CONTROL GENEALÓGICO EN LA ESPECIE OVINA MEDIANTE ANÁLISIS DE MARCADORES MICROSATÉLITE DE ADN

Transcripción

1 GENÉTICA CONTROL GENEALÓGICO EN LA ESPECIE OVINA MEDIANTE ANÁLISIS DE MARCADORES MICROSATÉLITE DE ADN LOZANO, J.M. 1,2 ; BOUZADA, J.A. 1,2 ; MAYA, M.R. 1,2 ; OSSORIO, B. 1,2 ; TRIGO, A. 1,2 ; ESTÉVEZ, M. 1,2 ; ANADÓN, E. 1 ; MAYORAL, T. 1 Y GÓMEZ-TEJEDOR, C. 1 1 Laboratorio Central de Veterinaria. Ctra. de Algete, km Algete. Madrid. 2 TRAGSEGA. Sanidad Animal y Servicios Ganaderos, S.A. Dirección de Estudios y Consultoría. C/ Conde Peñalver, Madrid. RESUMEN El Laboratorio Central de Veterinaria de Algete ha puesto a punto un grupo de 25 marcadores tipo microsatélite de ADN, con el objetivo de ofrecer a las Asociaciones de Criadores de ganado selecto de la especie ovina, una herramienta útil para verificar las inscripciones que se realizan en los registros de los libros genealógicos. El protocolo de trabajo en el laboratorio, se basa en la amplificación de 18 marcadores en una sola reacción de PCR que será utilizada de forma rutinaria, y un segundo grupo de 7 marcadores, amplificados en otra reacción única, para utilizar de forma complementaria en casos necesarios. Todos las secuencias han sido elegidas de la lista que propone la ISAG (Internacional Society for Animal Genetics) en el Test de Comparación Internacional de ADN ovino y caprino El trabajo que realizan los técnicos en el campo, así como el del laboratorio, son gestionados con un alto nivel de informatización y automatización, lo que garantiza la trazabilidad de todo el proceso desde la toma de muestra y recogida de información en las explotaciones, hasta la comunicación de resultados a las Asociaciones, eliminándose puntos críticos del proceso que de no ser controlados, originarían resultados no deseados y la necesidad de repetir análisis. PALABRAS CLAVE: microsatélites, control genealógico, ISAG. INTRODUCCIÓN La consecución de los objetivos planteados a la hora de conservar o seleccionar una raza animal necesita el uso de alguna herramienta que permita determinar de manera fiable la genealogía de los animales implicados. En las ganaderías de ovino el control de las parideras es bastante limitado debido sobre todo a las características de explotación y manejo de esta especie en la que los ritmos reproductivos implican en ocasiones cubriciones a lo largo de todo el año, permitiendo con ello la posibilidad de las montas continuas (explotaciones extensivas), y otras veces, montas en las que se utilizan un gran número de machos por lote de hembras (sistemas semiextensivos). La inseminación artificial es un instrumento de los esquemas de selección cada vez más utilizado en ovino y podría ayudar a dar fiabilidad a los registros de los libros genealógicos aunque tampoco se consigue una total fiabilidad al hacer las asignaciones de progenitores (Pérez et al., 2000). 571

2 SEOC 2008 Estas limitaciones hacen que cada vez se demande más por parte del sector, la utilización de técnicas de laboratorio no sólo como sistema de certificación de las inscripciones en los libros genealógicos sino como una herramienta más en manos del ganadero a la hora de verificar la relación de parentesco de los animales que componen su rebaño. En el Laboratorio Central de Veterinaria de Algete se ha establecido un protocolo de trabajo cuya finalidad ha sido, por un lado, la optimización de recursos y, por otro, conseguir el máximo nivel de automatización e informatización de todo el proceso, de manera que se pueda garantizar la trazabilidad desde la toma de muestras en las explotaciones hasta la comunicación a la asociación del resultado obtenido en el laboratorio. En la presente comunicación se expone el método de trabajo que integra todo el proceso de control de paternidad y se describen de manera detallada las reacciones multiplex diseñadas para ser utilizadas en la especie ovina. MATERIAL Y MÉTODOS Todos los individuos de la especie ovina inscritos en los libros genealógicos, están identificados mediante bolo ruminal con dispositivo electrónico, lo que facilita la informatización del proceso. Los datos relativos a cada muestra, se recogen en la ganadería con lectores de bolos que permitan la recogida de esa información y su posterior volcado y envío telemático a la aplicación informática encargada de seguir todo el proceso: análisis de las muestras en el laboratorio, estudio de filiación y posterior comunicación del dictamen a la Asociación que corresponda. La base de datos estará ubicada en el MAPA estando disponible a los distintos usuarios a través de una página web de acceso restringido. Los ensayos necesarios para el diseño de las reacciones de PCR, se han hecho con muestras de sangre entera, extraídas en tubos de vacío con un conservante denominado Magic Buffer comercializado por Biogen Diagnóstica. La ventaja de este conservante es que la muestra no necesita estar refrigerada sino que puede mantenerse a temperatura ambiente durante largo tiempo, sin que se alteren sus características. Los tubos están identificados con un código del tipo OV#AAA000 y el correspondiente código de barras que será interpretado por un lector óptico, incorporándose de forma automática al proceso de análisis. El análisis en el laboratorio está automatizado casi en su totalidad. Se inicia con la identificación y alicuotado de los tubos, con el robot GENESIS Workstation 150 de Tecan, pasando las muestras a placas de análisis de 96 pocillos (identificadas con un código de barras del tipo OV000AA) y se crea un fichero informático donde se recoge la ubicación de cada una de las muestras. El ADN de las placas de 96 pocillos generadas en el proceso anterior, se extrae simultáneamente en un BioSprint 96 utilizando el BioSprint 96 Blood Kit 572

