Métodos de secuenciación de ADN

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César Aranda Montes
hace 7 años
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1 Métodos de secuenciación de ADN Valeria Tekiel Breve historia Descubrimiento de los ácidos nucleicos 1903 Los cromosomas son unidades hereditarias 1910 Los genes están en los cromosomas 1944 El ADN es el material genético (Avery por transformación bacteriana) 1953 El ADN es una doble hélice (Watson y Crick) 1958 El ADN se duplica de manera semi-conservativa 1970 Aislamiento de enzimas de restricción 1973 Clonado de ADN en plásmidos (Boyer, Cohen, Berg) 1977 El ADN se puede secuenciar genoma del bacteriófago phi-x Invención de la PCR (Mullis) 1995 Es posible secuenciar genomas más complejos 2001 Se publica la primera versión del genoma humano Modificado de Genes VII, Lewin,

2 Método de secuenciación química Maxam y Gilbert, 1977 Método de secuenciación química Maxam y Gilbert, 1977 Dimetil sulfato: G 1- Modificación de la base Ac fórmico: purinas (G+A) Hidracina: pirimidinas (T+C) Hidracina+NaCl: C 2- eliminación de base 3- ruptura enlace Piperidina 2

3 Método de secuenciación enzimático En 1977 se desarrolla el método de secuenciamiento con terminadores de cadena Sanger F, Nicklen, S and Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 74: , Este es el procedimiento más simple y rápido, requiriendo solamente un anileamiento previo del molde y el primer, incubación de cuatro muestras...y aplicación en un gel para electroforesis. Secuenciación por el método de Sanger 3

Comparación métodos de secuenciación Maxam y Gilbert Sanger - hay síntesis de ADN (evita detenciones por estruct 2 ria ) - Secuencio directamente la hebra (efectos

4 Comparación métodos de secuenciación Maxam y Gilbert Sanger - hay síntesis de ADN (evita detenciones por estruct 2 ria ) - Secuencio directamente la hebra (efectos de drogas sobre ADN, footprinting) - Utiliza DNA polimerasa/t7/ sequenasa - Permitió evolución hacia métodos automatizados - Unico método manual para oligos pequeños 4

Secuenciación automática de ADN Basada en el método de Sanger y asociada a desarrollo de robótica y computación Cambia radioactivo por colorantes fluorescentes (floresceína/rodamina) Colorantes

5 Secuenciación automática de ADN Basada en el método de Sanger y asociada a desarrollo de robótica y computación Cambia radioactivo por colorantes fluorescentes (floresceína/rodamina) Colorantes acoplados a primer (4 reacciones) o ddntps (única reacción) Para cada ddntp un colorante diferente (4 colorantes) Muestra se corre en única calle de gel (aumenta X4 capacidad gel) Detección de fluorescencia luego de exitación por láser de argón Secuenciación automática DNA polimerasas Sequenasa Tipos de marcas ddntps marcados Actúa a 37 o C Muy buenos resultados Altas cantidades de templado Primers marcados Taq polimerasa Cycle sequencing Termoestable PCR 5

6 Propiedades de DNA polimerasas usadas para secuenciación Enzima Procesividad Tasa síntesis Act 55 o C Exonucleasa Klenow (<500 nt) (<250 nt/seg) Klenow exo - T7 DNA polim Alta (>2000 nt) Alta (>250 nt/seg) Si Sequenasa Alta Alta Taq polimerasa Interm ( nt) Si Si Termosequenasa Alta Alta Si Secuenciación automática de ADN- Pasos 1- Preparación de ADN Clonado en plásmido ( ng): cultivo---purificación por miniprep + PEG Producto de PCR (5 ng/100 bases): banda unica!! Precipitación ó Exonucleasa + Fosfatasa Cuantificación en gel 2- Primer: Universales (opc. marcados)/ específicos de secuencia - unico sitio complementario al primer en el templado - sin "mismatches" - sitio de hibridacion presente en el templado - sin sitio alternativo de hibridacion en el templado - sin estructura secundaria, especialmente en 3' - Tm: o C (la PCR de secuencia tiene una Ta de 50 o C) bases 3- PCR / Cycle sequencing Enzima: Termosequenasa // Taq polimersa dntps // Buffer ddntps (gralmente marcados) 4- Procesado post-pcr: eliminación de nucleótidos libres Precipitación con acetato de sodio/edta y etanol 5- Preparación, inyección y Corrida del gel 6- Procesado post-corrida 6

7 Secuenciación automática: Secuenciadores de capilares, 1999 Mejor calidad de datos Secuencias más largas Menor mantenimiento Automatización y fácil manejo Secuenciación automática: Secuenciadores de capilares Secuencias más largas (polímero resiste altas temperaturas reduce estructuras secundarias GC) Corridas más rápidas Lecturas más consistentes Menor cantidad de muestra Disipación de calor Detección más sensible inyecta volumen de muestra (re-inyecciones) 7

8 Secuenciación automática: Secuenciadores de capilares Automatización Muestras: placa de 96 o 384 pocillos Capilares: 4, 16, 48, 96 ó 384 Electroforesis Lavado capilares Rellenado capilares Inyección nuevas muestras Analisis de secuencias Individual: ej blastn blastx Secuencia larga: montaje 8

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