MICROSCOPIA. Dr. José A. Gutiérrez Bustamante Area de Genética y Biología Molecular y Celular Dpto. de Morfología Humana Fac.

Transcripción

1 MICROSCOPIA Dr. José A. Gutiérrez Bustamante Area de Genética y Biología Molecular y Celular Dpto. de Morfología Humana Fac. de Medicina UNT

2 La Accademia dei Linceii publica un trabajo sobre la observación microscópica del aspecto de una abeja GALILEO GALILEI

3 MALPIGHI En 1660 y 1665 Malpighi observa los capilares sanguíneos y Hooke publica su obra Micrographia

4 ANTONY VAN LEENWENHOEK En el siglo XVII, utilizando microscopios simples de fabricación propia describió por primera vez protozoos, bacterias, espermatozoides y glóbulos rojos

5 MICROSCOPIO DE LEEUWENHOEK

6 CARACTERÍSTICAS DEL MICROSCOPIO DE LEEUWENHOEK Dos lupas combinadas 260 aumentos, Visualizó algunos protozoos e infusorios

7 MICROSCOPIOS DEL SIGLO XVIII

8 CALR ZEISS Mejora la microscopía de inmersión Sustituye el agua por aceite de cedro Obtiene 2000 aumentos

9 FUNDAMENTO DE LA MICROSCOPÍA Cuando el observador se acerca, el objeto se agranda Si se aumenta el ángulo visual se ve con claridad

10 EVOLUCIÓN DEL MICROSCOPIO

11 ESQUEMA DEL MICROSCOPIO Un tubo cilíndrico aloja el sistema óptico ocular/objetivo. Una platina de original diseño permite observar las preparaciones, que son iluminadas por un espejo cóncavo que concentra la luz sobre el objeto a estudiar.

12 PARÁMETROS ÓPTICOS Aumento Poder de resolución Nº de campo Profundidad de foco Contraste

13 AUMENTO Se calcula multiplicando el aumento del objetivo por el aumento del ocular

14 PODER DE RESOLUCIÓN Distancia si dos puntos se distinguen Mayor, cuando menor es la longitud de onda Mayor, cuanto mas grande es la apertura numérica Mayor, con aceite de cedro

15 MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO

16 PARTE MECÁNICA QUE SE PUEDE DESMONTAR Estativo Cabezal Tornillos de la platina Oculares Objetivos Condensador

17 SISTEMA DE SOPORTE O ESTATIVO Tubo Platina Brazo Píe

18 SISTEMA DE AJUSTE (1) Anillo de ajuste de los oculares Tornillos del condensador Tornillo que permite mover el cabezal Palanca de cierre del diafragma Tornillos reguladores de la platina

19 SISTEMA DE ENFOQUE Freno Tornillo macrométrico Tornillo micrométric o

20 PLATINA Pinza Escala

21 PARTE ÓPTICA Sistema de iluminación: fuente de luz, condensador y diafragma Lentes: objetivos y oculares

22 SISTEMA DE ILUMINACIÓN: FUENTE DE LUZ Filtro Suele ser una lámpara halógena de intensidad graduable Se enciende y apaga con un interruptor En el exterior puede tener un filtro Lámpara Interruptor y graduación de la luz

23 CONDENSADOR Y DIAFRAGMA Condensador: concentra la luz de la lámpara en un punto de la preparación Diafragma o iris (está dentro del condensador):si se cierra mejora el contraste, pero empeora la resolución

24 LENTES: OBJETIVOS Están colocados en el revolver Tienen un sistema de amortiguación Un anillo coloreado indica los aumentos Son de 4, 10, 40 y 100 (inmersión) aumentos

25 OBJETIVOS Rojo 4x Amarillo 10x Blanco 100x Azul 40x Amortiguación

26 LENTES: OCULARES Ajuste de la distancia interpupilar Oculares

27 OCULARES: 10x; 15x; 20x

28 MATERIAL NECESARIO: PORTAS Y CUBRES

29 ACEITE DE INMERSIÓN De baja, media y alta viscosidad Es imprescindible con el objetivo de inmersión (100x)

30 MANEJO DEL MICROSCOPIO 1. No poner la preparación al revés 2. Regular la luz a intensidad media 3. Ajustar condensador y diafragma al medio 4. Empezar por poco aumento 5. Mirando por fuera subir la platina 6. Enfocar y ajustar 7. Pasar al siguiente aumento y enfocar 8. Al acabar retirar la preparación 9. Apagar la luz

31 CONSERVACIÓN DEL MICROSCOPIO Ponerle su funda al guardarlo Limpieza de lentes con papel de gafas El exceso de xilol al limpiar las lentes desgasta el cemento Usar pincel y pera de aire

