la secuencia del mrna.

29 Tecnología SAGE Generación de etiquetas SAGE (Tags) de secuencias (10-14 bases). Ligación de las etiquetas SAGE para obtener concatémeros que pueden ser clonados y secuenciados. Comparación de los datos de secuencia para determinar diferencias en la expresión de los genes.

30 Tecnología SAGE

31 Tecnología SAGE

32 Tecnología SAGE

33 Tecnología SAGE: Ventajas Principalmente los ESTs brindan información de secuencia, mientras que el SAGE provee datos cuantitativos describiendo la abundancia de transcritos. Determina el nivel de expresión para cada gen, y contribuye al descubrimiento de nuevos genes. Muy buena correlación con la abundancia de RNA mensajero en la célula.

34 Tecnología SAGE: Problemas Muy laborioso, laboratorios especializados y complejidad análisis de datos. Problemas técnicos: Digestión incompleta con la enzima que genera extremos cohesivos. Problemas con la secuenciación masiva.

35 Tecnología SSH

36 Tecnología SSH

37 Microarrays de DNA

38 Microarrays de DNA Los microarrays de DNA surgen de la necesidad de analizar la cantidad de información procedente de los grandes proyectos de secuenciación de genomas. Permiten elaborar mapas finos de transcripción y proporcionan información indirecta de los niveles de proteínas.

39 Microarrays de DNA El análisis de microarrays de DNA es una nueva tecnología que permite estudiar simultáneamente la expresión de miles de genes y analizar su expresión bajo distintas condiciones experimentales. Los microarrays de DNA constan de miles de conjuntos ordenados de moléculas de DNA de secuencia conocida depositados en un soporte sólido (~ 2 cm 2 ) como cristal, nylon o silicio. Cada combinación (gen/muestra) se localiza de forma inequívoca en un punto del microarray.

40 Microarrays de DNA Los microarrays de DNA permiten la medida simultánea de los niveles de expresión de miles de genes (sondas) en un solo experimento de hibridación con una mezcla compleja de DNA o RNA (dianas). Sondas: secuencias de DNA conocidas (oligonucleótidos o productos de PCR) inmovilizadas ordenadamente sobre una superficie sólida. Dianas: muestra problema de DNA o RNA marcada cuya abundancia será determinada por hibridación.

41 Microarrays de DNA - El concepto Medir el nivel de transcritos (mrna) de un gran número de genes simultáneamente para determinar que genes se están expresando en la célula. CELL RNA

42 Microarrays de DNA El objetivo El objetivo de los experimentos con microarrays de DNA es comparar la expresión de múltiples genes (transcripción) en distintas condiciones: Momentos distintos del tiempo Tejidos distintos Tejidos sanos o enfermos (p.e. Tumores) Se basan en tecnologías conocidas como la hibridación y la fluorescencia.

43 Microarrays de DNA - Hibridación A T A T G C G C C G C G A T A T C G C G T A T A G C G C T A T A A T A T

44 Microarrays de DNA - Hibridación Mediante hibridación, pueden detectar DNA o RNA: Si el DNA o RNA hibridado está marcado fluorescentemente puede ser cuantificado mediante escaneado del chip de DNA.

45 Microarrays de DNA Sondas Cada sonda del microarray de DNA está diseñada para unirse a un gen de forma específica. Diseño de sondas específicas: Especificidad de secuencia. Tms homogéneas. Sin estructuras secundarias. Cada sonda está dispuesta de forma ordenada sobre el microarray de DNA.

46 Microarrays de DNA El proceso gen mrna Sondas de DNA específicas de gen cdna marcado

47 Microarrays de DNA El resultado Los microarrays de DNA están formados por millón de sondas de DNA sobre una superficie de 1 cm por 1 cm (chip de DNA). Los resultados de microarrays de DNA se basan en el concepto de culpable por asociación. Genes que son co-regulados (patrón similar de comportamiento) es probable que estén funcionalmente relacionados formando parte del mismo proceso biológico.

