Herramientas para el diagnóstico, seguimiento y tratamiento en Hepatitis B. Fabián Fay CIBIC Rosario Argentina

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1 Herramientas para el diagnóstico, seguimiento y tratamiento en Hepatitis B Fabián Fay CIBIC Rosario Argentina

2 HBV - Marcadores Serológicos HBsAg: Antígeno de Superficie Anti-HBc (total): Anticuerpo anti-core total Anti-HBc (IgM): Anticuerpo anti-core a clase IgM Anti-HBs: Anticuerpo anti-hbs HBeAg: Antígeno e Anti-HBeAg: Anticuerpo anti-e HBV - Marcadores Moleculares HBV-DNA cualitativo. HBV-DNA cuantitativo Carga Viral. Mutantes de Resistencia a antivirales. Genotipos de HBV. TAN en banco de sangre.

3 Hepatitis B Importante establecer: Hepatitis Aguda vs Hepatitis crónica En Hepatitis crónicas: estratificación del estado de replicación viral Respuesta a tratamiento antiretrovirales y desarrollo de resistencia Estado de replicación residual. Marcadores subrogantes del ccc-dna del HBV

4 Ciclo Replicativo del HBV

5 Marcadores de HBV HBV Aplicación Anti-HBs Anti-HBcore HBsAg HBeAg HBV-DNA HBV-DNA Inmunidad Exposición Infección Replicación IgM-Anti-HBcore HBV-DNA Infeccion aguda - Enfermedad

6 Cómo comenzar el diagnóstico de una infección por HBV? HBsAg y antihbc 1) HBsAg - anti-hbc - 2) HBsAg + antihbc + 3) HBsAg + antihbc - 4) HBsAg - antihbc +

7 1) HBsAg - anti-hbc - Sin contacto con HBV Analizar Vacunación

8 2) HBsAg + antihbc + Caso confirmado de Hepatitis B. Anti HBc IgM Reactivo No reactivo Infección aguda por HBV Infección crónica por HBV

9 3) HBsAg + antihbc - Repetir en nueva muestra y/o en 30 dias HBsAg anti-hbc Caso probable de infección por HBV Resultado reactivo para ambos marcadores, pasa al esquema anterior HBsAg + antihbc - Resultado negativo para ambos marcadores Evaluar status replicativo Caso DESCARTADO

10 4) HBsAg - antihbc + Reactivo antihbs Hepatitis B resuelta (infección pasada) No reactivo Vacunar Síntomas HBeAg anti-hbe HBV-DNA anti-hbc(total) IgM anti-hbc HBsAg anti-hbs Repetir Anti HBs a los 30 días post primera dosis Reactivo No reactivo (Puede repetirse el proceso con una segunda dosis de vacuna) Hepatitis B resuelta (infección pasada) antihbc "aislado" Carga viral HBV

11 Diagnóstico de Hepatitis B Marcadores de Tamizaje: HBsAg y Anti-HBc IgG HBsAg (-) Anti-HBCore (-) HBsAg (-) Anti-HBCore (+) HBsAg (+) Anti-HBCore (-) HBsAg (+) Anti-HBCore (+) Sin contacto Con HBV Evaluar Vacunación Ampliar los estudios (*1) Poco probable Infección aguda Temprana o Falso Positivo o Contaminación Infección por HBV Ver si es aguda Anti-HBc IgM Si Anti-HBc IgM (-) Evaluar status crónico de la infección

