PROCEDIMIENTO RECUENTO DE LACTOBACILLUS BULGARICUS Y STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS EN YOGURT. APHA 17 Edición, modificado. PRT Página 1 de 8

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1 PRT Página 1 de 8 1. OBJETIVO Conocer el número de Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus (microorganismos característicos del yogurt) presentes en una muestra de yogurt. 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE Se aplicará a las muestras de yogurt o en otros alimentos que se requiera su investigación. 3. FUNDAMENTO El método consiste en sembrar un volumen dado de una muestra representativa y homogénea del alimento a analizar y/o diluciones de la misma en placas Petri, utilizando medios de cultivo selectivo y en condiciones de tiempo, temperatura y exigencias de oxígeno apropiados para cada microorganismo: a) Medio MRS acidificado, seguido de una incubación anaeróbica a 37ºC ± 1º C por 72 horas para el conteo de Lactobacillus delbrueeckii subsp bulgaricus. b) Medio M17 completo seguido por un incubación a 37º C ± 1ºC por 48 horas para el conteo de Streptococcus thermophilus. Después del período de incubación, se cuentan las colonias características y se confirma mediante pruebas apropiadas y examen microscópico. El número de microorganismos característicos por gramo de muestra es calculado a partir del número de colonias obtenidas en placas cuyos niveles de dilución muestren un resultado significativo. El Reglamento Sanitario vigente en el artículo 220 estipula que los microorganismos lácticos presentes en el producto final deberán ser viables y en cantidad superior a 106 ufc/g. 4. REFERENCIAS 4.1 Standard Methods for the Examination of Dairy Products, APHA 17 Edición, capítulo ISO/DIS 7889 Yogurt-Enumeration of characteristic microorganisms-colony count technique a 37 ºC. International Organization for Standardization Norma cubana: NC ISO7889:2009 Yogurt _ Enumeración de los microorganismos característicos- técnica del conteo de colonias a 37ºC (ISO 7889:2003, IDT)

2 PRT Página 2 de 8 5. TERMINOLOGÍA 5.1 Atmósfera anaeróbica: al emplear el sobre de Anaerogen se reduce el nivel de oxígeno de la jarra por debajo de 1% en 30 minutos. El nivel resultante de dióxido de carbono oscilará entre 9 y 13 %. 5.2 AnaeroGen: Sistema generador de atmósfera anaeróbica que contiene como componente activo ácido ascórbico. La reacción del ácido ascórbico con el oxígeno es exotérmica y alcanza una temperatura de 65 º C. 5.3 Indicador anaeróbico: Es una tira de algodón impregnada en una solución indicadora redox y que permite controlar visualmente que las condiciones anaeróbicas han sido alcanzadas y mantenidas. La condición anaeróbica se visualiza por el cambio de color del rojo al blanco. 5.4 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus: Microorganismo termófilo, que forma colonias lenticulares y frecuentemente aguzadas de diámetro desde 1 mm a 3 mm en el medio MRS acidificado. Al microscopio estos microorganismos aparecen como bacilos, generalmente cortos, en ocasiones alargados. No forman esporas, son Gram positivos, no móviles y catalasa negativos. 5.5 Streptococcus thermophilus: Microorganismos termófilos que forman colonias lenticulares de diámetro desde 1 mm a 2 mm en medio M-17, bajo las condiciones especificadas en este procedimiento. Al microscopio, estos microorganismos aparecen como células ovoides o esféricas (de diámetro 0,7 µm a 0,9 µm), en pares o en cadenas largas. Son Gram positivos y catalasa negativos. 6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1 EQUIPOS Contador de colonia Incubadora regulada a 37º C ± Baño de agua termorregulado a 50ºC Equipo de incubación en atmósfera de CO2 : (jarra 3,5 L= Oxoid HP 11) Stomacher Baño de agua regulado a 47ºC ± 2ºC phmetro (jarra 2,2 l= Oxoid)

3 PRT Página 3 de MATERIALES Placas de Petri de 100 mm de diámetro Pipetas graduadas de 1 ml y 10 ml estériles Frascos Schott de 250 ml con tapa rosca para envasar los medios de cultivo Láminas portaobjetos Sobre generador de atmósfera anaeróbica (AnaeroGen): para jarra 3,5 L utilizar Oxoid AN35 (envase c/ 10 bolsitas) para jarra 2,5 L utilizar Oxoid AN25 (envase c/ 10 bolsitas) Indicador de anaerobiosis (Oxoid BR55) Espátulas estériles 6.3 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS Agua peptonada 0,1 % en frascos tapa rosca con 90 ml Agua peptonada 0,1 % en tubos graduados con 9 ml Agar M 17 con B-glicerofosfato de sodio Agar MRS Leche descremada reconstituida al 0,1% (para blancos de dilución) Reactivos Tinción de Gram Solución de lactosa al 10% Acido acético para reducir ph a 5.4 ± 0,1 en agar MRS después de la esterilización. 7. DESARROLLO Para requerimientos generales, ver ISO 8261/ IDF Yogures no afrutados: Mezclar cuidadosamente el contenido del recipiente de la muestra usando una espátula.