48 Microarrays de DNA El reto Los microarrays de DNA son una revolución por su capacidad de realizar experimentos inconcebibles hasta hace poco tiempo. Los nuevos chips de DNA podrán contener (y por tanto estudiar) el genoma humano en 2 cm 2. Esto genera cantidades ingentes de datos que deben ser almacenadas, procesadas y analizadas: - Al tratarse de una nueva técnica la mayor parte de métodos, protocólos o estándares se están aún definiendo.

49 El primer Microarray de DNA 45 Genes de Arabidopsis y 3 genes control: total 48 señales. Schena et al., (1995). Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science 270,

50 Microarrays de DNA Experimento básico Un experimento básico de microarrays de DNA consiste en: 1- Diseño y fabricación del microarray. 2- Preparación de la muestra e hibridación. 3- Escaneo del microarray. 4- Análisis de imagen. 5- Análisis de los resultados.

51 Diseño Array Diseño Sonda Microarrays de DNA PREGUNTA Diseño Experimental Preparación Muestra Hibridación Análisis de Imagen Compra Chip/Array Preprocesamiento de datos Normalización Análisis Estadístico Análisis Avanzado de Datos Extracción de Genes Relevantes RESPUESTA

52 Microarrays de DNA Experimento básico

53 Diseño y fabricación

54 Diseño y fabricación La primera fase del diseño del microarray de DNA consiste en la selección de los genes que se desean incorporar al experimento. Las secuencias necesarias pueden obtenerse, por ejemplo, de una base de datos de ESTs. Puede haber problemas en la identificación de las secuencias : Errores de secuenciación Splicing alternativo Contaminación

55 Diseño y fabricación - Sondas Una vez seleccionados los genes se realizan múltiples copias de cada uno mediante PCR, y los productos (sondas) se depositan en el sustrato. Tipos de sondas: Genotecas de cdna (Stanford microarrays) Oligonucleótidos (Affymetrix) El soporte sólido (sustrato) del microarray suele ser cristal, y también membranas de nylon o plástico.

56 Diseño y fabricación Adhesión sondas La adhesión de las sondas sobre el sustrato puede hacerse mediante diversas técnicas: Impresión mecánica (capilaridad) o microinyección (Ink-jet) Stanford microarrays Fotolitografía Affymetrix Existen dos tipos de tecnologías de microarrays de DNA: Arrays de cdnas: Stanford Microarrays. Arrays de oligonucleótidos: Affymetrix.

57 Preparación de la muestra

58 Preparación de la muestra Paralelamente al diseño y fabricación del microarray que contiene los genes (sondas) cuya expresión se desea estudiar......deben prepararse las muestras problema (dianas) en las que se desea estudiar la expresión de estos genes. Extracción de todo el mrna de las células en las condiciones que se desea estudiar, y posterior marcaje del mrna.

59 Preparación de la muestra 1. Diseño experimental 2. Realizar experimento Pregunta? Réplicas? mutante silvestre 3. Precipitar RNA 4. Marcaje RNA Eucariota/procariota? Pared celular? Amplificación? Directo o indirecto? Tipo de marcaje?

60 Hibridación

61 Hibridación Una vez preparadas y marcadas las muestras problema (dianas) se depositan sobre las sondas en el microarray de DNA. Esto hará que los cdnas o crnas de las muestras problema se puedan hibridar con los de cada gen contenido en las sondas del microarray de DNA. La hibridación tendrá lugar en un grado proporcional a la expresión del gen de cada sonda en cada muestra problema.

62 Hibridación En arrays de cdna las muestras problema se juntan y se hibridan en un único microarray. En arrays de oligonucleótidos las muestras se hibridan por separado en dos microarrays idénticos. Tras la hibridación, el microarray se lava para eliminar el material que no se ha hibridado. La intensidad de la señal de hibridación resultante es proporcional a la cantidad de mrna que corresponde a esa secuencia en la muestra original.

63 Hibridación La detección de la hibridación es un paso clave para determinar qué sondas se han unido a sus dianas complementarias procedentes de la muestra. Las principales técnicas de detección de la hibridación requieren del marcaje previo de las dianas: cdna: Stanford Microarrays. crna: Affymetrix.

