CALOKIT-VACA Test inmunoenzimático para la detección de calostro en leche de vaca

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1 Test inmunoenzimático para la detección de calostro en leche de vaca Immunoenzymatic test for colostrum detection in cow s milk S.L. María de Luna 11, Nave Zaragoza (SPAIN) Telephone/Fax: G-COM-CK.01 MAYO-03 Rev.0

2 ESPAÑOL INTRODUCCION Y OBJETIVO El calostro es una secreción de la glándula mamaria que se produce durante los primeros días tras el parto y cuya misión es conferir la protección inmunitaria a los animales recién nacidos durante los primeros meses de su vida. Es por ello, que la composición del calostro es muy diferente a la de la leche, siendo las diferencias especialmente marcadas en la fracción proteica. Mientras en la leche el 70-80% de las proteínas son caseínas, en el primer calostro estas proteínas tan solo suponen 20% del nitrogeno proteico total. Además, la concentración de las proteínas de origen sérico, que son las responsables de algunos problemas tecnológicos, aumenta entre 50 y 120 veces respecto a su nivel habitual en la leche. La legislación española, así como la de otros muchos países, exige que la leche de consumo no contenga calostro, es decir, que dicha secreción no se mezcle con las leches de consumo. En algunos casos como la legislación francesa, se precisa además que la leche secretada por la vaca durante los 7 primeros días después del parto no puede utilizarse para consumo humano (Decreto 25 Marzo 1924). El motivo de esta restricción es principalmente debido a la diferente composición y características respecto a la leche definitiva ya que éstas repercuten en la calidad higienico-sanitaria y tecnológica de la leche. La presencia de calostro en la leche puede afectar gravemente a la producción y estandarización de algunos productos lácteos. Por ejemplo, el calostro presenta altas concentraciones de algunas proteínas con propiedades antibacterianas y de esta forma, su presencia puede impedir el crecimiento de la flora bacteriana responsable de la fermentación de quesos y leches fermentadas, reduciendo los rendimientos queseros y alterando las propiedades organolépticas de dichos productos. Además, la presencia de calostro en la leche genera problemas en la limpieza y mantenimiento de los equipos tecnológicos, como los intercambiadores de calor, evaporadores y desecadores, debido al incremento en la proporción de proteínas solubles en la leche. Dichas proteínas se desnaturalizan fácilmente sedimentando sobre la superficie de los equipos tecnológicos. COMPONENTES DEL KIT 1 x Placa microtiter de 96 tests (12 tiras de 8 pocillos). 4 x Patrones de IgG (A,B,C,D). 1 x Solución stock de Conjugado x x Solución de Sustrato/Cromógeno (TMB). 1 x Solución stop (Acido sulfúrico 1M). Corrosivo! 1 x Solución de dilución del conjugado. MATERIAL ADICIONAL Micropipetas Espectrofotómetro para placas de ELISA ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO Los componentes deben almacenarse a 4-7ºC en oscuridad. El kit conservado en óptimas condiciones tiene una estabilidad de 6 meses. 2

