Catalizadores orgánicos. Se encuentran prácticamente en todos los tejidos. De importancia las enzimas séricas.

Transcripción

1 ENZIMAS Catalizadores orgánicos. Se encuentran prácticamente en todos los tejidos. De importancia las enzimas séricas. Se han identificado más de 50. Se pueden diagnosticar determinadas patologías: Enfermedades hepáticas Enfermedades pancreáticas Enfermedades miocárdicas.

2 ESTRUCTURA Enzima (Haloenzima) = apoenzima + cofactor Apoenzima: proporción proteica -desnaturalizable Cofactor: parte no proteica- dializable, esencial en la actividad catalítica Sustancia orgánica: coenzima, generalmente derivadas de las proteínas. (ej. NAD+ en la reacción de la lactato deshidrogenasa, FAD, la coenzima A y la C. Ion inorgánico: activador (ej. Zn 2+, Fe 2+, etc.)

3 PROPIEDADES Las enzimas son proteínas que incrementan la velocidad de una reacción química y no se consumen durante la misma (algunos tipos de ARN pueden actuar como enzimas, usualmente rompen y sintetizan enlaces fosfodiester; a estas moléculas se les denomina ribozimas y se encuentran en muy baja proporción en la naturaleza).

4 SITIO ACTIVO Las moléculas de enzimas contienen hendiduras o cavidades denominadas sitio activo. El sitio activo está formado por las cadenas laterales de residuos específicos, lo que ocasiona que tenga un arreglo tridimensional particular, diferente al resto de la proteína. Este sitio es afín por la estructura tridimensional del sustrato: enzima + sustrato sitio activo ocupado sitio activo vacío representación de la formación del complejo enzima-sustrato.

5 En el sitio activo el enzima (E) se une al substrato (S) formando un complejo enzima-substrato (ES). En el complejo ES, E transforma a S en él o los productos, formando el complejo enzima-producto (EP), finalmente el enzima libera del sitio activo a P, regenerándose. E + S ES E + P La mayoría de las reacciones catalizadas por enzimas son muy eficientes y transcurren desde 10 6 hasta veces más rápido que la misma reacción no catalizada. Típicamente, cada molécula de enzima es capaz de transformar cada segundo de 100 a 1000 moléculas de substrato en producto.

6 Eficiencia de las reacciones catalizadas por algunas enzimas. Enzima Velocidad en ausencia de enzima Velocidad de reacción catalizada Rendimiento Anhidrasa carbónica Corismato mutasa Triosafosfato isomerasa Carboxipeptidasa A AMP nucleosidasa Nucleasa estafilococal 1.3 X X X X X X X X X X X X X 10 14

7 ESPECIFICIDAD Las enzimas son muy específicas por el substrato de la reacción que catalizan. Interactúan con una o muy pocas moléculas y catalizan únicamente un tipo de reacción, por lo que las moléculas con las que interactúan deben ser muy parecidas, tanto en composición, como en estructura tridimensional. Por ejemplo, en la siguiente figura, en el panel A, se muestra la reacción catalizada por la enzima triosafosfato isomerasa (enzima que cataliza el paso 5 de la glucólisis), en el panel B se muestran inhibidores de la catálisis:

8 A Glu 165 Glu 165 Glu 165 H H O O P H OH His 95 H O P H H OH H OH O His 95 OH H His 95 P O DHAP Enediol GAP B O P H O H O P O C H 3 O O H C H 3 O O 2-fosfoglicolato (PGA) Metil glioxal fosfato Metil glioxal A.- Reacción catalizada por la triosafosfato isomerasa; B.- Inhibidores de su catálisis. Nótese el parecido con la estructura de los sustratos y del intermediario

9 REGULACIÓN La actividad enzimática puede ser regulada, esto quiere decir que dependiendo de los requerimientos metabólicos, las enzimas son activadas o inhibidas, para acelerar o disminuir la velocidad con la que catalizan la reacción, respondiendo así a las diferentes necesidades de sus productos en la célula. La regulación más común es modificando la concentración de su(s) substrato(s).