64 Microarrays de DNA: el paradigma de una técnica post-genómica Cy5 Cy3 Arrays de cdna Arrays de oligonucleótidos

65 Microarrays de DNA - La tecnología Stanford Microarrays Affymetrix (GENECHIP)

66 Stanford Microarrays

67 Stanford Microarrays Arrays de cdna Portas de cristal Impresión de las sondas Post-procesamiento Hibridación

68 Stanford microarrays Impresión robótica Arrays de cdna

69 Stanford microarrays Impresión robótica Mecánica (capilaridad) Ink-jet (microinyección)

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72 Stanford microarrays Impresión robótica Tamaño del lunar: µm (Ø) Espaciado: µm Número lunares I. mecánica: lunares/cm 2 Número lunares Ink-jet: >2500 lunares/cm 2 Cantidad DNA: <10 pg DNA Tipo de substrato: Portas recubiertos (polylisina, silano, superaldehido, estreptavidina) Membrana de nylon

73 Stanford microarrays Perfiles de expresión génica Preparar Microarray Clones DNA PCR Purificar productos Impresión robótica Aislar RNA y marcar Muestra A Aislar RNA Marcaje con Cy5 Muestra B Aislar RNA Marcaje con Cy3 Mezclar, hibridar sondas y analizar datos Hibridar al microarray Lavar Analizar datos

74 Stanford microarrays Marcaje dianas (cdna) Fluorescencia (Cyanine 3 vs. Cyanine 5) Radioactividad ( 3 H vs. 35 S o 33 P vs. 14 C) Los dos marcajes más comunes son los fluorocromos de cianina: Cy3, absorción 554 nm, emisión 568 nm Cy5, absorción 650 nm, emisión 672 nm Pero también se utilizan fluorocromos Alexa: Alexa Fluor 546 Alexa Fluor 647

75 Stanford microarrays Marcaje dianas (cdna) Excitation Emission Excitation Emission

76 Stanford microarrays Marcaje dianas (cdna)

77 Stanford microarrays: marcaje dianas (cdna) mrna G U A A U C C U C Transcriptasa Reversa cdna T T A G G A G C A T T A G G A G C A T T A G G A G C C A T A G G A G C A T C C A A A G T T A G A A G A A G C A A T T T A A G G G G A A G G G C A T T A G G A G Retrotranscripción: Obtener cadenas de cdna complementarias al mrna

78 Stanford microarrays: marcaje dianas (cdna) Cy5 Cy3

79 Stanford microarrays: el proceso Cy5 Cy3

80 Muestra A Stanford microarrays Muestra B mrna IMPRESIÓN SONDAS mrna cdna cdna Cy5-cDNA Cy3-cDNA

81 Stanford microarrays Detección marcaje Las muestras hibridadas sobre el microarray se iluminan sucesivamente con luz láser de dos colores distintos para estimular la fluorescencia de uno u otro fluorocromo. La cantidad de mrna unido a una muestra se puede medir por la intensidad de la fluorescencia emitida al ser iluminada por el láser del color correspondiente.

82 Stanford microarrays Detección marcaje

83 Stanford microarrays Detección marcaje Si la muestra 1 se marca con rojo y la muestra 2 con verde se obtendra en cada punto del microarray que: Si el RNA de la muestra 1 abunda más que el de la otra muestra se detecta como un punto rojo. Si el RNA de la muestra 2 abunda más que el de la otra muestra se detecta como un punto verde. Si ambos se expresan por igual se detecta como un punto amarillo. Si en ninguna de las dos muestras hay mrna se detecta como un punto negro.

84 Stanford microarrays Detección marcaje Las intensidades de las fluorescencias emitidas permiten determinar los niveles relativos de expresión de los genes en ambas muestras problema.

85 Stanford microarrays: problemas

86 Stanford microarrays: problemas

87 La tecnología Affymetrix

88 La tecnología Affymetrix - Genechip

89 La tecnología Affymetrix - Sondas Arrays de oligonucleótidos: síntesis in situ de oligonucleótidos de 25 bases sobre una superficie cuadrada de cristal (1.3 cm x 1.3 cm) mediante fotolitografía parejas de sondas específicas para cada gen. Sobrerepresentación extremos 3 de los mrna. Seleccionadas para maximizar las temperaturas de hibridación y la especificidad.

