DETERMINACIÓN DE LA BIOACTIVIDAD DE ACEITES ESENCIALES DE PLANTAS

Transcripción

1 DETERMINACIÓN DE LA BIOACTIVIDAD DE ACEITES ESENCIALES DE PLANTAS AROMÁTICAS SOBRE LA TOXICOGÉNESIS DE Fusarium verticillioides MRC 826 EN SEMILLAS DE MAÍZ COMO SUSTRATO in situ Introducción El papel de los hongos es muy importante en la descomposición de los restos vegetales, especialmente debido a la capacidad que poseen estos organismos para utilizar la celulosa. Esta aptitud es una de las causas por las que alrededor del 8% de las enfermedades de las plantas son causadas por hongos. Algunos como Claviceps purpurea infectan las estructuras reproductivas de las gramíneas (centeno), destruyéndolas mediante la formación de esclerocios ricos en alcaloides tóxicos. Plasmodiophora brassicae origina tumores y deformaciones, por alteración en la regulación de las hormonas de desarrollo, en algunas especies de la familia de las brasicáceas. Algunas especies de Fusarium son los agentes etiológicos de varias patologías de plantas y cereales (ear rot) (Sutton, 1982). En la actualidad, a pesar del extenso uso de fungicidas y otros métodos de control, las pérdidas económicas en algunos cultivos siguen siendo de gran magnitud. Para controlar las infecciones fúngicas se han desarrollado compuestos de síntesis química con diferentes resultados en las aplicaciones a campo. Inicialmente los antifúngicos fueron sales inorgánicas principalmente compuestos con cobre o mercurio; luego los compuestos órgano-metálicos, como el fenilmercurilacetato, aparecieron en el mercado y actualmente se han desarrollado antifúngicos orgánicos que no tienen componentes metálicos. El Benomil fue el primer fungicida sistémico de amplio espectro contra enfermedades de los cereales, vegetales y frutas; demostrándose que era activo a 46

2 bajas concentraciones y que actuaba en forma sistémica en las plantas (Barnes, 1984). Otros compuestos derivados del benomil son los fungicidas del grupo del bencimidazol, aunque su reducida efectividad los torna ineficientes contra algunos hongos patógenos, porque se ha visto reducida su efectividad (Georgopoulos, 1987). Desafortunadamente también se han desarrollado cepas resistentes a los inhibidores de la biosíntesis del ergosterol, fungicidas del grupo de los azoles como el triadimefón, triadimenol, bitertanol y que en un comienzo tuvieron amplio efecto contra los patógenos de los cereales y las frutas (Köller, 1992). El uso de estos biocidas de síntesis química ha conducido a una mejora importante en la producción de las cosechas de productos vegetales para consumo humano. El resultado de la aplicación de dichos compuestos, proporcionan un suministro continuo de alimentos baratos, que en un comienzo fueron bienvenidos. Sin embargo, posteriormente se originaron problemas en relación a la superproducción de cosechas (almacenaje y conservación de los granos cosechados) y excedentes. Además los consumidores están preocupándose cada vez más por la calidad de los alimentos, por los efectos de los sistemas modernos de cultivo, los métodos de almacenamiento y las consecuencias del empleo de estos procedimientos sobre el ambiente natural (Finizio et al., 25). Es posible que las repercusiones a largo plazo por la utilización de algunos biocidas puedan ser perjudiciales para la población y el medio ambiente. Pese a los resultados positivos del uso de los biocidas modernos, continúa existiendo preocupación acerca de la sensatez de incorporar grandes cantidades de productos de síntesis química en el medio ambiente. En este sentido, el uso de productos que existen naturalmente, es una alternativa viable a de los biocidas sintéticos, cuando se procura controlar las poblaciones de plagas (Robinson, 21). Los AEs aparentan ser buenos candidatos para ser utilizados como antagonistas de las infecciones fúngicas y de la producción de sus metabolitos tóxicos. Éstos poseen un conjunto de características que los hacen potencialmente ideales, una de ellas es la de presentar baja polaridad y conformar mezclas complejas de sustancias químicas. Esta última característica proporciona una ventaja adicional, ya que sería más difícil para un microorganismo desarrollar resistencia a una mezcla de compuestos químicos que a una sustancia individual, como es el caso de los biocidas de síntesis química. Además, los AEs son volátiles a temperatura ambiente lo que limita su vida media, y son sustratos naturales de otros organismos, lo que reduce su impacto en el caso de aplicaciones extensivas. 47