10 FACTORES QUE AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO

11 Velocidad máxima: la velocidad de una reacción (v) es el número de moléculas de substrato convertidas en producto por unidad de tiempo y usualmente se expresa en µmoles de producto formadas por minuto. La velocidad de una reacción catalizada por una enzima, aumenta conforme se incrementa la concentración de substrato hasta que se llega a una velocidad máxima (Vmax), a partir de la cual la velocidad de la reacción, es independiente de la cantidad de substrato. El que la velocidad no pueda seguirse incrementando, refleja la saturación del sitio activo con el substrato. Figura: representación de una cinética típicamente michaeliana. Vmax = velocidad de saturación o máxima. V MAX. 0 Substrato

12 FORMA HIPERBÓLICA DE LA CURVA DE VELOCIDAD V/S SUSTRATO La mayoría de las enzimas muestran cinéticas del tipo hipérbola rectangular como describieron en 1913 por primera vez Leonor Michaelis y Maud Menten. Este trazo se obtiene al graficar la velocidad de la reacción enzimática vs. La concentración de Substrato; este comportamiento se describe por ejemplo para la disociación del Oxígeno de la mioglobina. Existen algunas enzimas que se denominan alostéricas, que frecuentemente poseen una curva tipo sigmoide (en forma de S), que es similar a la mostrada para la disociación del Oxígeno de la hemoglobina. Hiperbólica (comportamiento cinético michaeliano) Sigmoide (comportamiento cinético alostérico) 0 Substrato

13 Michaelis y Menten propusieron un modelo simple para explicar la mayoría de las reacciones catalizadas por enzimas. En este modelo la enzima se combina reversiblemente con su substrato para formar el complejo enzima-sustrato (ES) que subsecuentemente se rompe para formar el producto, hecho que regenera a la enzima. El modelo para una molécula de sustrato se muestra a continuación: S: es el substrato E: es la enzima ES: es el complejo enzima substrato o complejo de Michaelis y Menten k1,k1 y k2 son las constantes de velocidad de la reacción. E S k1 k 1 ES k2 E P

14 La ecuación de Michaelis y Menten describe como varía la velocidad de reacción con la concentración de sustrato: v 0 Vmax Km S S V 0 : es la velocidad inicial de la reacción Vmax: es la velocidad máxima Km:es la constante de Michaelis y Menten= S :es la concentración de sustrato k1 k2 k1

15 CONCLUSIONES IMPORTANTES SOBRE LA CINÉTICA MICHAELIS-MENTEN Características de Km: la constante de Michaelis-Menten es característica de una enzima y particular para un substrato. Refleja la afinidad de la enzima por ese substrato. Km es numéricamente igual a la concentración de substrato a la cual la velocidad de reacción es la mitad de la Vmax (Km= Vmax/2). Este parámetro, Km no varía con la concentración de enzima. Significado de una Km pequeña: un valor numérico pequeño de Km refleja una alta afinidad de la enzima por su substrato porque a una baja concentración del mismo, la enzima a desarrollado ya la mitad de la velocidad máxima. Significado de una Km grande: el valor numérico grande de Km refleja una baja afinidad de la enzima por su substrato porque a una concentración elevada del mismo, la enzima desarrolla la mitad de la velocidad máxima.

16 Relación de la velocidad con la concentración de enzima: la velocidad de la reacción es directamente proporcional a la concentración de la enzima a cualquier concentración de substrato. Por ejemplo, si la concentración de enzima es disminuida a la mitad, la velocidad inicial de la reacción (v0) es reducida también a la mitad de la original. Orden de la reacción: cuando S es mas pequeña que la Km, la velocidad de la reacción es aproximadamente igual a la concentración de substrato. La velocidad de reacción se dice en estas condiciones es de primer orden con respecto al substrato. Cuando S es mas grande que la Km, la velocidad es constante e igual a la Vmax. La velocidad de la reacción es independiente de la concentración de substrato y se dice que es de orden cero con respecto a la concentración de substrato.