3 ESPAÑOL SEGURIDAD Es recomendable el seguimiento de unas buenas prácticas de laboratorio (BPL) y el empleo de ropa y material de seguridad adecuados en el desarrollo del test. Evitar el contacto directo con la piel. No ingerir. Puede solicitar la HOJA DE SEGURIDAD a su distribuidor. PRINCIPIO DE LA TECNICA CALOKIT es un ensayo inmunoenzimático directo tipo ELISA sandwich, basado en la detección de la IgG mediante anticuerpos específicos. CALOKIT ha sido diseñado para la cuantificación de esta proteína de origen sérico, que se encuentra en el calostro a una concentración veces superior respecto a la leche. Con este procedimiento y teniendo en cuenta la concentración de IgG promedio en la leche durante la lactación del animal, es posible detectar la mezcla del calostro procedente de un animal en la leche de un rebaño de hasta 50 individuos. Calokit permite cuantificar de una forma precisa la concentración de inmunoglobulinas en la leche. El criterio final para determinar si una leche contiene calostro es fijado en algunos países por su legislación, para el resto se puede considerar como criterio general que la leche con un contenido superior a 1-2 g/l de IgG ha sido mezclada con secreciones calostrales. Este test también puede utilizarse en la gestión de las explotaciones ganaderas. La cuantificación de las inmunoglobulinas aporta un criterio objetivo a la hora de diferenciar la leche que puede ser enviada a cisterna de aquella que debe ser separada para la alimentación de los terneros. PREPARACION DE MUESTRAS Y REACTIVOS Preparación de los patrones: Diluir 1/100 los patrones de IgG (A, B, C, D) con agua destilada. Para ello, mezclar 1 volumen del patrón correspondiente con 99 volumenes de agua destilada. Por ejemplo: 0,1 ml de patrón más 9,9 ml de agua destilada. Importante: los patrones siempre deben ser utilizados con este factor de dilución para una correcta interpretación de los resultados. Es aconsejable incluir un control negativo de agua destilada, que se utilizará como patrón 0 en la curva de calibrado. Preparación de las muestras de leche (dilución final 1/2000): La dilución de las muestras se realiza en 2 etapas. Una dilución inicial 1/100 con agua destilada, por ejemplo, mezclar 0,1 ml de leche y 9,9 ml de agua y seguidamente se realiza una segunda dilución 1/20 en agua destilada. Por ejemplo, 0,050 ml de la dilución inicial más 0,950 ml de agua destilada. Preparación de la solución de conjugado: Preparar sólo el volumen de solución necesario para el ensayo. Para ello, mezclar 1 volumen de la solución stock de conjugado con 19 volúmenes de la solución de dilución del conjugado. Por ejemplo, para analizar 8 muestras, es necesario 0,4 ml (0,05 ml/pocillo) de la solución de conjugado. 0,5 ml de esta solución se prepara mezclando 0,025 ml de la solución de stock de conjugado con 0,475 ml de la solución de dilución del conjugado. 3

4 ESPAÑOL PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO 1. Sacar de la bolsa la placa con las tiras que van a ser utilizadas. Guardar en la bolsa el resto de tiras. Acondicionar a temperatura ambiente todos los reactivos y pocillos que van a ser empleados al menos 30 minutos antes de comenzar el ensayo. 2. Aplicar en cada pocillo de la placa 0.05 ml de muestra o patrón previamente diluidos. Incubar a 20-24ºC durante 30 minutos. 3. Eliminar el líquido de los pocillos volcando la placa sobre un recipiente. Para asegurarse de que el líquido es completamente eliminado, se puede golpear la placa con los pocillos mirando hacia abajo sobre un papel absorbente/secamanos. 4. Lavar cada pocillo con 0,3 ml de agua destilada (es decir, llenando hasta arriba el pocillo) y eliminar el agua como en el paso 3. Repetir este lavado una o dos veces más. Evitar que se mezcle el agua de lavado entre los pocillos durante esta etapa. 5. Aplicar en cada pocillo 0.05 ml de solución de conjugado. Incubar a 20-24ºC durante 30 minutos. 6. Repetir 4 veces la secuencia de lavados como en los pasos 3 y Aplicar en cada pocillo 0.05 ml de la Solución de sustrato/cromógeno y dejar desarrollar el color azul 30 minutos a 20-24ºC. 8. Añadir en cada pocillo 0.05 ml de la solución stop para parar la reacción. Mezclar bien dando unos golpes suaves en el borde lateral del marco. 9. Leer la absorbancia de cada pocillo a una longitud de onda de 450 nm con un espectrofotómetro para placas microtiter. Utilizar como referencia el aire. Leer durante los 30 minutos siguientes a la parada de la reacción. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS DE LECHE 0,050 ml del tubo 1 0,050 ml/pocillo del tubo 2 0,100 ml leche 9,9 ml H 2O TUBO 1 dilución 1:100 0,950 ml H 2O TUBO 2 dilución 1:2000 PLACA MICROTITER 4