90 La tecnología Affymetrix - Sondas Tamaño del lunar: ~150 µm (Ø). Densidad: oligonucleótidos/cm 2. Millones de copias de cada oligonucleótido específico ( copias). Un array de oligonucleótidos puede contener sondas (aproximadamente genes). El array de S. cerevisae contiene oligos, que representan todos sus genes conocidos.

91 La tecnología Affymetrix - Sondas Para cada gen existen dos sondas: una de homología perfecta (PM, Perfect Match) de 25 bases y otra con una error deliberado/mutación (MM, MisMatch) en la zona central. Buena calidad de datos/ baja varianza. La presencia de numerosos genes de control permite una casi perfecta normalización entre diferentes experimentos.

92 La tecnología Affymetrix - Sondas Cada gen está representado por dos sondas: PM MM - Perfect Match (PM) - MisMatch (MM) control hibridación PM: CGATCAATTGCACTATGTCATTTCT MM: CGATCAATTGCAGTATGTCATTTCT

93 La tecnología Affymetrix - Sondas Cada sonda tiene 25 bases sondas por gen Parejas de sondas: Perfect Match (PM) MisMatch (MM)

94 La tecnología Affymetrix: síntesis sondas Cy5 Cy3 Síntesis in situ mediante fotolitografía

95 La tecnología Affymetrix Síntesis sondas T A T A T T A A T A T A T A Mask #2 Mask #1 T T T A A A Espaciadores unidos a la superficie de cristal con grupos protectores fotolábiles

96 La tecnología Affymetrix Síntesis sondas Luz (desprotección) Máscara OOOOO Sustrato HO HO O O O T TTOOO Luz (desprotección) TTOOO Máscara Sustrato C TTCCO REPETIR CATAT AGCTG TTCCG

97 La tecnología Affymetrix: marcaje dianas (crna) Cy5 Cy3 crna fragmentados y biotinilados aislados después de amplificación lineal

98 La tecnología Affymetrix - Equipamiento Fluidic Station Scanner

99 La tecnología Affymetrix El proceso

100 La tecnología Affymetrix: el proceso Cy5 Cy3

101 La tecnología Affymetrix: detección marcaje Cy5 Cy3

102 La tecnología Affymetrix El experimento

103 La tecnología Affymetrix GeneChip Célula de hibridación Diana crna de cadena sencilla marcado Sonda Oligonucleotido * * * * * 24µm 1.28cm Millones de copias de cada oligonucleótido específico ( copias) >200,000 differentes sondas complementarias Imágen de un Genechip hibridado

104 La tecnología Affymetrix

105 La tecnología Affymetrix Arrays comerciales Humano Ratón Rata Arabidopsis C. elegans Perro Drosophila E. coli P. aeruginosa Plasmodium/Anopheles Vitis vinifera (uva) Xenopus laevis S. cerevisiae Pez cebra

106 Resumen Microarrays de DNA

107 Microarrays de DNA - Comparativa Stanford microarrays: Flexible, también especies sin secuenciar Requiere menor presupuesto Calidad de datos: media-alta Affymetrix: No flexible, sólo especies secuenciadas Equipamiento caro Calidad de datos: alta

108 Análisis de imágen

109 Diseño Array Diseño Sonda Microarrays de DNA PREGUNTA Diseño Experimental Preparación Muestra Hibridación Análisis de Imagen Pre-procesamiento de datos Normalización Compra Chip/Array Análisis Estadístico Análisis Avanzado de Datos Extracción de Genes Relevantes RESPUESTA

110 Análisis de imágen Esta nueva forma de experimentar requiere de nuevas herramientas de análisis y visualización de resultados. Cada experimento de microarrays de DNA genera una gran cantidad de datos y es preciso realizar un procesamiento apropiado de los mismos. Transformación de las imágenes en números.