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18 GRÁFICA DE LINEWEAR-BURKE Se grafica una doble recíproca, es decir, el inverso de la velocidad (1/v 0 ) contra el inverso de la concentración de substrato (1/ S ), se obtiene una línea recta. El regráfico de Lineweaver-Burke, también se denomina de dobles recíprocas y se utiliza para calcular la Km y la Vmax así como para determinar el mecanismo de acción de los diversos tipos de inhibidores. 1 v0 Km Vmax S 1 Vmax La ecuación describe una recta en donde el intercepto con el eje de las abscisas es igual a 1/Km y el intercepto con el eje de las ordenadas es igual a 1/Vmax.

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20 EFECTO DE LA TEMPERATURA Incremento de la velocidad con la temperatura: En general, la velocidad de la reacción se incrementa con la temperatura hasta que un punto máximo es alcanzado. Este incremento se debe a que aumenta el número de moléculas ricas en energía que pueden pasar la barrera energética de estado de transición, para formar a los productos. zona de reactivación máximo de actividad Zona de inactivación 0 Temperatura Decremento de la velocidad con la temperatura: La elevación excesiva de la temperatura del medio que contiene a las enzimas, resulta en un decremento de la velocidad como resultado de la desnaturalización, es decir, la pérdida de la estructura tridimensional de las enzimas.

21 EFECTO DEL ph Efecto del ph en la ionización del sitio activo La concentración de H+ afecta la velocidad de la reacción en muchas formas. Primero el proceso catalítico usualmente requiere de que la enzima y el substrato tengan grupos químicos en una forma iónica particular para poder interactuar. Por ejemplo la actividad catalítica puede necesitar a un grupo amino, por ejemplo de una lisina en estado protonado (-NH 3 +) o no (-NH 2 +), el ph modifica este estado y por tanto a la velocidad de la reacción.

22 Efecto del ph: desnaturalización de la enzima ph extremos pueden ocasionar la desnaturalización de las enzimas, debido a que la estructura con estos cambios es posible modificar las interacciones iónicas que intervienen en la estabilidad de la enzima en su estado nativo. El ph óptimo varía para las diferentes enzimas: el ph al cual las enzimas adquieren su máxima actividad es diferente para cada una de ellas y depende de la secuencia de aminoácidos que las conforman, por supuesto, también está relacionado con el microambiente celular en el cual desarrollan su catálisis. Por ejemplo la pepsina que es una enzima digestiva que actúa en el estómago, posee un ph óptimo de alrededor de 2 unidades, por el contrario otras enzimas que actúan a ph neutro, se desnaturalizan a ph alcalino o ácido.

23 NOMENCLATURA La international Union of Biochemistry recomendó en 1964 una nomenclatura basada en la reacción que catalizan. En 1973 apareció una nueva edición ampliada de esta nomenclatura donde el nombre científico describe el tipo de reacción, el sustrato, el coenzima y el producto. (Ej. LDH: L-lactato:piruvato NAD deshidrogenasa) Además a cada enzima se le da un número que deriva de la nomenclatura, encabezado por las siglas EC (Enzyme Commission). Así la LDH es la EC Para una descripción más exacta es necesario indicar la procedencia del enzima, especie, tejido, localización en el interior o exterior de la célula dado que existen isoenzimas con el mismo nombre y N EC, pero se diferencian en su localización y/o propiedades físico químicas.

24 Nomenclatura enzimática Clase Reacciones que catalizan Ejemplo Clase 1 Oxido- Reductasas Clase 2 Transferasas Clase 3 Hidrolasas Clase 4 Liasas Clase 5 Isomerasas Clase 6 Ligasas Deshidrogenasas Catalizan reacciones de oxidación reducción. A + B A reducido + B oxidado Oxidasas Reductasas Catalizan reacciones de transferencia de grupos funcionales, partes de moléculas, etc., de un donador a un aceptor. A B + C A + B-C Catalizan reacciones de hidrólisis de enlaces al añadir una molécula de agua. A-B + H 2 O A-H + B-OH Transaminasas Lipasas Amilasas Peptidasas Catalizan reacciones de eliminación o adición de alguna molécula, grupo funcional, etc. A-CO 2 A + CO 2 Descarboxilasa Catalizan reacciones de isomerización. A A Catalizan reacciones de condensación de dos moléculas por formación de un enlace a costa de la hidrólisis de un trifosfato. A + B + NTP A-B + NDP + Pi Epimerasas Mutarotasas Sintetasas