5 ESPAÑOL CALCULO E INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Para calcular la concentración de IgG de cada muestra problema se representa gráficamente la absorbancia de los patrones (Eje Y) en función de la concentración de IgG de cada patrón según se muestra en la tabla 1 (Eje X). A partir de la curva obtenida, se interpola el valor de absorbancia de cada muestra y se determina su concentración de IgG. Absorbancia (Eje Y) Concentración de IgG (Eje X) Para muestras que se han diluido 1/2000, la concentración final de los patrones corresponderá a la que se muestra en la segunda columna de la tabla 1 (1/2000). Las muestras que den valores de absorbancia superiores a la absorbancia del patrón de mayor concentración están fuera del rango de detección. Estas muestras deben ser diluidas usando el siguiente rango (1/5000) y procesadas en un nuevo ensayo. En este caso, la concentración final de los patrones corresponderá a la tercera columna de la tabla 1. Si se prevee que la concentración de IgG en las muestras problema es muy elevada o al contrario, se desea fijar un nivel de detección inferior, se recomienda utilizar otros factores de dilución para dichas muestras siguiendo las indicaciónes de la tabla 1 o bien contactar con Z.E.U.-INMUNOTEC para obtener las indicaciones precisas al respecto. La dilución de los patrones debe ser en todos los casos 1/100. Patrón Factor de dilución de la muestra IgG (mg/ml) 1/1000 1/2000 1/5000 1/10000 A B C D Tabla 1. Concentración de IgG (mg/ml) que debe tenerse en cuenta para cada patrón (A, B, C, y D) en función de la dilución utilizada para analizar las muestras de leche. 5

6 ESPAÑOL ADVERTENCIAS GENERALES a) Las tiras de los pocillos vienen secas en una bolsa cerrada. Una vez abierta la bolsa, se deben sacar sólo los pocillos que se van a utilizar. El resto se deben dejar en la bolsa cerrada a 4ºC. b) La solución de substrato/cromógeno es sensible a la luz por lo que se debe evitar la exposición directa a ésta. Cerrar el tubo después de usarlo. Como es una solución lista para usar, para evitar que se contamine con algún catalizador y vire a color azul, es conveniente no pipetear directamente del tubo con una punta de pipeta usada. Por tanto, se recomienda trasvasar a otro tubo o envase la cantidad de solución que se va a utilizar para el ensayo. c) Entre etapa y etapa del procedimiento de análisis, no se debe dejar secar completamente los pocillos. d) Cuando se desea realizar un cálculo más preciso, es conveniente analizar por duplicado las muestras y patrones. e) Cuando se va a emplear el kit, éste se debe acondicionar a temperatura ambiente. Nada más terminar de utilizarlo, el kit debe guardarse en la nevera. f) Los tests pueden realizarse con leche fresca, leche desnatada, lactosuero, leche pasteurizada, o leche almacenada en frío pero no con leche que haya sido sometida a un proceso de calentamiento que pueda desnaturalizar las proteínas lácteas. g) Las muestras, patrones y todas las soluciones deben ser añadidas siempre con micropipeta para conseguir más precisión. h) La solución de conjugado, una vez preparada, es estable varios días por lo que se puede preparar la cantidad necesaria para toda la semana. i) Muy importante: Un lavado incompleto de los pocillos puede originar falsos positivos. En este caso, se puede aumentar el número de lavados de la muestra y del conjugado para mejorar los resultados. j) La temperatura óptima de análisis debe situarse entre 20-24ºC. Temperaturas por encima o por debajo pueden originar curvas de calibrado que no conserven la linearidad o curvas con absorbancias más bajas de lo normal respectivamente. Si se observa alguna anomalía, contactar con Z.E.U.-INMUNOTEC, S.L. o con su distribuidor habitual. **** CALOKIT es un test de diagnóstico in vitro. Los análisis que pudieran tener una implicación de tipo legal deberían confirmarse mediante un procedimiento oficial y realizarse por duplicado o triplicado. Z.E.U.-INMUNOTEC no asume ninguna responsabilidad legal. 6