4 PRT Página 4 de Pesar 10 g ± 0,1 g de la muestra de ensayo en un recipiente disponible (utilizar un tubo de centrífuga de fondo redondo de cristal resistente de 200 ml o la concavidad del mezclador rotatorio o el recipiente plástico del mezclador peristáltico). 7.2 Yogures afrutados Mezclar el contenido completo del recipiente de la muestra por 1 minuto usando el mezclador Pesar 10 g ± 0,1 g de la muestra de ensayo en un recipiente disponible como se describe en Examen microscópico Realizar un examen microscópico preliminar, observando varios campos de un frotis de la muestra previamente teñida de azul de metileno, para estimar la densidad de los dos tipos de bacterias, cocos y bacilos y seleccionar el rango de dilución apropiado que será empleado para el conteo de cada tipo. 7.4 Preparación dilución primaria Tomar 10 ml o g de muestra de yogurt y colocar en un tubo con tapa rosca con 10 ml de buffer fosfato ph 7. Se tiene la dilución 1/ Preparar diluciones decimales utilizando agua peptonada 0,1 % y pipetas de 1 ml Tomar 2 ml de la dilución 1/2 y colocar en un tubo con 8 ml de agua peptonada 0,1 %. Se tiene la dilución Tomar 1 ml de la dilución 10-1 y colocar en un tubo con 9 ml de agua peptonada 0,1 %. Se tiene la dilución Repetir el punto hasta realizar la dilución Otra manera de preparar diluciones es a los 10 g preparados en 7.1 y 7.2 agregar el diluyente a estas porciones hasta una masa de porción de ensayo 50 g Mezclar por 1 minuto con el mezclador Diluir a 100 g con el diluyente para obtener una dilución Hacer diluciones decimales tomando 1 ml de dil -1 a 9 ml de agua peptonada Repetir hasta dil -7 si es necesario.

5 PRT Página 5 de Controles Realizar control de ambiente con placas con agar Plate Count Realizar control de esterilidad al agar MRS, al agar M 17 con B-glicerofosfato de sodio y al agua peptonada 0,1 %. 7.6 Inoculación e incubación Marcar placas de Petri en duplicado de la dilución 10-4, 10-5, para Lactobacillus bulgaricus Marcar placas de Petri en duplicado de la dilución 10-4, 10-5, para Streptococcus thermophilus Sembrar por duplicado en placas de Petri 1 ml de cada una de las diluciones seleccionadas Vertir 15 ml de medio Agar MRS acidificado previamente fundido y temperado a 47º C ± 2ºC en las placas marcadas para Lactobacillus bulgaricus Verter 15 ml de medio M 17 con B-glicerofosfato de sodio previamente fundido y temperado a 47º C ± 2ºC en las placas marcadas para Streptococcus thermophilus Mezclar cuidadosamente el inóculo con el medio por rotación y dejar solidificar sobre una superficie plana y fría Incubar las placas bajo las siguientes condiciones según el medio de cultivo: Las placas con agar M 17 con B-glicerofosfato de sodio en posición invertida e incubarlas a 37 ºC ± 1ºC por 48 h en aerobiosis Colocar no más de 6 placas por pila. Las pilas de placas deberán ser separadas unas de otras, de las paredes y del techo de la incubadora Las placas con Agar MRS en posición invertida en el portaplacas de la jarra incubarlas a 37ºC ± 1ºC por 72 h en atmósfera de aproximadamente 10-20% de dióxido de carbono (CO2) Colocar el porta placas dentro de la jarra Colocar no más de 6 placas por pila. Las pilas de placas deberán ser separadas unas de otras, de las paredes y de la tapa de la jarra Poner el indicador de anaerobiosis en la pared de la jarra Abrir el sobre de aluminio y extraer la bolsa de AnaeroGen.