3 Si bien se ha demostrado la actividad antifúngica y antitoxigénica in vitro de varios AEs y de sus constituyentes contra diferentes infecciones fúngicas (Bullerman et al., 1977; Bouchra et al., 23; Farag et al., 1989; Graham & Graham, 1987; Hitokoto et al., 198), es necesario realizar estudios en sistemas in vivo que permitan determinar su impacto, para evaluar el potencial de los AEs como tratamiento preventivo. Además es necesario determinar el momento óptimo de administración, para obtener los niveles más altos de actividad. En este capítulo se utilizan los resultados de los experimentos in vitro obtenidos de los AEs de O. vulgare y A. triphylla para determinar su efectividad en la toxicogénesis de F.verticillioides en maíz, uno de los cereales más contaminados con esta cepa fúngica. 48

4 Los objetivos para el presente capítulo se enumeran a continuación: I- Seleccionar los AEs de plantas aromáticas con propiedades inhibitorias de la producción de fumonisinas por una cepa toxicogénica de F. verticillioides. II- Identificar, en el AE con mayor poder antitoxigénico, la fracción o grupo de compuestos responsables de la actividad inhibitoria de la síntesis de micotoxinas. III- Determinar en un modelo experimental diseñado para este fin, el efecto que ejerce el AE con mayor actividad antitoxigénica, sobre la capacidad de germinación de semillas de maíz Resultados I- Selección de los AEs de plantas aromáticas con propiedades inhibitorias sobre la producción de fumonisinas por una cepa toxicogénica de F. verticillioides. De los AEs de AEC, AEC, AET y AEM evaluados en el modelo bidimensional, se seleccionaron el AEC y el para probar la capacidad antitoxicogénica. Estos aceites fueron colocados a diferentes tiempos, sobre el maíz infectado con F. verticillioides, con el objetivo de investigar la influencia de los mismos sobre la biosíntesis de micotoxinas, cuando son administrados en las diferentes etapas del desarrollo de la cepa fúngica. El demostró ser el único con actividad antitoxigénica. A las semillas de maíz infectadas se le administraron los AEs luego de 5, 1, 15 y 2 días de la inoculación, de acuerdo a lo descripto en materiales y métodos en el apartado Tanto el administrado en una concentración de 3 ppm, como el AEC aplicado en una concentración de 45 ppm, a los 5, 1 y 15 días post- inoculación, no mostraron cambios significativos sobre la producción de FB 1, con respecto al control (maíz fermentado sin el agregado de AEs) (figura 9). Sin embargo en el día 2 posterior a la inoculación, los AEs mostraron diferentes actividades sobre la producción de FB 1, el exhibió un efecto inhibidor significativo con respecto al control. Por el contrario, el AEC 49

5 mostró un marcado efecto estimulante en la producción de FB 1 en oposición a los resultados obtenidos con el (figura 9). En un experimento posterior se evaluó el efecto del vehículo utilizado como solvente de los AEs sobre la toxicogénesis. Los tratamientos consistieron en la inserción de papel de filtro, utilizado como soporte, con el agregado de etanol como el agente dispersante sobre el maíz fermentado por F. verticillioides. El control consistió en maíz infectado de la misma manera que en el caso anterior, sin el agregado de los discos. Los resultados de esta experiencia permitieron observar que los discos utilizados como soporte y el agente dispersante no interfirieron con las lecturas de los tratamientos con las AEs Si bien se ha descripto la inocuidad del etanol como vehículo para compuestos poco polares, en sistemas de susceptibilidad antifúngica (Adam et al., 1998), se desarrolló un experimento independiente para cuantificar la acción de este solvente en el modelo de evaluación de la toxigénesis de FB 1 en maíz fermentado. En los resultados observados en el experimento anterior, los efectos del y del AEC demostraron actividad en el día 2. Teniendo en cuenta estos datos, para la evaluación de la inocuidad del vehículo, los discos con etanol se insertaron el día 17, 2 y 23, posterior a la inoculación del las semillas de maíz con F. verticillioides. Los resultados de estos experimentos se observan en la figura 1. Mediante el estudio estadístico de los datos (ANOVA, Tukey y Bonferroni) se concluyó que el etanol no indujo variaciones significativas con respecto al control, en las concentraciones de FB 1 en ninguno de los tres períodos estudiados. 5