7 ENGLISH INTRODUCTION AND OBJECTIVE Colostrum is a secretion of the udder produced during first days after calving. Its mission is to confer immunitary protection for the cattle calves during the first months of their life. Colostrum composition is very different from that of raw milk. Main differences are their protein composition. While 70-80% of proteins in raw milk are caseins, in the first colostrum, caseins are only the 20%. Besides, whey protein concentration, responsible for some technological problems, rise from 50 to 120 times with regards to its usual level. Colostrum presence in milk can damage gravely production and standardization of dairy products. For instance, colostrum presents high concentration of some proteins with antimicrobial properties. Thus, colostrum can prevent bacterial growth responsible of cheese and milk fermentation, reducing acidification rate and altering organoleptical properties of such products. Besides, colostrum presence in milk generates problems in the cleaning and maintenance of technologic equipment, such as heat transfer, driers and pasteurizers, because of the increase in the soluble proteins ratio. Soluble proteins are denatured easily precipitating on the surfaces of the technological equipment. KIT COMPONENTS 1 x Microtiter plate for 96 tests (12 strips of 8 wells) 4 x IgG standards (A,B,C,D) 1 x Conjugate Stock Solution x x Substrate/Chromogen Solution (TMB). 1 x Stop Solution (Sulfuric acid 1M) Corrosive! 1 x Conjugate dilution solution. ADDITIONAL MATERIAL Micropipettes Photometer for ELISA assays STABILITY AND STORAGE Kit components should be stored at 4-7 ºC in darkness. Kit keeps stability for 6 months if is stored correctly. SAFETY Good laboratory practice should be employed when using this kit. Safety clothing should be worn and skin contact with reagents avoided. Do not ingest. A SAFETY DATA SHEET is available by request from your distributor. 7

8 ENGLISH PRINCIPLE OF THE ASSAY CALOKIT is a non competitive ELISA assay (sandwich), based on the immunoglobulins detection by means of specific antibodies. CALOKIT has been designed for quantitation of these soluble proteins (IgGs) whose concentration in colostrum is times higher than milk. With this procedure it is possible to detect the colostrum added from an animal to the milk from a herd of at least 50 animals. CALOKIT can quantify with precision the concentration of IgG in milk. Criteria for determining colostrum presence in milk is established by legislation in some countries, but can be considered as a general criteria that milk with a IgG concentration higher than 1-2 g/l has been adulterated with colostrum. This test can also be used in the management of the dairy farms. Quantitation of immunoglobulins is an objective criteria to difference milk which is driven to tanks from milk that should be separated forthe calves feeding. PREPARATION OF SAMPLES AND REAGENTS Preparation of standards: Dilute the standards (A, B, C, D) 1/100 with distilled water. Mix 1 volume of each standard with 99 volumes of distilled water. For instance: 0.1 ml of standard with 9,9 ml of distilled water. Important (for a good interpretation of the result): Standards must be always used with this dilution factor. It is advisable to include a negative control of distilled water as zero standard in the calibration curve. Preparation of milk samples (final dilution 1/2000): The samples dilution is done in two steps. An initial dilution 1/100 with distilled water. For example, mixing 0,1 ml of milk and 9,9 ml of water. Then, it must be realized a second dilution 1/20 in distilled water. For example, 0,050 ml of initial solution and 0,950 ml of distilled water. Preparation of conjugate solution: Prepare only the solution volume needed for each assay. Mix 1 volume of conjugate stock solution with 19 volumes of conjugate dilution solution. For example, in order to apply 0,4 ml for 8 wells, (0,05 ml/well) of conjugate solution. 0,5 ml of this solution is prepared by mixing 0,025 ml of conjugate stock solution with 0,475 ml of conjugate dilution solution. 8

