TEST DIAGNÓSTICOS IN VITRO DE REACCIONES DE HIPERSENSIBILIDAD INMEDIATA

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1 TEST DIAGNÓSTICOS IN VITRO DE REACCIONES DE HIPERSENSIBILIDAD INMEDIATA Dra. Dorimar Brugaletta Matheus Residente Alergología del Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca Murcia (España) MECANISMOS DE HIPERSENSIBILIDAD Dra. Dorimar Brugaletta Matheus 1

2 Generalidades La IgE fue descubierta en En condiciones normales esta inmunoglobulina se encuentra presente en suero en concentraciones muy bajas (del orden del 0,004 mg/100 ml). Sólo los inmunoensayos enzimáticos o los radioinmunoensayos, técnicas con alta sensibilidad, son capaces de cuantificar esta inmunoglobulina. La tecnología aplicada varía mucho de unos métodos a otros, dependiendo de las características de los extractos alergénicos, tipo de fijación al soporte sólido, afinidad de los anticuerpos anti-ige utilizados y criterio de positividad de cada fabricante. Además, influyen las variaciones inter e intra ensayo, normales en cualquier técnica diagnóstica de laboratorio. Todos estos factores hacen necesaria la validación inicial de estos ensayos para determinar su precisión y repetitividad. Dra. Dorimar Brugaletta Matheus 2

3 Diagnóstico inmunológico in vitro CUANTIFICACIÓN DE IgE: ISOTÓPICAS ELISA FLUORESCENCIA QUIMIOLUMINISCENCIA TEST DE LIBERACIÓN DE HISTAMINA. DEGRANULACIÓN ÓPTICA DE BASÓFILOS. MICROARRAY. Inmunoensayo: reacción Ag - Ac Pilar del diagnóstico in vitro en el laboratorio de alergia: detección de IgE específica. Dra. Dorimar Brugaletta Matheus 3

4 INMUNOENSAYOS MARCADOS Generalidades: Inmunoensayos en los que el Ag o Ac están marcados Rápidos, menos de 24 h. Alta sensibilidad, de microgramos a nanogramos. Automatizables, aplicaciones. Clasificación: Homogéneos, Heterogéneas. Competitivos y no competitivos. Tipos»RIA» EIA» FIA» QIA Radioinmunoensayos RAST Inmunoensayo marcaje radiactivo - Radiación beta: Tritio, carbono 14, etc. - Radiación gamma: Iodo 125, Iodo 135, etc. Ensayos esencialmente competitivos Ensayos secuénciales y en equilibrio. Dra. Dorimar Brugaletta Matheus 4

5 Fluoroinmunoensayo Determinación de proteínas, drogas y hormonas. Ac se une covalentemente a una molécula fluorescente. Método directo: Ac marcado directamente proporcional al Ag presente Método indirecto: Menor Ac fluorescente fijado, mayor será el Ag presente Enzimoinmunoensayos Ensayo marcado por una enzima. Heterogéneos. Paso intermedio o separación: - Competitivo. Ag Marcado - No competitivo (Sándwich). Ac marcado - Indirecto. Medición niveles de Ac Homogéneos. No paso intermedio Bajo coste, alto nivel de pureza y interferencia Dra. Dorimar Brugaletta Matheus 5

6 METODOLOGIA Inmuno CAP Advia Centaur Inmunolite 2000 Inmuno CAP Fluoro - Inmunoanalisis Alta capacidad de fijación del alergeno sobre una matriz. Gran versatilidad, panel más amplio de alergenos (> 450), y permite un cribado múltiple de alergenos (Phadiatop, que combina los neumoalergenos, o los alimentos más frecuentes), e investigar aquellos pacientes con resultado positivo (> 0.35 ku/l). Diseño : se trata de un Fluoroenzimoinmunoensayo clásico de tipo sándwich, alergeno fijado a fase sólida (Matriz) y a la anti IgE marcada con enzima beta galactosidasa, liberando el producto fluorescente, la 4-metil- umbeliferona. Curva de calibración obtenida con 6 calibradores de IgE total. Tiempo de realización del ensayo : 2.5 horas. Dra. Dorimar Brugaletta Matheus 6

7 Inmuno CAP 1. El alergeno covalentemente unido al unicap, reacciona con la IgE especifica del paciente 2. Lavado de IgE especificas no ligadas y se añade la enzima marcada con AC IgE para formar el complejo 3. Incubación: el complejo enzima AC-IgE no ligado es lavado y el complejo ligado es incubado en la solución de desarrollo 4. Después de para la reacción se mide el fluido fluorescente, se compara con el suero de referencia Inconvenientes Uni CAP Al ser la IgE extraordinariamente citofílica, sus resultados serán inferiores a los de las PC. Es un error conceptual pedir UniCAP porque la PC haya sido negativa. Los fármacos suelen actuar como haptenos. PC negativa o dudosa, difícilmente de encontrará IgE específica en suero. Bastante caro (sólo se deben realizar para un número limitado de alergenos). Dra. Dorimar Brugaletta Matheus 7