6 ugfb1/ml Días post- Inoculació Oregano Control Cedrón Figura 9: Efectos de los AEs de orégano y cedrón sobre la biosíntesis de FB 1 por F. verticillioides MRC 826 en maíz. F. verticillioides fue agregado y cultivado a 27 C en oscuridad por 28 días. Los AEs de O. vulgare ( 3 ppm) y A. triphylla (AEC 45 ppm) fueron colocados a los 5, 1, 15 y 2 días postinoculación de la cepa fúngica. Las concentraciones de FB 1 fueron comparadas con las obtenidas en maíz inoculado con la cepa fúngica incubado por 28 días (control). Los resultados se expresan como promedio ± ES de cinco determinaciones para cada tratamiento. : P<.1, : P< ug FB1/mL Días post- Inoculació Control Figura 1: Evaluación de los efectos del etanol (vehículo de los AEs) sobre la biosíntesis de FB 1 por F. verticillioides MRC 826 en maíz. F. verticillioides fue agregado y cultivado a 27 C en oscuridad por 28 días. El etanol fué colocado a los 17, 2 y 23 días post-inoculación de la cepa fúngica. Las concentraciones de FB 1 fueron comparadas con las obtenidas en maíz inoculado con la cepa fúngica sin agregados, incubado por 28 días (control). El experimento se repitió tres veces y los resultados se expresan como promedio ± ES de diez determinaciones para cada tratamiento. 51

7 II- Identificación de la fracción o grupo de compuestos responsables de la actividad inhibitoria de la síntesis de la toxina, en el AE que presentó mayor poder antitoxigénico. Con los experimentos anteriores se pudo observar que el inhibió la producción de FB 1 y que este efecto inhibitorio fue mayor cuando el se agregó en el día 2 post- inoculación. En una etapa posterior se diseñaron experimentos para comparar los efectos del completo y sus dos componentes mayoritarios: timol y terpineol. Las concentraciones del fueron seleccionadas teniendo en cuenta los resultados obtenidos previamente. Para estos ensayos se utilizaron 2 ppm (correspondiente a la máxima concentración que no produjo ningún efecto sobre el desarrollo de F. verticillioides en el modelo bidimensional) y 3 ppm (que corresponde al promedio de las concentraciones en la que se observa la mínima acción fungistático). Cuando el fue agregado en una concentración de 2 ppm, el timol y el terpineol se incorporaron en una proporción de 4 ppm. El etanol, el, el timol y el terpineol se agregaron a los 17, 2 y 23 días post - inoculación. Los resultados de estos experimentos se muestran en las figuras 14a, 14b y 14c; respectivamente. En la producción de FB 1, no se observaron diferencias significativas con respecto al control cuando el y sus componentes primarios se incorporaron en el día 17 post-inoculación de la cepa fúngica (figura 11a). Cuando el y sus fracciones mayoritarias fueron incorporados en el día 2 postinoculación (figura 11b), el indujo la producción de FB 1, mientras que el timol y el terpineol no tuvieron efectos significativos en los niveles de producción de la micotoxina. Por otra parte, si bien existió una tendencia a inducir la producción de FB 1 por acción del, no existieron diferencias significativas en este tratamiento (día 23), con respecto al control (figura 11c), consideraciones similares son aplicables para los tratamientos con timol y terpineol. 52

8 ug F B a) 4 3 u g F B b) 4 3 u g F B c) Figura 11: Modulación de la biosíntesis de FB 1 por la incorporación de 2 ppm, 4 ppm de timol y de terpineol a) 17 días; b) 2 días y c) 23 días. F. verticillioides fue agregado y cultivado a 27 C en oscuridad por 28 días. Las concentraciones de FB 1 fueron comparadas con las obtenidas en maíz inoculado con la cepa fúngica incubado por 28 días. Los resultados se expresan como el promedio ± ES de cinco determinaciones para cada tratamiento. p <,1 53