25 ENZIMAS ANALIZADAS EN DIAGNÓSTICO CLINICO

26 Transaminasa glutámico oxalacética o aspartato aminotransferasa (GOT o AST). Grupo: Transaminasa Reacción catalizada Transferencia del grupo amino del ácido aspártico al ácido a- cetoglutárico, formándose ácido oxalacético y ác. Glutámico. Presenta como cofactor el piridoxal fosfato (PP). Las determinaciones suelen hacerse a ph = 7,4 Localización Patologías En mitocondrias y citoplasma de tejido cardiaco, hepático muscular, hematíes, tejido esquelético, renal y uretral, en concentraciones decrecientes respectivamente. Hepatopatías, Miopatías, Procesos cardíacos. Lactato Deshidrogenasa (LDH). Grupo: oxidorreductasa Reacción catalizada Transformación reversible de lactato a piruvato (ph=8,3-8,9) y de piruvato a lactato (ph = 7,1 7,4). No necesita cofactor. Localización Patologías Ampliamente distribuida por los tejidos aunque abunda más en tejido cardíaco, muscular, renal, hepático, cerebral y los hematíes. Hepatopatías Procesos cardíacos.

27 Transaminasa glutámico pirúvica o alanino aminotransferasa (GPT o ALT). Grupo Transaminasa Reacción catalizada Localización Patologías Creatín fosfoquinasa (CPK). Grupo Tranferasa Reacción catalizada Localización Patologías Transferencia del grupo amino desde la alanina al cetoglutarato, formando ác. Pirúvico y ác. Glutámico. Presenta como cofactor el piridoxal fosfato (PP). Las determinaciones suelen hacerse a ph = 7,4 Su localización es citoplasmática en el tejido hepático aunque también en bajas concentraciones en tejido muscular, renal y cardíaco. Hepatopatías, Miopatías Transformación de fosfocreatina a creatina. (ph=6,8) y de creatina a fosfocreatina (ph=9,0). Necesita la presencia de cofactores metálicos (activadores) como el Mg 2+. Su concentración es muy elevada en músculos esquelético y cardíaco, encontrándose en el cerebro en concentraciones también bastante apreciables. Miopatías Procesos cardíacos.

28 g-glutamiltranspeptidasa (g-gt). Grupo: Transferasas Reacción catalizada Localización Transferencia de grupos g-glutamil desde un péptido a otro péptido o a aminoácidos. No necesita la presencia de cofactor. Se encuentra fundamentalmente en el citoplasma de células hepáticas, riñón, intestino y páncreas. Patologías Hepatopatías Reacción catalizada Localización Patologías A-amilasa. Grupo: Hidrolasas Degradación de moléculas hidrocarbonadas por hidrólisis de enlaces glicosídicos a 1-4 de los polisacáridos transformándolos en sus azúcares constitutivos. Necesita calcio como cofactor (es una de las metaloenzimas.). Se encuentra fundamentalmente en glándulas salivares y páncreas exocrino. Enfermedades del páncreas.

29 Reacción catalizada Localización Patologías Lipasa. Grupo: Hidrolasas Junto con los ácidos biliares cataliza la reacción de hidrólisis de triglicéridos Su localización es pancreática. Enfermedades del páncreas. Reacción catalizada Localización Patologías Fosfatasa Alcalina (ALP). Grupo Hidrolasas Descomposición de los ésteres monofosfato. Precisa del cofactor Mg +2. Presenta su actividad óptima a ph alcalinos cercanos a 9. Fundamentalmente el huesos pero también en hígado, riñón, pared intestinal, glándula mamaria y placenta. Enfermedades óseas.

30 Reacción catalizada Localización Fosfatasa ácida. Grupo: Hidrolasas Descomposición de los ésteres monofosfato. Precisa del cofactor Mg2+. Presenta su actividad óptima a ph ácidos cercanos a 5. Se localiza fundamentalmente en la próstata y en menor concentración en hígado, hematíes, plaquetas y hueso. Patologías Carcinoma próstatico.

31 PROXIMA SESION DETERMINACIÓN ANALÍTICA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA. PRINCIPIOS DE ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIÓN MOLECULAR.