6 PRT Página 6 de 8 Nota: la bolsita de AnaeroGen se calienta cuando es expuesta al aire Colocar la tapa de la jarra inmediatamente. Nota: El tiempo que transcurre entre que se abre el sobre de aluminio y que se cierra la jarra no debe ser mayor de 1 minuto. Una exposición mas prolongada hace disminuir la reactividad y puede dar lugar a que no se obtenga totalmente las condiciones anaeróbicas de la jarra Finalizado el período de incubación retirar las placas de la jarra Antes de abrir la jarra verificar que el indicador de anaerobiosis halla virado a color blanco. Nota: Si las placas son revisadas y requieren reincubación debe utilizarse un nuevo sobre de AnaeroGen siguiendo el proceso desde el punto Dejar por lo menos 20 a 30 minutos que la bolsita de AnaeroGen alcance la temperatura ambiente antes de eliminarla en los contenedores Eliminar la bolsita de AnaeroGen en bolsa compactadora, para enviarla como basura de riesgo a la Unidad de Ingeniería (el ISP la elimina en bolsa roja). 7.7 Conteo de colonias Seleccionar las placas que contengan entre 25 a 250 ufc. y contar las colonias características: En el agar M 17 con B-glicerofosfato de sodio, las colonias de Streptococcus thermophilus son blanquecinas de 1-2 mm de diámetro, de bordes lisos, redondas o lenticulares En el agar MRS las colonias de Lactobacillus bulgaricus son blanquecinas de 2-3 mm de diámetro, de bordes lisos o rugosos, redondas o lenticulares o en forma de estrella, convexas, suaves y opacas sin pigmento Examinar las placas bajo condiciones de luz adecuadas, para facilitar el conteo puede emplearse el contador de colonias. No cometer errores al contar restos de partículas disueltas o precipitadas de la muestra como colonias. Examinar las colonias dudosas cuidadosamente, empleando una lupa de mayor aumento requerido para distinguir las colonias de partículas extrañas.

7 PRT Página 7 de Confirmación Seleccionar las colonias de las placas usadas para el conteo tal que el número tomado de las mismas sea igual a la raíz cuadrada del conteo total de colonias Confirmar por coloración de Gram (IT ) si es necesario las características morfológicas de los microorganismos investigados Las colonias provenientes del agar MRS son bacilos Gram positivos, no formadores de esporas, generalmente largos y delgados, en cadenas o filamentos algunos presentan granulaciones internas y catalasa negativos Las colonias provenientes del agar M17 son cocos Gram positivos en cadenas o en pares, catalasa negativos La identificación de cepas dudosas puede ser realizada acorde a la ISO 9232/IDF Anotar los resultados en el registro RG Cálculo y Expresión de los resultados Calcular el recuento el número de microorganismos característicos en la muestra de ensayo usando la siguiente ecuación cuando se obtengan dos diluciones consecutivas dentro de placas normales: N = donde: Σ C [ ( 1 x n1 ) + ( 0.1 x n2 ) ] x d N = número de colonias por ml o g de producto Σ C = suma de todas las colonias contadas en todas las placas n1 = número de placas contadas de la menor dilución. n2 = número de placas contadas de la dilución consecutiva. d = dilución de la cuál fue obtenido el primer recuento Cuando no se pueda aplicar la fórmula y se obtenga promedio, el número de unidades formadoras de colonias, obtenido en las placas correspondientes a la dilución seleccionada, se multiplica por el factor de dilución correspondiente, se promedian los resultados y el valor final se expresa en ufc por gramo o por ml según corresponda.

8 PRT Página 8 de Los resultados para cada microorganismo presente en la muestra se expresan en unidades formadoras de colonias por gramo o por ml (ufc/g o ufc/ml) Si hay sólo recuentos menores a 10, reportar el número de microorganismos por gramo como: Menor que 10 x 1/d (siendo d el valor correspondiente a la dilución más baja) Si hay sólo recuentos que exceden los 250 ufc, hacer un recuento estimada de las placas que tengan un recuento más cercano a 250 ufc y multiplicar por el recíproco del valor correspondiente a la dilución más alta. Registrar como recuento estimado Los resultados deberán ser expresados como número de 1,0 a 9,9 multiplicado por la potencia de 10 apropiada El número total de microorganismos característicos, N, por gramo de muestra es igual a: Donde : N = N L + N S N L = es el valor numérico del Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus por gramo. N S = es el valor numérico de Streptococcus thermophilus por gramo. 8. REGISTROS 8.1 Registro de resultados análisis recuento de lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus en muestras de yogurt. 9. ANEXOS No Aplica

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