32 TIPOS DE MICROSCOPIOS Microscopio Óptico Simple Lupa Tipos de Microscopio óptico Microscopio Óptico Compuesto M.O. Normal Campo oscuro Contraste de fases Fluorescencia microscopios Microscopio electrónico Transmisión Barrido Digital Efecto túnel o cuántico

33 PODER DE OBSERVACIÓN DEL MICROSCOPIO

34 MICROSCOPÍA DE CONTRASTE DE FASES VENTAJAS Examina la estructura de los organelos Observa el movimiento de los organelos, núcleo y mitocondrias Observa células vivas en cultivo DESVENTAJA Observa células individuales Células epiteliales 20 x

35 MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA Células epiteliales 200 x Aplicaciones Detecta proteínas específicas Revela organelos dentro de la célula Limitaciones En cortes celulares finos Utiliza fijadores que destruyen la antigenicidad de las proteínas

36 ERNST RUSKA El microscopio electrónico de transmisión (T.E.M.) consiguió aumentos de X. Fue desarrollado por Max Knoll y Ernst Ruska en Alemania en 1931

37 PRIMER MICROSCOPIO ELECTRONICO Utilizó un haz de electrones en lugar de luz para enfocar la muestra. Posteriormente, en 1942 se desarrolla el microscopio electrónico de barrido (SEM).

38 MICROSCOPIO ELECTRÓNICO

39 MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO Obtiene una imagen tridimensional Tamaño pequeño y sencillo Utiliza los e- dispersos a partir de la superficie de la muestra

40 M.E. DE BARRIDO Glóbulo blanco

41 M.E. DE TRANSMISIÓN Similar al óptico pero de mayor tamaño Complejo e invertido Utiliza electrones que atravieza la muestra Bacilos en división

42 COMPARACION

43 Coloración: es el proceso mediante el cual un cuerpo es teñido por una sustancia colorante, sin perder el color cuando es lavado con el disolvente. Ortocromáticas: los tejidos adquieren un color igual al colorante. Metacromáticas: componente celular se tiñe con un color diferente. Métodos de coloración: -Coloración directa: existe afinidad entre el colorante y el objeto. - Coloración indirecta: requiere la intervención de mordientes. - Coloración progresiva: se hace actuar el colorante hasta su punto óptimo. - Coloración regresiva: se realiza primero una sobrecoloración y luego se elimina el resto del colorante por medio de diferenciadores. - Coloración simple: se colorean algunos elementos del preparado. - Coloración combinada: colorea los elementos nucleares y citoplasmáticos. - Coloración panóptica: coloración combinada realizada sucesivamente por colorantes neutros (May-Grünwald-Giemsa). - Coloración pancrómica: en un solo baño colorante actúan todos los colorantes neutros que se necesiten.

44 Colorantes: reciben esta denominación las sustancias que pueden conferir color a otros cuerpos. Clasificación de los colorantes: Según su origen : COLORANTES NATURALES: - Animales carmín - Vegetales hematoxilina, orceína, azafrán COLORANTES ARTIFICIALES O SINTÉTICOS : - Ácidos: eosina o eosinato de sodio. Son colorantes citoplasmáticos. - Básicos: azul de metileno. Son colorantes nucleares. - Neutros: Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro. - Indiferentes: Sudán lll, rojo escarlata.

45 FIJACION La fijación tiene por objeto matar las células y conservarlas, en el estado en que se encontraban durante la vida. Es un método histológico destinado a obtener preparados duraderos que conservan la estructura morfológica y química de las células y tejidos al estado vivo

46 CUALIDADES DE UN FIJADOR 1. Actuar con rapidez, matando y fijando a las células. 2. Poseer alto poder de penetración. 3. Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban in vivo. 4. Permitir el empleo de los procedimientos necesarios para su observación posterior. 5. Impedir la desaparición de los 6. elementos solubles durante la fijación o después de ella. 7. No provocar la producción de estructuras artificiales. 8. No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos quebradizos.

47 TIPOS DE FIJADORES Fijadores Químicos: Fijadores simples: Constituido por una sola sustancia quimica FIJADORES SIMPLES: a) Formol al 10% b) Alcohol etílico absoluto o de 96%. c) Alcohol metílico d) Ácido ósmico al 1 ó 2%, e) Bicromato de potasio al 3-5%.

48 Fijadores compuestos: Utiliza dos o mas fijadores simples a) Líquido de Fleming, mezcla cromo-osmio-acética. b) Líquido de Zenker, mezcla bicromato-sublimadoacética. c) Líquido de Helly, mezcla Zenker-formol. d) Líquido de Bouin, mezcla picro-formos-acética. e) Liquido de Bouin alcohólico. Fijadores Físicos: 1. Desecación. 2. Calor seco. 3. Calor húmedo. 4. Frío.