Trazabilidad de Mejillón chileno (Mytilus chilensis) usando marcadores microsatélites INTRODUCCIÓN
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- Rosa Moreno Benítez
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1 Trazabilidad de Mejillón chileno (Mytilus chilensis) usando marcadores microsatélites María Angélica Larraín, Nelson. F. Díaz, Carlos Vargas, Carla Uribe, Pía González y Cristián Araneda mlarrain@uchile.cl Mejillones Grupo heterogéneo que incluye varios géneros: (Mytilus, Perna, Aulacomya, Semimytilus, Perumytilus, Choromytilus y Brachiodontes). Mytilus: Distribuido en zonas temperadas Patrón sub-tropical Clasificación taxonómica dentro del género Santaclara et al (2006) 1
2 Desembarque nacional de choritos (M.chilensis) Miles de toneladas Año Sernapesca 2012 Requisitos Calidad Grado en que un conjunto de características inherentes cumple con los requisitos (ISO 9000:2005) Inocuidad Garantía de que los alimentos no causarán daño al consumidor cuando se preparen y/o consuman de acuerdo con el uso al que se destinan (Codex Alimentarius, 2003) Trazabilidad Identificación de la especie Determinación del origen geográfico Seguimiento a través de la cadena Capacidad para seguir el desplazamiento de un alimento a través de una o varias etapas especificadas de su producción, transformación y distribución (Codex alimentarius, 2006) 2
3 Verificación y validación Identificación de la especie Necesidad de contar con herramientas analíticas que permitan verificar los sistemas de trazabilidad administrativa. Seguimiento a travésde la cadena alimentaria Origen geográfico Trazabilidad genética Verificación y validación Identificación de los animales y sus productos a través del estudio del ADN (Dalvit et al, 2007). Marcadores moleculares Lugares físicos e identificables en el ADN. Presentan variantes alélicas, producto de mutaciones polimorfismo. identificar individuos, poblaciones, especies o grupos de interés. Género y especie específicos. Microsatélite. 3
4 OBJETIVO Evaluar el desempeño de una batería de marcadores microsatélite (SSR) y especie específicos (RFLP-PCR) en Mytilus sp. del sur de Chile para hacer trazabilidad a diferentes niveles (identificación de la especie y determinación del origen geográfico). 1. Identificar la especie de los individuos muestreados. 2. Establecer la diversidad genética y estructura poblacional de esta especie en el sur de Chile. 3. Determinar la efectividad de la asignación de individuos a localidades para verificar la trazabilidad. MATERIALES Y MÉTODOS Muestras 11 lugares (n=50) 1 banco natural 5 centros de captación 5 centros de engorda Localidad IP Isla Peel PA Piedra Azul PI Pichicolo LA Caleta La Arena CC Canal Caicaén EC Estero Chauquiar CN Canutillar CH Canal Chidguapi EH Estero Chope CB Canal Coldita - Piedra Blanca CP Canal Coldita - Patagonia 4
5 Muestras MATERIALES Y MÉTODOS Métodos Identificación de la especie PCR RFLP AciI (Me 15-16). Género: PCR-RFLP BsaHI (Mus RFLP) Diversidad genética y estructura poblacional Nº de alelos por locus (A), Heterocigosidad observada (Ho) y esperada (He), Contenido de Información Polimórfica (PIC) y alelos privados MATERIALES Y MÉTODOS Diferenciación genética entre localidades y global F ST Asignación de individuos a localidades Probabilidad que el genotipo multilocus del individuo se encuentre en una localidad dada. Desempeño de algoritmos Reasignación Sensibilidad, Especificidad, Probabilidad de asignación correcta a la categoría, Razón de verosimilitud. Verificar trazabilidad física o administrativa Asignación 5