111 Análisis de imágen Escaneado -Escáner Confocal -Escáner CCD Formatos archivos imágen Análisis de imágen -Localización de los puntos -Segmentación de los puntos -Evaluación calidad de los datos

112 Análisis de imágen Escaneado Escaneado del porta

113 Análisis de imágen Escáner confocal Microscopía confocal

114 Análisis de imágen Escáner CCD Cámara CCD Filtro emisión Luz blanca Beamsplitter Filtro excitación

115 Análisis de imágen Formato archivos imágen Los escáners generan un archivo gráfico y el formato de archivo de imágen más común es TIFF de 16 bits. Un archivo TIFF de 16 bits describe cada pixel en una imagen con una intensidad entre 0 y Normalmente dos escáners en diferentes longitudes de onda originan dos archivos monócromos que se superponen. COMPOSICIÓN Canal Cy3 Canal Cy5

116 Análisis de imágen Formato archivos imágen DOS COLORES Muestra 1 marcada en rojo (Cy5) Muestra 2 marcada en verde (Cy3) Rojo: gen inducido en Muestra 1 Verde: gen inducido en Muestra 2 Amarillo:-niveles similares de expresión Rojo/Verde: ratio de expresión UN COLOR La intensidad de la expresión de un gen utilizando las sondas (PM) (en algunos casos MM- control) PM/MM Los archivos gráficos generados por el escáner se analizan mediante diferentes programas informáticos.

117 Análisis de imágen Stanford microarrays Hígado (Cy5) / Cerebro (Cy3) Pérfiles de expresión génica en Hígado y Cerebro

118 Análisis de imágen La tecnologia Affymetrix Affymetrix Human Genome U95A Genechip hibridado con cerebro fetal

119 Análisis de imágen Localización de los puntos La identificación y cuantificación de las señales de hibridación (puntos) puede realizarse de forma manual, automática y semiautomática. Se dibuja una parrilla sobre la imagen para ayudar al programa en la identificación de puntos individuales.

120 Análisis de imágen Segmentación de los puntos Clasificación de cada pixel en cada imagen como señal o ruido de fondo. Para cada punto individual obtener las medidas de: Señal, Fondo y Calidad. Método Fixed circle Adaptive circle Adaptive shape Histogram method Programa ScanAlyze, GenePix, QuantArray GenePix, Dapple Spot ImaGene, QuantArray

121 Análisis de imágen Segmentación de los puntos Intensidad de los puntos: calculo de la media de los pixel en cada punto. Corrección del ruido de fondo: local o global.

122 Análisis de imágen Evaluación calidad de los datos La mayor parte de las irregularidades se pueden detectar por las siguientes medidas: Variabilidad de la intensidad Desviación del tamaño de punto Desviación de la circularidad Intensidad de señal relativa al fondo Desviación de la posición en la parrilla En base a estas medidas, se pueden descartar puntos irregulares.

123 Análisis de imágen Evaluación calidad de los datos

124 Análisis de imágen Evaluación calidad de los datos Field Meta Row Meta Column Row Column Gene_ID Flag Signal Mean Background Mean A ZY A ZY A ZY A ZY A ZY A ZY A ZY A ZY A ZY A ZY A ZY A ZY A ZY Matriz de datos de expresión génica

125 Normalización

126 Diseño Array Diseño Sonda Microarrays de DNA PREGUNTA Diseño Experimental Preparación Muestra Hibridación Análisis de Imagen Compra Chip/Array Pre-procesamiento de datos Normalización Análisis Estadístico Análisis Avanzado de Datos Extracción de Genes Relevantes RESPUESTA

127 Normalización En general, los niveles de expresión de genes individuales se miden por: log (R/G) log (PM/MM) En cualquier experimento biológico es esencial conocer el grado de reproducibilidad de las medidas. La repetición de experimentos de microarrays es costosa. El factor limitante puede ser la cantidad de muestra biológica.

128 Normalización Pre-procesamiento de datos iniciales previo al análisis estadístico y análisis avanzado de los datos. Cada valor de intensidad proviene de una imagen independiente y es necesario hacer que estos valores sean comparables. Ajuste básico: igualar la intensidad media de las imágenes. Las intensidades no son únicamente concentraciones de mrna, hay múltiples fuentes de variación que pueden afectar y desviar seriamente la interpretación de los resultados.

