Oscar N. Ruiz Ocasio, Ph.D. Ciencias Biomoleculares

Transcripción

1 Oscar N. Ruiz Ocasio, Ph.D. Ciencias Biomoleculares

2 Biotecnología Molecular Introducción 1978 Genentech aisló el gen de la insulina de humanos E. coli utilizado como reactor para las dos cadenas péptidas Modificaciones In vitro (S-S) Previamente insulina porcina Decada de los 80 s altas expectativas Hoy muchas de las ideas se han alcanzado (clonación de animales, terapia genética, producción de proteinas humans)

3 Introducción Muchos tenian miedo a la producción de nuevos organismos (patógenos, resistencia antibióticos, insecticidas y herbicidas) 1970: biotec no era una diciplina Algunas facetas en Ing Quim y Microb 1917: Termino Biotec por Ing Hungaro: toda linea de trabajo por el cual se producen productos de materia prima con la ayuda de organismos Biotechnología: la aplicación de los principios de ciencias e ingeniería para el procesamiento de materiales por organismos para proveer bienes y servicios.

4 Introducción Hasta 1961 Biotec describía: Fermentación Industrial Ergonomía Inicialmente ingeniería genética usaba: UV y agentes mutagénicos químicos El proceso de biotransformación fue mas rapido, directo y facil con el advenimiento de la tecnología del DNA recombinante Producción de todos compuestos y manipulación de todo organismo : 200 compañias pequeñas Hoy más de 2500 companias y más de 2000 drogas recombinantes

5 Incialmente la biotechnología surgío de los campos de la microbiología, bioquímica, e ingeniería química. Actualmente la biotecnología es la union de diversas ramas de las ciencias incluyendo física. Todas las facetas de las ciencias son afectadas por la biotecnología

6 Tecnología del DNA Recombinante Clonación de genes o clonación molecular: método para la transferencia de DNA de un organismo a otro DNA extranjero es clonado por enzimas de restricción o PCR y ligado DNA construct es tranferido a una célula mediante transformación Selección en antibióticos Construct tiene los elementos para expresar una proteína Exonucleasa: degradan DNA Plásmidos: material extracromosomal, circular, autónomo

7 Endonucleasas de restricción Cortan ddna (tipo II), reconocen palindromes Protección contra bacteriófagos EcoRI corta en seis (E: genus; co:especie,r:strain) Staggered produce sticky ends overhangs Otras Blunt-ended or flush

8 RE pueden reconocer 4, 6, 8 o más. RE paso más importante en la biotecnología molecular Se puede cortar DNA con dos RE diferentes, inclusive una Sticky y una blunt

9 Isosquisomeros: RE que reconocen la misma secuencia, cortan diferente Isocaudomeros: RE reconocen secuencias diferentes pero producen la misma extención Metilación del DNA

10 Enzimas de Clonación Klenow permite producir blunt-ends Blunt ends permite pegar pedazos cortados con diferentes enzimas 5 exonucleasas para degradar overhangs

11 Sticky ends son unidos Blunt end son unidos

12 Vectores de Clonación Plasmidos en la naturaleza 1 kb-500kb High copy number ( kb) Low copy number (1-4 kb) Origen de replicación Broad host range plasmids or narrow Vectores artificiales 2-6 kb Resistencia a Amp y Tet 4.3 kb Pocos lugares de restricción E. coli ori, high copy # Pueden cargar 10 kb Características de un buen vector de clonación: pequeño, multiples lugares de clonación, marcadores

13 2.6 kb Lugar de clonación multiple AmpR, lacz (B-galactosidasa) Ori IPTG (isopropyl-b-d-thiogalactopyranoside) induce LacZ X-Gal se hidroliza y se ve azul El insert cambia el marco de lectura

14 Plásmido Es una molécula adicional de DNA que confiere ventajas adaptativas.

15 Transformación: uptake del plasmido Células competentes Puede ocurrir en el medio ambiente E. coli no es competente naturalmente Ultra-competentes por tratamiento de CaCl2 (células en fase log media, suspención en CaCl2, mantenidas a -80 C Transformación: Derretir células Añadir DNA por 30 minutos Choque por calor heat shock por 45 seg a 42 C Crecer células en LB liq/1hr Contenido en plato de agar LB con selección

16 Transfomación es ineficiente: 1 en 1000 Seleccionas para plasmido recircularizado: Blunt Staggered (una sola enzima) Ligación del mismo plasmido es eficiente La célula (E. coli) debe ser RecA- y Endo-

17 Selección Plato agar con antibiótico, IPTG y X-Gal MiniPrep Digestión con RE o PCR Cracking Method Amp/Tet R Resistencia a Tet en el cromosoma puc19 no Tet Genes reporteros GFP y GUS Vectores con varios ori

18 Clonación en un Plasmido Recircularización posible del vector Defosforilación Un solo enlace fosfodiester por hebra Se repara durante replicación Blunt-end entra bi-direccional Hay que revisar la orientación Dos enzima staggered entra unidireccionalmente Blunt: ligación a 14 C, toda la noche Vectores autonomos, estables y de muchas copias

19 Creación y Selección de Bibliotecas Genómicas Proceso de dividir el genoma de un organismo en sequencias clonables Completa: contiene todo el material genético del org. Cortar genoma con RE frecuente en condiciones no óptimas Se generan todos los tamaños Asegura que los genes están completos La suma de todos los fragmentos debe ser 3 o más veces el tamaño del genoma

