Tema 12: Genómica. Contenidos

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1 Tema 12: Genómica Griffiths AJ et al., (2000) Klug WS y Cummings MR (2006) Links to Animal Genomic Research web site and Database Resources Inma Martín-Burriel: minma@unizar.es Contenidos Introducción Genómica estructural Polimorfismos del DNA: tipos, metodología de estudio Aplicaciones de los polimorfismos Genómica funcional 1

2 Definiciones Genómica es el conjunto de ciencias y técnicas dedicadas al estudio integral del funcionamiento, el contenido, la evolución y el origen de los genomas. Es una de las áreas más vanguardistas de la Biología. La genómica usa conocimientos derivados de distintas ciencias como son: biología molecular, bioquímica, informática, estadística, matemáticas, física, etc. Genomics is a discipline in genetics concerning the study of the genomes of organisms. The field includes intensive efforts to determine the entire DNA sequence of organisms and fine-scale genetic mapping efforts. The field also includes studies of intragenomic phenomena such as heterosis, epistasis, pleiotropy and other interactions between loci and alleles within the genome. Historia de la Genómica 1977: Secuenciación completa del genoma de nt del virus ØX174 (Sanger et al.) Desarrollo de métodos de secuenciación: secuencia de genomas eucarióticos. 2

3 , Allan Maxam y Walter Gilbert Métodos de terminación de la cadena o método de Sanger Pirosecuenciación Secuenciación a gran escala (NGS) GENÓMICA Estructural Secuencia descubrimiento genes, localización Comparativa Funcional Función de los genes Regulación Compara genomas de diversas especies para elucidar las relaciones funcionales y evolutivas. Desarrollo de organismos modelo de enfermedades 3

4 Genómica Caracterización molecular de genomas completos ESTRUCTURAL: Caracterización de la naturaleza física de genomas completos FUNCIONAL: Caracterización del proteoma y de los patrones globales de expresión génica Genómica estructural Caracterización de la naturaleza física de genomas: - Polimorfismos del DNA - Cartografía Clasificación del DNA eucariota DNA eucariótico Genes funcionales de copia única Secuencias funcionales DNA de secuencia repetida Secuencias sin función conocida DNA separador Secuencias funcionales No codificantes Repeticiones heterocromatina Del centrómero Familias de genes codificantes (y pseudogenes asociados) VNTR Familias de genes dispersos Familias de genes en tándem Secuencias derivadas De transposiciones Transposones Retrotransposones 4

5 Polimorfismo genético Polimorfismo: Variante genética que aparece en la población con una frecuencia > 1% Polimorfismo bioquímico: Detección de variación al nivel del producto del gen: proteínas, enzimas Polimorfismos del DNA: Variaciones presentes en la secuencia de bases Polimorfismos producidos por mutaciones puntuales Polimorfismos del número de repeticiones en tándem morphisms.html Polimorfismos debidos a variaciones en el número de repeticiones de DNA en tándem VNTR Tamaño (Kb) Unidad repetición Método detección Satélites kb Centrifugación ClCs Elec. campos pulsados Minisatélites 0, pb Elec. Agarosa Southern Microsatélites pb 1-4pb Elec. Acrilamida Secuenciación 5

6 Polimorfismos debidos a variaciones en el número de repeticiones de DNA en tándem DNA microsatélite (STR): Short Tandem Repeat Pequeñas formaciones (generalmente < 150pb) de repeticiones en tándem de secuencias muy simples (de 1 a 4 nucleótidos) Repartidas por todo el genoma, normalmente en intrones. Frecuentes y altamente polimóficos (número medio de alelos 10) Herencia mendeliana codominante Alelo 1 CA CA CA CA CA CA Alelo 2 CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA Visualización de los microsatélites Genotipado: Secuenciación: ACGT 6

7 Implicaciones de las secuencias microsatélites en patologías: Expansión de microsatélites de trinucleótidos: Síndrome de X frágil (FMR-1) (CCG)n Distrofia miotónica (DM) (CTG)n Enfermedad de Huntington (HD) (CAG)n Ataxia de Friedreich (FA) Nueve formas de ataxia espinocerebelar (SCA) Expansión de tetranucleótidos: DM2 Expansión de pentanucleótidos: SCA10 Enfermedades humanas se han creado animales modelo Secuencias de DNA dispersas DNA basura? DNA egoista? - Regulación de la expresión? - Puntos de recombinación? - Control de la segregación de cromosomas (centrómeros) - Estabilización de los cromosomas en la replicación (telómeros) 7

8 ENCODE: Encyclopedia of DNA Elements: - Protein or non-coding RNA - Protein binding - Specific chromosome structure 8

9 Polimorfismos debidos a mutaciones puntuales Variación de un nucleótido en una posición determinada. Frecuencia:1/1000pb También conocidos como SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) 1. Cambios de bases: a. Transiciones: i. Purina Purina: ii. Pirimidina Pirimidina: b. Transversiones i. Purina Pirimidina: ii. Pirimidina Purina Alelo 1 Alelo 2 TACGAGCTA TACGGGCTA A G Purinas T C Pirimidinas SNP: Single Nucleotide Polymorphisms: Polimorfismo muy frecuente (1/300 pb) 10 a 30 millones de SNP en el genoma humano Dos posibles alternativas en cada individuo Herencia es muy estable (baja tasa de mutación 10-6 vs 10-3 de los microsatélites) Fácil estandarización Aplicaciones en la determinación de enfermedades y en farmacogenética 9