12 Qué marcadores usar para caracterizar una Hepatitis B crónica? HBeAg Anti HBeAg HBV-DNA cuantitativo.

13 Las 4 Fases de la infección Crónica por HBV Fase de Inmuno-tolerancia HBeAg positivo; alto HBV DNA (2 x IU/mL); ALT normal Hepatitis Crónica HBeAg-positivo (inmuno clearance) Intermedio a alto HBV DNA (200,000-2 x 10 9 IU/mL); ALT alta o fluctuante; inflamación activa en biopsia hepática Portador Inactivo de HBsAg (fase de baja replicación) HBeAg negativo; bajo HBV DNA (< 2000 IU/mL); ALT normal HBsAg puede volverse indetectable Hepatitis Crónica HBeAg-negativo (fase de reactivación) Intermedio a alto HBV DNA (200,000-2 x 10 9 IU/mL); ALT alta o fluctuante; inflamación activa en biopsia hepática. HBeAg negativo con o sin Anti-HBe. Lok AS, et al. Hepatology. 2007;45: Pungpapong S, et al. Mayo Clin Proc. 2007;82:

14 Las 4 Fases de la infección Immune Tolerance HBeAg+ HBeAg-/anti-HBe+ (precore/core promoter variants) < > < > HBV DNA Crónica por HBV Immune Clearance 2 x x IU/mL 200,000-2 x 10 9 IU/mL Low Replicative Phase < 2000 IU/mL Reactivation Phase > 2000 IU/mL ALT Normal/mild CH Moderate/severe CH Cirrhosis Normal/mild CH Inactive cirrhosis Moderate/severe CH Cirrhosis HBeAg+ chronic hepatitis Inactive-carrier state HBeAgchronic hepatitis

15 Estratificación de las Hepatitis crónicas a HBV

16 HBV Crónica HBeAg-Negativo vs Status de portador inactivo Hepatitis Crónica HBeAg-Negativo Portador Inactivo HBsAg positivo Anti-HBe positivo Anti-HBc positivo HBV DNA > 2000 IU/mL* < 2000 IU/mL ALT Elevada Normal *Fluctuaciones menores a < 2000 IU/mL pueden ocurrir. Pueden ser elevadas en forma permanente o intermitente. Keeffe EB, et al. Clin Gastroenterol Hepatol. 2008;6:

17 Niveles de HBV-DNA en suero en diferentes status de la infección

18 Herramientas moleculares en HBV Detección del HBV-DNA Cualitativo Cuantitativo Carga Viral Detección de mutaciones de resistencia al tratamiento con antivirales Determinación del Genotipo de HBV Nuevos horizontes: ccc-dna, marcador subrogante del ccc-dna, poblaciones minoritarias, fenotipos de HBV y su impacto en el tratamiento

19 Detección del HBV-DNA en suero Métodos cualitativos: HBV-DNA PCR Resultado de tipo SI-NO Métodos cuantitativos: Carga Viral de HBV Resultado númérico expresado en UI/ml

20 Sondas y primers para la detección de HBV-DNA en suero Deben estar dirigidas a regiones altamente conservadas del genoma de HBV Estas regiones no deben contener ninguna porción del gen S o del gen de la polimerasa que potencialmente pueden ser afectadas por mutaciones que aparezcan como consecuencia de la resistencia a drogas

21 Detección de HBV-DNA cualitativo Aplicaciones: Definición de replicación activa del HBV en pacientes con patrón compatible con infección crónica Definición de infección HBV oculta (HBsAg negativa) Monitoreo de respuesta de tratamiento antiviral Métodos: comerciales, no comerciales Límites de detección: 5-50 copias/ml (contra que standards? Como se compara entre laboratorios?) Aplicación principal: TAN en bancos de sangre con métodos comerciales específicos para este objetivo diagnóstico

22 Detección de HBV-DNA cuantitativo Carga Viral Permite detectar y cuantificar la viremia Sólo se utilizan métodos comerciales Estandardización de las unidades de cuantificación del HBV DNA en UI/ml La alta sensibilidad de métodos como Taqman permiten usarlo como test cualitativos (Sensibilidad analítica de 6 UI/ml)

23 Carga Viral de HBV Ensayos HBV DNA disponibles

24 Aspectos importantes a tener en cuenta en métodos cuantitativos Siempre usar el mismo método cuando se maneja a un mismo paciente. Nunca informar valores mayores a un límite, sino realizar diluciones hasta obtener el valor real. El ensayo es lineal en log/log. Si bien los ensayos se informan en copias el valor a comparar debe ser el valor en logs. Diferencia de carga viral con implicancia clínica: > a 1 log.