6 Identificación de la especie Basándose en el marcador Me RFLP Aci I: M. chilensis es la especie principal presente en la región. Se encontraron alelos de M. galloprovincialis y M. trossulus. Loci microsatélite seleccionados 6
7 Diversidad genética 9 loci en 550 individuos => 68 alelos polimórficos en todas las localidades => 6,7 ± 0,2 alelos/ locus Distribución de alelos loci mostraron distribución de alelos comunes en las localidades. Solo se encontraron 2 alelos privados Índice de fijación F ST => medida de la subdivisión de la población. F ST global = 0,0547 (P = 0,00) Variación genética entre los individuos: 5,5% se debe a diferencias encontradas entre localidades 94,5% se debe a diferencias entre los individuos dentro de las localidades Estructura poblacional de M. chilensis en la zona es baja pero significativa. Desempeño de algoritmos Reasignación Programa Criterio Asignación correcta Localidad Algoritmo Nº individuos (%) IP PA PI LA CN CB Total GeneClass ,7 S 0,52 0,48 0,36 0,80 0,32 0,56 0,51 Frecuencia E 0,89 0,88 0,86 0,96 0,83 0,80 0,87 (Paetkau et al, 1995) PA 0,74 0,72 0,62 0,90 0,62 0,75 0,73 LR+ 4,73 4,00 2,57 20,00 1,88 2,80 6,00 GeneClass ,7 S 0,46 0,54 0,26 0,80 0,28 0,70 0,51 Distancia genética Nei (1983) E 0,94 0,88 0,89 0,94 0,83 0,73 0,87 (Cornuet et al, 1999) PA 0,19 0,19 0,18 0,20 0,18 0,19 0,19 LR+ 7,67 4,50 2,36 13,33 1,65 2,59 5,35 Structure ,0 S 0,28 0,34 0,26 0,56 0,24 0,42 0,35 Bayesiano sin información previa E 0,83 0,86 0,87 0,95 0,84 0,87 0,87 (Prichard et al, 2000) PA 0,79 0,70 0,70 0,73 0,60 0,67 0,70 LR+ 1,65 2, ,20 1,50 3,23 3,67 Structure ,3 S 0,94 0,92 0,96 1,00 0,94 0,96 0,95 Bayesiano con información previa E 1,00 0,99 1,00 1,00 0,98 0,99 0,99 (Prichard et al, 2000) PA 0,94 0,94 0,91 0,98 0,91 0,96 0,94 LR+ 92,00 47,00 96,00 - Algoritmo de Paetkau et al, (1995) dónde la frecuencia del genotipo multilocus del individuo sea mas probable. Numero de asignaciones correctas y mayor probabilidad de asignación. 7
8 Asignación Verificación Asignación de individuos de centros de engorda a banco natural y centros de captación de semillas usando criterio frecuentista en programa GeneClass2 CONCLUSIONES Basándose en el marcador especie específico Me AciI RFLP, M. chilensis es la principal especie presente en la región, sin embargo se encontró alelos descritos para M. galloprovincialis y M. trossulus. La estructura poblacional de M. chilensis en el sur de Chile detectada usando 9 loci microsatélite es baja aunque significativa y hace posible verificar la trazabilidad y origen geográfico de las semillas de M. chilensis en la zona. En todos los métodos de asignación utilizados, la proporción de asignaciones correctas fue mayor que la esperada por azar, lo que confirma la estructuración poblacional de M. chilensis. 8
9 AGRADECIMIENTOS Universidad de Chile, Vicerrectoría de Investigación. Proyecto Domeyko Alimentos por financiamiento de este trabajo. CONICYT Programa de formación de capital humano avanzado. Beca de apoyo a la realización de la tesis doctoral 2011 AT por financiamiento de este trabajo. Universidad de Santiago de Chile, Programa de Doctorado en Ciencia y Tecnología de los Alimentos. Trazabilidad de Mejillón chileno (Mytilus chilensis) usando marcadores microsatélites María Angélica Larraín, Nelson. F. Díaz, Carlos Vargas, Carla Uribe, Pía González y Cristián Araneda mlarrain@uchile.cl 9
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