10 RFLPs-SNP Origen: mutaciones puntuales Variabilidad: 2 alelos Localización: exones, intrones, regiones reguladoras, DNA espaciador RFLPs Detección mediante enzimas de restricción: Southern Blot PCR+RFLP Normalmente determinados en exones Detección de los SNP: RFLP: Southern Blot PCR + RFLP Secuenciación Minisecuenciación Sondas específicas SSCPs PCR en tiempo real Detección de mutaciones puntuales RFLP: Alelo 1 Alelo 2 Aat II TGGACGTCT TGGATGTCT Alelo 1 Alelo 2 Sonda MCL1 10

11 Detección de mutaciones puntuales Minisequencing Marcador del DNA (genético) Gen o secuencia de DNA cuya localización en el genoma se conoce. Características: Tienen que ser polimórficos (en la población). Si es un gen no interesa la función sino las variaciones en el DNA (que pueden reflejarse en diferencias funcionales) (ej. Grupo sanguíneo). HAY POCOS GENES MARCADORES. Las variaciones en un segmento de DNA se transmiten según las reglas Mendelianas de codominancia. HAY MUCHAS SECUENCIAS MARCADORES. 11

12 Tipos de marcadores SNP (or Single nucleotide polymorphism) RFLP (or Restriction fragment length polymorphism) RAD markers (or Restriction site associated DNA markers) AFLP (or Amplified fragment length polymorphism) VNTR (or Variable number tandem repeat) Microsatellite polymorphism, SSR (or Simple sequence repeat) STR (or Short tandem repeat) SSLP (or Simple sequence length polymorphism) RAPD (or Random amplification of polymorphic DNA) SFP (or Single feature polymorphism) DArT (or Diversity Arrays Technology) Aplicaciones de los polimorfismos del DNA: Diagnóstico genético Identificación individual Construcción de los mapas génicos Ligamiento con fenotipos 12

13 Diagnóstico genético indirecto: Análisis de marcadores genéticos X Gen alterado Marcador polimórfico Mutación puntual Microsatélite RFLP Deleción Inserción Genotipo del marcador Genotipo del gen dañado 13

14 Identificación individual: Marcadores fenotípicos (HLA, Gr. Sanguíneos) Análisis de marcadores microsatélites PCR, secuenciación Fingerprinting (minisat.) Microsatélites Minisatélites Control de filiación Control de libros genalógicos Detección mediante RFLP + Southern 14

15 Mapas del genoma: Mapa genético Posiciones relativas de los genes entre si, sin anclaje físico Distancia entre marcadores determinada por la frecuencia de recombinación en la meiosis Mapa físico Posición exacta de un gen Distancia entre marcadores determinada por nº de pb Secuenciación de genomas Construcción de librerías PCR en puente Secuenciación por síntesis 15

16 Análisis bioinformático (NGS) - Preprocesado de las secuencias - Control de calidad - Alineamiento de secuencias: formación de contigs - Alineamiento con las referencias - Búsqueda de variantes Ligamiento con fenotipos Ligamiento: Identificación de regiones del genoma con un nº de alelos compartidos en individuos afectados > al esperado (en familias) Análisis de 500 pols Regiones candidatas y acotamiento de la región Alelos raros de alto riesgo Asociación: Análisis de individuos afectados no emparentados e identificación de alelos compartidos Facilidad para la obtención de muestras Necesidad de analizar miles de marcadores Alelos de acción modesta en enfermedades comunes 16

17 Secuenciación del Exoma - Alineamiento con secuencias de referencia - Eliminación de variantes comunes (dbsnp, HapMap8) - Secuenciando 3 o 4 individuos mutación causante - Riesgo de falsos negativos - Estudio de ligamiento + NGS (secuenciando familia e identificando los fragmentos cromosómicos heredados de los padres) - Confirmación con pruebas bioquímicas y funcionales Genómica funcional Los datos de la secuenciación a gran escala son el punto de partida de la genómica funcional Búsqueda de ORF en secuencias de DNA desconocidas Identificación de su función Empleo de chips (microarrays) de DNA para estudio de regulación génica 17

18 Chips de DNA Muestras de DNA ordenadas, unidas a un chip de cristal del tamaño de un cubreobjetos En un chip puede haber miles de muestras (cdna de genes conocidos) Los chips se exponen a muestras de mrna marcados procedentes de distintos tejidos (distinta fase de desarrollo, tumoral vs normal, etc.) Se miden variaciones en la expresión de los tejidos RNAseq Algorithm overview, for paired-end RNA-Seq. Lee S et al. Nucl. Acids Res. 2010;nar.gkq1015 The Author(s) Published by Oxford University Press. 18

19 Aplicaciones de la Genómica Conocimiento y comprensión de procesos patológicos Precisión de diagnóstico: Clasificación más fina (cáncer de colon, piel) Farmacogenómica respuesta individual a tratamientos, elección de quimioterapia Evaluación correcta del riesgo genético: Predicción de la agresividad tumoral Prevención conocido el riesgo genético Comenzar planes de vigilancia en riesgo de cáncer, hipercolesterolemia, hemocromatosis,.. Implicaciones del conocimiento del genoma Análisis de recién nacidos Detección de portadores Desarrollo de terapias: Terapia génica: reemplazar un gen alterado por el gen funcional Terapia basada en la genética: Diseño de nuevas drogas Tratamientos basados en las bases moleculares Elección del tratamiento Identificación de genes con interés en producción. 19

20 Videos de genómica Microarray: feature=related Jgcg&feature=related Exon Sequencing ns=em 20