3 GENÉTICA (Qiagen), basado en la tecnología MagnAtract, siguiendo el protocolo establecido por el fabricante para este tipo de muestras. Se han diseñado dos reacciones multiplex en las que se amplifican de manera simultánea por un lado, 18 loci microsatélite para utilizar de panel principal, y por otro 7 loci como panel auxiliar. Las secuencias han sido seleccionadas de la lista propuesta por la ISAG en el Test de Comparación Internacional de ADN ovino y caprino La multiplex de 18 está formada por los siguientes marcadores: OarFCB20, SPS113, INRA063, SPS0115, HSC, OarCP49, ILST87, ETH152(D5S1), CSRD247, INRA006, INRA172, INRA49, INRA005, McM42, MAF65, McM527, INRA023 y BM1818. La multiplex del panel auxiliar está integrada por los loci: OarFCB11, OarFCB304, INRA081, OarAE119, MAF214, TGLA53 y ETH2(D5S2). En la tabla 1 se describen las características de los marcadores que integran ambas multiplex. En ambas reacciones la mezcla de PCR está formada por: 2µl de ADN, 7,5µl de Qiagen Multiplex PCR kit (Qiagen), 4µl de Agua estéril ultrapura y 1,5 de una mezcla maestra de cebadores donde están contenidas las parejas de oligonucleótidos necesarias para amplificar el conjunto de secuencias propuestas. La mezcla de componentes ha sido llevada a cabo en un Aquarius 96 MultiPipettor (Tecan). El protocolo de amplificación consiste en: 15 a 95ºC (por estar utilizando una Taq Hot Start); 35 ciclos de: 30 a 95ºC, 1:30 a 61ºC y 1 a 72ºC; y por último una fase de elongación final de 30 a 72ºC. El proceso ha sido llevado a cabo en un GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems). Las muestras amplificadas fueron analizadas mediante electroforesis capilar de fragmentos de ADN marcados por fluorescencia, en el analizador genético ABI Prism 3130xl Genetic Analyzer, mezclándose previamente en la siguiente proporción: 9,8µl de Formamida (Applied Biosystems), 0,2µl de GeneScan 500LIZ Size Standard (Applied Biosystems) y 1,5µl de ADN resultado de la reacción de PCR (diluido con 75 µl de Agua). La mezcla de componentes ha sido llevada a cabo en un Aquarius 96 MultiPipettor (Tecan). La interpretación de los resultados obtenidos se llevó a cabo empleando el software de análisis GeneMapper de Applied Biosystems. 573