9 La determinación de ergosterol se utilizó para poder comparar la producción de FB 1 con la biomasa. Estos resultados fueron expresados como µg de FB 1 por unidad de biomasa. En el presente experimento, se utilizó una relación indirecta entre biomasa fúngica y ergosterol (Bermingham et al., 1995; Matcham et al., 1985; Seitz et al, 1977; Seitz et al, 1979) y se expresó como mg de ergosterol. Se evaluó la biomasa fúngica luego de 28 días de la inoculación. Los resultados del análisis estadístico mostraron que no hubo diferencias significativas en la cantidad de ergosterol cuantificado entre cada uno de los tratamientos realizados cuando se los insertaron a los 17, 2 y 23 días posteriores a la inoculación (figura 12). Tampoco se observaron diferencias significativas en la cantidad de ergosterol, cuando se compararon los resultados obtenidos con cada uno de los compuestos estudiados en los diferentes días de inserción. En base a estos resultados, se comparó la relación entre mg de ergosterol y µg de FB 1 producida. La evaluación de este análisis muestró que no hubo diferencias significativas entre la biomasa de F. verticillioides y la producción de FB 1 en los tratamientos, cuando éstos se insertaron a los 17 y 2 días post- inoculación. En el día 23 la relación entre producción de FB 1 y biomasa de ergosterol fue significativamente mayor en el maíz tratado con con respecto al control (figura 13). Posteriormente se evaluó el efecto del en una concentración de 3 ppm, de sus componentes mayoritarios timol y terpineol en una concentración final de 6,3 ppm (21% del aceite esencial de orégano) y una mezcla de timol y terpineol. El etanol, el, el timol, el terpineol y la mezcla se agregaron a los 17, 2 y 23 días post - inoculación. El resultado del ensayo experimental muestra los efectos inhibitorios en la biosíntesis de FB 1 con respecto al control cuando el y sus componentes mayoritarios fueron insertados el día 17 post-inoculación (figura 14a). Los resultados obtenidos demuestran que el timol fue el inhibidor más activo y además que el terpineol inhibió significativamente la toxicogénesis, con respecto al grupo control. El disminuyó la producción de FB 1, aunque en menor proporción si se lo compara con los efectos del timol y terpineol. La mezcla de terpenos (timol + terpineol), no demostró efecto inhibidor con respecto al grupo control. En la figura 14b se puede observar que los compuestos insertados en el día 2 siguen un comportamiento similar al de la experiencia anterior, en el día 17. El timol nuevamente fue el inhibidor más activo de la biosíntesis de FB 1. Podemos destacar que en menor grado el terpineol y el mostraron efectos inhibidores sobre la 54

10 toxicogénesis de F. verticillioides MRC 826. La mezcla de timol y terpineol no mostró actividad inhibitoria sobre la producción de FB 1. En el día 23 post-inoculación (figura 14c) se observó que el timol fue el inhibidor más activo, reduciendo en forma muy significativa la producción de FB 1. La mezcla de timol y terpineol y el mostraron, también, tener capacidad inhibitoria con respecto al grupo control. Por el contrario, el terpineol no mostró diferencia significativa con respecto al control en relación a este día de tratamiento. mg Erg./g maíz Día 17 Día 2 Día 23 Figura 12: Cuantificación del ergosterol para la determinación de la biomasa fúngica: incorporación de 2 ppm de, 4 ppm de timol y 4 ppm de terpineol a los 17, 2 y 23 días post-inoculación del maíz con F. verticillioides MRC 826 F. verticillioides fue agregado y cultivado a 27 C en oscuridad por 28 días. Las concentraciones de ergosterol fueron comparadas con las obtenidas en maíz inoculado con la cepa fúngica incubado por 28 días (control). Los resultados se expresan como el promedio ± ES de cinco determinaciones para cada tratamiento.,25 Coeficiente FB1/Erg,2,15,1,5 Dia 17 Dia 2 Dia 23 Figura 13: Cociente FB1/Ergosterol en maíz infectado con F. verticillioides MRC 826: Evaluación de la producción de FB 1 en relación a la biomasa fúngica en los distintos tratamientos con 2 ppm de y 6 ppm de cada uno de sus componentes mayoritarios. Los resultados se expresan como el promedio ± ES de cinco determinaciones para cada tratamiento. p <,1 55