25 Utilidad clínica de la medición del HBV- DNA durante el tratamiento Predecir respuesta Monitorear eficacia Monitorear respuesta Eleccion del tratamiento

26 SITIO DE ACCIÓN DE LOS ANTIVIRALES Ciclo Replicativo del HBV

27 Acción de los antivirales (inhibidores de la RT) Los análogos nucleósidos son moléculas virostáticas. Al inhibir la acción de la polimerasa del HBV, impiden la liberación de nuevos virus, pero no frenan la síntesis de proteínas virales ni atacan el pool de ccc-dna La eliminación definitiva del HBV sólo puede llevarse a cabo si la respuesta inmune del paciente es los suficientemente fuerte en el contexto de una potente inhibición de la producción del HBV. Toda variante de escape de la polimerasa al antiviral, permite aumentar el pool de ccc-dna pero además, conteniendo dichas variantes de escape

28 Acción de los antivirales (inhibidores de la RT)

29 Efecto de análogos nucleosídicos sobre los marcadores virales. Ejemplo: HBeAg(+) Pre-Rx Intra Rx Fin Rx Seguimiento R NR RS Resistencia HBsAg /- + HBeAg Anti-HBe Carga Viral Alta ND ND Alta ND Alta Anti-HBc Anti-HBs /+ -

30 Evaluación de respuesta en análogos de alta barrera genética -Definiciones Breaktrough virológico: rebote de la carga viral sérica en mas de 1 log 10 por encima del límite de detección (nadir) Resistencia genotípica: detección de mutaciones conocidas por conferir resistencia durante la terapia Breaktrough virólogico con resistencia genotípica: rebote en la carga viral, asociado a mutaciones causantes de resistencia antiviral. No Respuesta primaria (fracaso primario): la carga viral luego de los 3 meses de tratamiento, no disminuyó mas de 1 log 10 respecto al valor normal. Respuesta parcial o sub-óptima: la dismunición de la carga viral durante el tratamiento no lo transforma en no detectable Zoulim & Perillo, J Hepatol 2008; EASL CPG, J Hepatol 2009

31 Evaluación de respuesta en análogos de alta barrera genética 1.0 Drogas antivirales Cambios en el DNA- -HBV (log 10 UI/mL) Lok AS, et al. Hepatology. 2007;45: Respuesta primaria o fracaso primario Respuesta subóptima Nadir Meses 1 log breakthrough virológico Respuesta Virológica completa o subótima

32 Mutaciones asociadas a desarrollo de resistencia a antivirales

33 Resistencia 2 HBV DNA Virológica 3 ALT Bioquímica DNA 1 Genotípica Limite de detección Aumento >1 log Início Año 1 Año 2 Año 3 Resistencia fenotípica Confirmaçión in vitro de que una mutación disminuye su eficacia al tratamiento

34 Tecnologías utilizadas para el seguimiento de pacientes con antivirales y definición de patrones de resistencia Secuenciación : gold-standard INNO-LiPA HBV Drug Resistance Assay PCR-RFLP para búsqueda de mutaciones mas comunes en el sitio YMDD

35 INNO-LiPA HBV DR Assay Puede detectar polimorfismos en: codones 528, 552 y 555 de HBV pol codones 171, 172, 195, 196, 198 y 199 de HBsAg Altamente sensible y fácil de usar Permite detectar mutaciones YMDD 3-6 semanas antes de la secuenciación

36 Mutaciones del HBsAg secundario a mutaciones en la polimerasa

37 Cepas resistentes a Drogas y su implicancia en la Salud Pública general Pueden infectar a personas no vacunadas (naïve) (anti-hbs-) Individuo con HBV Crónica tratado con análogos de nucleós(t)idos Selección de mutantes que no son protegidos por la vacunación Pueden infectar a personas inmunizadas contra la Hepatitis B (anti-hbs+) 1 Thibault V, et al. AIDS 2002; 16: Torresi J, et al. Virology 2002; 293:

38 Genotipos HBV Existen descriptos 8 genotipos de HBV: A H Para su definición debe existir una diferencia > 8% en su secuencia completa. Difieren en la distribución geográfica Están asociados a diferentes frecuencia y patrones de mutaciones del HBV Contribuye a las variaciones epidemiológicas, de historia natural, resolución clínica, eficacia del tratamiento en diferentes partes del mundo

39 Genotipos HBV Potenciales diferencias biológicas entre los genotipos de HBV Tasa de replicación del HBV Eliminación natural del HBeAg. Expresión y reconocimiento de los epitopes inmunes. Evolución de la enfermedad Hepática Patogénesis Asociación con desarrollo de cirrosis y hepatocracinoma Sensibilidad a la terapia antiviral.

40 Genotipo HBV Metodología de determinación: Gold Standart: secuenciación, puede ser tanto del genoma completo como de una región particular (HBsAg, HBCore/HBeAg, HBV-pol) Para la aplicación clínica se utilizan técnicas mas simples como RFLP o InnoLipa. HBV Genotyping Line Probe Assay marker line conj. control amp. control Genotype A Genotype B Genotype C Genotype D Genotype E Genotype F Genotype G Genotype H

41 Genotipo HBV La determinación del genotipo de HBV no tiene hoy aplicación clínica No se ha incluido su determinación en ninguna guía de consenso Su aplicación como herramienta prospectiva en el seguimiento de la historia natural y la respuesta a los tratamientos disponible demostrará en un futuro si puede alcanzar la importancia potencial que se le asigna. La utilización de la secuenciación para resistencia permite definir el genotipo de HBV infectante

42 Nuevos horizontes en la biología molecular aplicada al HBV Detección y cuantificación del ccc-hbv-dna HBsAg cuantitativo: Marcador subrogante de ccc- HBV-DNA? Detección de variantes minoritarias de escape al tratamiento Fenotipo HBV Ensayo biológico

43 HASTA DONDE HEMOS LLEGADO HOY EN LA APLICACIÓN DE LABIOLOGÍA MOLECULAR EN EL MANEJO CLÍNICO? Valores indetectables de HBV-DNA sérico, aún con ensayos de alta sensibilidad, no implican la ausencia o clearence de los virus ni de la infección viral La evaluación de la carga viral en diferentes momentos del tratamiento es utilizada como marcador de efectividad de la actividad antiviral y la persistencia de la respuesta Hasta el momento, no existen marcadores que identifiquen el logro de que el sistema inmune del paciente logra controlar efectivamente la infección viral y el progreso de la enfermedad

44 ccc-hbv-dna Su detección es dificultosa Tipo de muestra: biopsia de hígado Cuantificación: copias/células Estandarización técnica Homogeneidad de su expresión en tejido. NECESIDAD DE UN MARCADOR SÉRICO SUBROGANTE ALTERNATIVA EN ESTUDIO HBsAg CUANTITATIVO

45 Serum HBV-DNA HBsAg Viriones Replicación Disminución del nivel Del HBV-DNA sérico Reducción de la replicación MARCADOR DE REPLICACIÓN VIRAL Viriones + Partículas defectivas (exceden a los viriones por un factor de 10 3 a 10 5 ) Replicación Transcripción del ccc-dna Traslación del mrna Disminución del nivel Del HBsAg sérico Reducción de la cantidad de ccc-dna Reducción de la transcripción de ccc-dna Reducción de la traslación del m-rna MARCADOR DE ccc-dna ACTIVO

46 Nuevos Horizontes Detección de variantes minoritarias: impacto de las nuevas tecnologías (Next Generation Sequencing) que permitirán detectar poblaciones en % inferiores al 1% Ensayos biológicos de fenotipos del HBV, permitirán correlacionar los hallazgos genotípicos minoritarios con respuesta biológica y sentido clínico de las mismas.

47 Muchas Gracias.

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