4 SEOC 2008 Tabla 1. Marcadores microsatélite utilizados, localización cromosómica (Cr.), marcaje empleado y rango alélico. Panel Principal Panel Auxiliar Loci Crom. Marcaje Rango Loci Crom. Marcaje Rango OarFCB FAM OarFCB FAM SPS FAM OarFCB FAM INRA FAM INRA VIC SPS FAM OarAE NED HSC 20 6-FAM MAF NED OarCP49 17 VIC TGLA53 12 PET ILST87 6 VIC ETH2(D5S2) 3 PET ETH152 3 VIC CSRD VIC INRA006 1 NED INRA NED INRA49 1 NED INRA NED McM42 9 PET MAF65 15 PET McM527 5 PET INRA023 1 PET BM PET Crom. = Cromosoma RESULTADOS Y DISCUSIÓN La identificación electrónica de los ejemplares ovinos y todo el sistema que puso en marcha el LCV a través del Programa Nacional de Genotipado Ovino (Hurtado et al., 2007), ha servido de base para la automatización e informatización de todo el flujo de datos necesarios para llevar a cabo los estudios de filiación, desde la recogida de las muestras en la explotación hasta la emisión del dictamen final del laboratorio que se pondrá a disposición de las Asociaciones vía telemática. Este sistema asegura, además, una gran fiabilidad en la identificación individual tanto de los animales a lo largo de toda su vida, como de sus productos derivados (carne, células germinales ). Se han puesto a punto 25 secuencias de tipo microsatélite de ADN como herramienta de apoyo a la gestión de los libros genealógicos de las razas ovinas. Para optimizar el análisis de estos marcadores ha sido necesario el uso, en algunos casos, de cebadores distintos a los descritos en la bibliografía, para mejorar su amplificación en la reacción multiplex (INRA023), para adaptar sus intervalos alélicos (INRA49 e INRA005) o para mejorar la amplificación de algunos alelos de difícil detección (McM527). El hecho de amplificar en una única PCR de forma simultánea 18 secuencias, reduce considerablemente los costes tanto en material, como en tiempo empleado en los análisis, además de asegurar una elevada capacidad de detección de paternidades mal asignadas en las distintas razas ovinas. Estudios en los que se utilizan parte de los marcadores que integran el panel principal de 18 marcadores que se expone en este trabajo, presentan en razas ovinas autóctonas un número medio de alelos que oscila entre 16,9 574

5 GENÉTICA cuando se utilizan 11 de ellos (Bouzada et al, 2006), y 10 alelos utilizando 4 de los marcadores (Martínez et al, 2007). El uso de un número mayor de marcadores, además de disponer de un segundo panel auxiliar, abre la posibilidad de poder analizar un amplio rango de razas ovinas, en las cuales las características genéticas de un marcador a nivel individual pueden variar, pero se asegura la gran capacidad de exclusión del conjunto. Analizar un amplio número de marcadores permite, además, llevar a cabo exclusiones de paternidad con datos procedentes de otros laboratorios en los que se utilicen algunos de los marcadores incluidos en este panel. La relación de microsatélites utilizados (elegidos de las listas de la ISAG) presentan la ventaja de que la nomenclatura usada para nombrar los distintos alelos se ha estandarizado y permite compartir y comparar los resultados con los de cualquier otro laboratorio que haya participado en el Test de Comparación Internacional de Ovinos. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS BOUZADA, J.A., PORTELA, C.; PRADO, C.; AREÁN, H.; FERNÁNDEZ, M.; FERNÁNDEZ, A. Y VIANA, J.L Control Genealógico en las especies ovina y caprina mediante análisis de marcadores microsatélites de ADN. Libro de actas del XIV Congreso Internacional de la Federación Mediterránea de Sanidad y Producción de Rumiantes, HURTADO, M.D., LÓPEZ, C., BOUZADA, J.A., MAYORAL, T., ANADÓN, E. y GÓMEZ- TEJEDOR, C Análisis de los principales polimorfismos del gen PRNP en la cabaña ovina española. Libro de actas del I Congreso Nacional de Zootecnia. MARTÍNEZ, A.M., PUNTAS, J.A., VEGA-PLA, J.L., LANDI, V., GARCÍA, G. y DELGADO J.V Resultados del control de filiación en la raza ovina Segureña. Feagas, 31: PEREZ, E.M.; BOUZADA, J.A. LOZANO, J.M.; ACERO, F.J.; JIMÉNEZ-GAMERO, I.; GALLEGO, R. y MONTORO, V Exclusión de paternidad mediante secuencias microsatélites de ADN aplicada al esquema de selección de la raza ovina Manchega. Libro de actas de las XXV Jornadas Científicas de la Sociedad Española de Ovinotecnia y Caprinotecnia (SEOC), SHEEP GENEALOGICAL CONTROL USING THE ANALYSIS OF DNA MICROSATELLITE MARKERS SUMMARY The Central Veterinary Laboratory of Algete has developed a group of 25 microsatellite DNA markers type, in order to offer to Sheep Breeders Associations, a useful tool to verify the entries recorded in the studbooks. The laboratory working protocol is based on the amplification of 18 markers in a multiplex PCR reaction. In addition, a second group of 7 markers will be amplified in a separate multiplex PCR reaction that will be further performed only when needed. All these sequences were chosen from the list proposed at 575

6 SEOC 2008 the International Sheep Comparison Test by the ISAG (International Society for Animal Genetics). Both the field and the laboratory protocols are managed with a high level of automation and computerization. This fact guarantees the traceability among the whole process from sampling and information collection at the livestock farming to communication of results to the Associations. This traceability increases the control on the hot spots and reduces the number of repeated analysis due to unwanted results. KEY WORDS: microsatellites, parentage control, ISAG. 576