11 ug FB1/mL a) ug FB1/mL b) ug FB1/mL c) + Figura 14: Modulación de la biosíntesis de FB 1 por la incorporación de 3 ppm, 6 ppm de timol, 6 ppm de terpineol y de mezclas de éstos a) a los 17 días post-inoculación del maíz con F. verticillioides MRC 826; b) a los 2 días y c) a los 23 días. F. verticillioides fue agregado y cultivado a 27 C en oscuridad por 28 días. Las concentraciones de FB 1 fueron comparadas con las obtenidas en maíz inoculado con la cepa fúngica incubado por 28 días (control). Los resultados se expresan como promedio ± ES de cinco determinaciones para cada tratamiento. p <,1, p <,1, p <,5 56

12 III- Determinación en un modelo experimental del efecto del y de sus componentes mayoritarios sobre la capacidad de germinación de las semillas tratadas. Para evaluar los efectos del y de sus componentes mayoritarios (timol y terpineol) sobre la capacidad de germinación de semillas de maíz se utilizaron concentraciones de 3 ppm () y 6 ppm (para cada uno de los componentes mayoritarios). Un esquema sobre este estudio se observa en la figura 15. No se observó aparición de la radícula cuando se analizaron las semillas al día siguiente de colocadas en el medio de agar. Al tercer día, el 75% de las semillas incubadas mostraron diferentes longitudes de raíces pero no se observaron diferencias significativas en el porcentaje de germinación entre los tratamientos con el (figura 16) y sus componentes en el mismo día de inserción. Cuando se observaron las placas al quinto día, la totalidad de las semillas habían germinado. No se observó diferencias significativas entre los tratamientos (figura 17). Figura 15: Modelo para el estudio de los efectos del, del timol y del terpineol in situ sobre la capacidad de germinación de la semilla de maíz. Las semillas desinfectadas se colocan en la cámara húmeda de manera similar al experimento de la toxicogénesis. Se insertaron las sustancias problemas a los 17, 2 y 23 días de colocación en la cámara húmeda y a los 29 días se seleccionaron 8 semillas para comprobar su capacidad de germinación por aparición de la radícula. n= 8. 57

13 % de semillas germinadas Dia 17 Dia 2 Dia 23 Figura 16: Porcentaje de semillas de maíz germinadas luego de 3 días de inserción en agar-agua semisólido. Las semillas fueron expuestas a la acción del, del timol y del terpineol. Las semillas desinfectadas se colocan en la cámara húmeda de manera similar al experimento de la toxicogénesis. Se insertaron las sustancias problemas a los 17, 2 y 23 días posteriores a la colocación en la cámara húmeda y a los 29 días se seleccionaron 8 semillas para comprobar su capacidad de germinación por aparición de la radícula. n= 8 12 % semillas germinadas Dia 17 Dia 2 Dia 23 Figura 17: Porcentaje de semillas de maíz germinadas luego de 5 días de inserción en agar-agua semisólido. Las semillas fueron expuestas a la acción del, del timol y del terpineol. Las semillas desinfectadas se colocan en la cámara húmeda de manera similar al experimento de la toxicogénesis. Se insertaron las sustancias problemas a los 17, 2 y 23 días posteriores a la colocación en la cámara húmeda y a los 29 días se seleccionaron 8 semillas para comprobar su capacidad de germinación por aparición de la radícula. n= 8 58

14 Conclusiones: I- El y el AEC tuvieron la mayor actividad inhibitoria en los experimentos in vitro sobre la toxicogénesis de F. verticillioides MRC 826. Sin embargo, los ensayos in vivo revelaron que no hubo correlación entre inhibición del desarrollo fúngico y producción de micotoxinas. II- Los datos de la producción de FB 1 en la toxicogénesis en maíz muestran dependencia entre las concentraciones utilizadas y los días de inserción del. En concentraciones subletales de, en las condiciones descriptas, la producción de FB 1 puede ser estimulada, sobre todo en la inserción tardía de los componentes bioactivos. La aplicación de la concentración mínima fungistática del y la de sus componentes mayoritarios tuvieron una efectiva acción inhibitoria sobre la toxicogénesis de F. verticillioides MRC 826. La cuantificación del ergosterol como indicador de biomasa demostró que no hubo variaciones significativas entre los tratamientos del y sus componentes, lo que indicaría que las concentraciones utilizadas no tuvieron efectos fungistáticos ni fungicidas sobre la cepa ensayada. III- En las concentraciones que se mostraron efectivas para inhibir la producción de FB 1, la capacidad de germinación de las semillas no fue afectada por los tratamientos de o de sus componentes mayoritarios. 59