20 Afecto del Tiempo en la Digestion Incremento en tiempo de la digestión Aumenta los fragmentos Digestión completa El # de clones a seleccionar depende de: El tamaño de fragmento aceptado por vector El tamaño del genoma La extensión de la covertura

21 Tamaño del Genoma de Varios Organismos

22 Selección de DNA por Hibridación Encontrar el gen en la biblioteca Usar un probe radiactivo o biotina Desnaturalización del DNA (calor or alcalino) Transferir DNA de hebra sencilla a la membrana Crosslink con UV Hibridación del probe homologo al DNA Condiciones rigurosas para remover hibridación no específica y exceso de radioactividad (background). Alta temperatura Alta [] de sal y SDS

23 Como marcar el Probe? Random primer amplification Autoradiografía Primers, nucleotidos, DNA poly α 32 P-CTP No isotópico se le pega biotina Reconocida por streptavidin Tiene pegada AP para quimoluminiscencia o colorimetria Sequencia del probe obtenida de organismo conocido o desifrado de la secuencia de amino ácidos de la proteina No son 100% complementarias Baja rigurosidad

24 Proceso de Selección Colonias en platos Transferir a membrana Romper célula Desnaturalización DNA Pegar a membrana Hibridizar el probe autoradiografía

25 Selección por Ensayo Imunológico Anticuerpo primario y lavado Anticuerpo secundario y lavado Añadir substrato hidrolizable Detectar color o luz

26 Selección por Actividad de Proteínas Si la célula adquiere una propiedad nueva Enzima que confiere resistencia a algo Enzima que metaboliza algo nuevo

27 Separación de Poly(A) mrna (Eucariotas) 5 G cap Poly A tail de hasta 200 adeninas mrna se separa de otros RNAs por oligo de varias timinas pegadas a esferas de celulosa en una columna Buffer alcalino desnaturaliza el pareo de bases

28 Primera hebra DNA Transcriptasa a la inversa (RT) dt-primer dntps RT producida por retroviruses Hairpin loop se forma al final antes de que RT termine síntesis Segunda hebra Fragmento Klenow produce la segunda hebra de DNA dntps requeridos Rnase H degrada RNA Nucleasa S1 degrada sobre salientes overhangs y abre el loop Clonar por blunt-end RE Síntesis de cdna Clones son seleccionados para secuencia completa Generación de cdna completos e incompletos (time consuming)

29 Método de Selección de cdnas Completos Poli-dT con secuencia en el 3 para RE Trehalosa se añade para aumentar procesividad de RT a altas temperaturas Altas temperaturas remueven extructuras secundarias Incorporación de 5-metyl C Hemimetilación Biotinylation química de la ribosa del G-cap Rnase I degrada RNA no pareado a DNA RNA y DNA bioatinylated se separa al pegarse a esferas magnéticas-streptavidin

30 Tratamiento con RNase H degrada RNA pegado a DNA completo Enzima terminal deoxynucloetidyl añade nucleotido G. No necesita templete dgtp Segunda hebra Añade Poli-C primer que contiene lugar de restricción RNase H presente cdna es RE y clonado en vector hemimethylated

31 Capacidad de Carga de Diferentes Vectores

32 Ciclo de Vida Bacteriófago Lambda Lisogenia: integra en el cromosoma Lítico: replica y rompe célula (~ 100 particular virales) Genoma 50 kb, 12 bases de hebra sencilla en el 5 y 3 (Cos ends) Genes I/E de 20 kb Lítico: si se remueve el I/E Lambda: Proteína tubular, fibra en el rabo, capsido de proteínas Cos ends: secuencias complementarias forman DNA circular

33 Empaquetamiento del Virus Replicación ciclo lítico: DNA largo (concatameros) Cabeza se llena con 50kb Rabo se pega <38 kb no funcinal 52 nt no cabe Enzima en entrada reconoce los Cos ends y corta Producción In Vitro del virus

34 Sistema de Clonación Lambda I/E bordeada por BamHI Left arm (L): head and tail Right (R): DNA replication, Lysis L y R fraccionados y enriquecido Fragmento a integrar de kb Ligación Partículas formadas In Vitro Solo tiene ciclo lítico Se mantiene en E. coli Librería genómicas se seleccionan al ver placas Se transfieren a membranas para análisis

35 Carga 45 kb, se mantiene como plásmido en E. coli plrf-5 (Cósmido común) Cos sites separados por ScaI Lugar clonación multiple (6 RE) Ori E.coli, TetR DNA exógeno se corta parcialmente con BamHI (~45 kb) Fraccionado por sucrose gradient density centrifugation Cósmidos

36 Primero corta cosmido con ScaI Corta despues con BamHI Fragmentos unidos por ligasa Cosmido lineal 6kb Cos site tienen que estar 50 kb alejados DNA insertado a E. Coli por infección Recircularización en E. coli Bacteriófago P1 carga 85 kb (tatal 115 kb) Ventajas cosmidos: Major fragmento, menos clones a analizar Grupos de genes y genes completos fácil de clonar

37 Vectores de Alta Capacidad BAC: se mantiene en 1 ó 2 copias kb insert Basado en el plasmido F Bien estable Bacteriófago P1-chromosoma artificial derivado YAC Utilidad: Producción de mapas físicos completos de Euc. Carga genes completos Gran probabilidad de incluir todo el material genético

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