129 Normalización Fuentes de variación Contaminación de tejidos Degradación Purificación RNA Transcripción reversa Eficiencia de amplificación Eficiencia de marcaje (Cy3/Cy5) Soporte unión DNA Spotting Otros temas relacionados con la preparación del array Corrección del fondo Segmentación de la imagen Eficiencia y especificidad de hibridación Efectos espaciales

130 Normalización A B C (a) Después de normalización por intensidad media (b) Después de normalización por Lowess (c) Después de normalización teniendo en cuenta efectos espaciales Antes (izda.) y después normalización (dcha.). (A) (B) (C) BoxPlots BoxPlots de subarrays MA plots (ratio versus intensidad)

131 Análisis Estadístico

132 Diseño Array Diseño Sonda Microarrays de DNA PREGUNTA Diseño Experimental Preparación Muestra Hibridación Análisis de Imagen Compra Chip/Array Pre-procesamiento de datos Normalización Análisis Estadístico Análisis Avanzado de Datos Extracción de Genes Relevantes RESPUESTA

133 Análisis estadístico Prácticamente cualquier técnica estadística tiene cabida en los estudios de microarrays de DNA. La técnica de agrupamiento de datos más popular es el análisis de conglomerados: A partir de la matriz de datos de expresión génica. Busca formar grupos naturales (conglomerados o clusters) de genes o de condiciones experimentales que permitan responder las preguntas del estudio.

134 Análisis estadístico El análisis de conglomerados permite visualizar aquellos genes cuyos perfiles de expresión son más similares. Para facilitar la visualización los números vuelven a convertirse en colores.

135 Análisis estadístico Otra forma usual de representar los datos es a través de un gráfico que muestre como varia la expresión del gen entre los distintos experimentos.

136 Análisis de resultados

137 Diseño Array Diseño Sonda Microarrays de DNA PREGUNTA Diseño Experimental Preparación Muestra Hibridación Análisis de Imagen Compra Chip/Array Pre-procesamiento de datos Normalización Análisis Estadístico Análisis Avanzado de Datos Extracción de Genes Relevantes RESPUESTA

138 Análisis de resultados Una vez extraída la información de las imágenes hay que analizar e interpretar los resultados. Cómo es posible organizar, visualizar y explorar el significado de millones de datos de expresión de miles de genes bajo cientos de condiciones distintas?. La forma de analizar los datos dependerá de lo que se desee averiguar.

139 Análisis de resultados Los patrones o perfiles de expresión génica se pueden estudiar desde dos puntos de vista: A) Comparaciones enfocadas en los genes: análisis de la expresión específica de los genes en experimentos comparativos (p.e. Tejidos diferentes). B) Comparaciones enfocadas en las muestras: estudio de las alteraciones del nivel de expresión en una determinada situación fisiológica o patológica con el objetivo de identificar los genes implicados.

140 Análisis de resultados A) Comparaciones enfocadas en los genes: Análisis de los valores de inducción/represión en una serie de experimentos comparativos. Esto permite la identificación de grupos de expresión, genes con patrones de expresión correlacionados. Si un número de genes se inducen/reprimen de la misma manera en varias situaciones, es probable que: Los genes estén regulados conjuntamente o, Los genes estén relacionados funcionalmente (participan en el mismo proceso biológico).

141 Análisis de resultados B) Comparaciones enfocadas en las muestras: Diferencias a nivel fenotípico son la causa de diferencias a nivel molecular que, en muchos casos, pueden detectarse midiendo los niveles de expresión génica. Identificación de genes implicados en procesos biológicos o condiciones experimentales de interés (p.e. Tratamiento hormonal, tumores, etc.). También se pueden identificar perfiles de expresión de genes con capacidad de diagnóstico.

142 Análisis de resultados

143 Análisis de resultados - Aplicaciones Estudios de expresión diferencial de genes Análisis de patógenos Identificación de enfermedades genéticas complejas Detección de mutaciones y de Polimorfismos simples de nucleótido (SNPs) Farmacogenómica Diseño y descubrimiento de fármacos Estudios toxicológicos

144 Análisis de resultados - Aplicaciones Estudio de expresión diferencial de genes Identificación de genes implicados en procesos biológicos de interés

145 Análisis de resultados - Aplicaciones Estudio de distintos genotipos / Farmacogenómica Respuesta a fármacos, toxicidad, predisposición desarrollo enfermedades, etc.

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