8 Sistema AlaSTAT Immulite 2000 Incorpora la tecnología de alergenos en fase líquida, están fijados a polímeros solubles. La unión a la fase sólida a través de la elevada afinidad de la biotina (fijada también al polímero que porta al alergeno) por la estreptavidina (que recubre la bola de poliestireno). Tecnología de lavado patentada por centrifugación a rpm : mínimas uniones inespecíficas debido a la óptima separación entre las fases ligada y no ligada. Diseño : Se trata de un enzimo-quimioinmunoanálisis. Velocidad de trabajo del analizador : 100 determinaciones/hora, con un tiempo para el primer resultado de 65 minutos. Sistema AlaSTAT : INMUNOLITE 2000 El alergeno biotinilado se une a las bolas recubiertas con Estreptavidina mediante la Botina Bola cubierta de estreptavidina se incuban con el alergeno biotilado y el suero del paciente El AC IgE (conjugado ) se une a la IgE especifica del suero y El sustrato cataliza la reacción de quimioluminiscencia Dra. Dorimar Brugaletta Matheus 8

9 Inconvenientes INMUNOLITE Al ser la IgE extraordinariamente citofílica, sus resultados serán inferiores i a los de las PC. Es un error conceptual pedirlo porque la PC haya sido negativa. Los fármacos suelen actuar como haptenos. PC negativa o dudosa, difícilmente de encontrará IgE específica en suero. Bastante caro (sólo se deben realizar para unnúmero limitado de alergenos). Sistema ADVIA-Centaur Diseño de sándwich invertido : Es la Anti-IgE la que está fijada a la fase sólida (partículas paramagnéticas) capturando sólo la totalidad de IgE que presenta el espécimen del paciente. Es el alergeno el que va a portar el marcaje luminiscente, pero no de forma directa, sino a través de la interacción biotinaestreptavidina. El ester de acridinio sometido a un cambio de ph emite luminiscencia. Velocidad de trabajo del analizador : 120 determinaciones/hora. (1º resultado de 47 minutos). Dra. Dorimar Brugaletta Matheus 9

10 Sistema ADVIA CETAUR Diseño Sándwich Invertido: La Anti IgE es la que se fija a la fase sólida y el que lleva en marcaje es el alergeno, pero no de forma directa Valoración de IgE Especifica Clase ku/l Niveles de AC 0 <0,35 Ausente o Indetectable 1 0,35-0,7 Bajo 2 0,7-3,5 Moderado 3 3,5-17,5 Alto 4 17, Elevado Elevado 6 >100 Muy elevado Dra. Dorimar Brugaletta Matheus 10

11 MICROARRAYS El objetivo de esta nueva tecnología es pasar del diagnóstico basado en extractos alergénicos (formados por conglomerados de moléculas alergénicas y no alergénicas) al diagnóstico por componentes, es decir, establecer exactamente la molécula alergénica que es la causante de la reacción. MICROARRAYS La técnica consiste en un microchip de unos de unos 5x5 mm en cuya superficie quedan fijados los 85 componentes moleculares. El suero del paciente, tras bañar dicha superficie, i permite la fijación ió de los anticuerpos, con lo que se consigue posteriormente detectar los anticuerpos IgE específicos frente a dichos componentes. La técnica nos revela con precisión el perfil de sensibilización del paciente. Dra. Dorimar Brugaletta Matheus 11

12 Ventajas Amplio abanico de agentes alergénicos que analiza en tan sólo unas horas. Realiza el análisis a un nivel molecular, de mayor precisión que los análisis convencionales que se efectúan a partir de fuentes alergénicas completas. Evitar al paciente las molestias habituales de las pruebas cutáneas, frente a un número elevado de alergenos. Reducción de los costes, ya que permite analizar 85 compuestos en una única prueba. Conclusiones: La determinación de IgE específica en el diagnóstico alergológico es una técnica útil aunque no definitiva, cuyos resultados deben ser interpretados con cautela y siempre como ayuda a la clínica que presenta el paciente, pero nunca debe considerarse de forma aislada para establecer un diagnóstico final de enfermedad alérgica Dra. Dorimar Brugaletta Matheus 12

13 Circunstancias en las que puede ser necesario utilizar de forma alternativa o complementaria algún método in vitro para detectar IgE específica: - Pacientes con medicaciones que influyan sobre el resultado de las pruebas cutáneas y que no puedan ser suspendidas. - Alteraciones cutáneas extensas, como la dermatitis atópica, que impidan la realización o valoración de las pruebas. - Pacientes con sensibilización anafiláctica a un alergeno en los que la realización de pruebas cutáneas pueda ser un riesgo. - Ayuda en el diseño y control de una inmunoterapia más adecuada para cada paciente y Protocolos de investigación. Comparativa prick test-in vitro IgE específica en suero Prick test VENTAJAS - Sin riesgos. - No interferida por medicaciones. - Valoración cuantitativa. - Mínimamente invasiva. - Resultados inmediatos. - Resultados visibles para el paciente. DESVENTAJAS Resultados demorados La negatividad no excluye sensibilización Precio Interferidos con medicamentos. Posibles contraindicaciones Posibles falsos positivos Cierto riesgo en ocasiones Valoración cualitativa Dra. Dorimar Brugaletta Matheus 13