9 ENGLISH ASSAY PROCEDURE 1. Bring samples and kit components (only the reagents and strips that are going to be used) to room temperature. Fit the strip holder with the required number of strips. 2. Add 0.05 ml of sample or standard into each well. Incubate at 20-24ºC for 30 minutes. 3. Empty wells by inverting the plate over a waste container and shaking gently. Invert plate and tap firmly on absorbent paper to remove excess liquid. 4. Fill each well with approximately 0,3 ml of distilled water and empty them as in step 3. Repeat the washing step two more times. Avoid cross-contamination between wells during this step. 5. Add 0.05 ml of conjugate solution into each well. Incubate at 20-24ºC for 30 minutes. 6. Repeat 4 times the washing sequence as in steps 3 and Add 0.05 ml of substrate/chromogen solution into each well. Incubate at 20-24ºC for 30 minutes. 8. Add 0.05 ml of stop solution into each well and mix thoroughly. 9. For a quantitative determination. Read the absorbance of each well at 450 nm with a microtiter photometer. Use air as reference blank. Read within 30 minutes after adding stop solution. MILK SAMPLES PREPARATION 0,050 ml of tube 1 0,050 ml/web of tube 2 0,100 ml leche 9,9 ml H 2O TUBE 1 dilution 1:100 0,950 ml H 2O TUBE 2 dilution 1:2000 MICROTITER 9

10 ENGLISH RESULTS CALCULATION AND INTERPRETATION In order to calculate IgG concentration of each sample is needed to plot a graphic representation of standard absorbances (Y axis) versus IgG concentration of each standard (X axis) following indications in table 1. IgG concentration is determined by interpolating absorbance of the samples in the curve. Absorbance (Y axis) IgG concentration (X axis) For instance, for samples that have been diluted 1/2000, the final concentration of standards will be the one on the second column of the table 1. Sample Sample dilution factor IgG (mg/ml) 1/1000 1/2000 1/5000 1/10000 A B C D Table 1. IgG concentration (mg/ml) for each standard (A,B,C,D) in relation to the used dilution of the milk samples. Samples with absorbance values higher than the D standard are out of the detection range. These samples must be diluted using the next range (1/5000) and processed in a new assay. If a very high concentration of IgG is expected or at the contrary, is desirable to fix a lower detection level, is recommended to use other dilution factors for these samples following table 1 indications. You can contact to get the most appropriate information of use. Standard dilutions must be always 1/

11 ENGLISH WARNINGS a) The microtiter plate comes dry in a closed plastic bag. Open it and take out only the strips required with the frame. After this, close the bag with the rest of strips and store them at 4ºC. b) The substrate/chromogen solution is a ready to use solution. Avoid dispensing this solution pipetting directly from the tube because it can be contaminated and turn blue. Protect the reagent from exposure to light and air by storing in the original container until its immediate use. Close the tube after using it. c) Do not allow wells to dry between the steps of the assay. d) For an accurate determination, samples and standards must be analysed in duplicate. e) Bring kit reagents to room temperature before use the kit. Return it to refrigerator after use. f) Samples, standards and all the solutions must be always added using a micropipette for an accuracy determination. g) Very important: Proper aspiration and washing of wells is required in order to obtain accurate, and reliable results. The number of washes can be increased to improve the results. h) The diluted conjugate solution keeps stability several days. It can be prepared for the assays of the same week. i) Heated milk should not be used in this assay because proteins could be denatured and the results would be negative. j) Temperature of analysis should be between 20 and 24ºC. Higher or lower temperatures could produce nonlineal calibration curves or low absorbances respectively. NOTE: 1 ml = µl If some anomaly is observed, contact with Z.E.U.-INMUNOTEC or your regular distributor. **** CALOKIT is an in vitro diagnostic kit for the screening of milk samples. In analysis implicating legal processes, the results should be revaluated with an official reference method., S.L. do not assume any legal responsibility. 11

12 OTROS PRODUCTOS PARA LA INDUSTRIA LECHERA Kit RC para la detección y cuantificación de leche de vaca y de cabra en leche o queso de oveja mediante la técnica ELISA. Kit ECLIPSE para la detección de substancias antibacterianas en la leche. El test está basado en la inhibición del crecimiento bacteriano del Bacillus stearothermophilus. Indicado para leche de vaca, cabra y oveja. Kit IC para la detección rápida de leche de vaca y de cabra en leche o queso de oveja. Solo en 5 minutos! PROTEON: para la detección de proteínas vegetales en leche y productos lácteos mediante la técnica ELISA. PRODUCTS FOR THE DAIRY INDUSTRY RC test: A ELISA test for the detection and quantification of cow s milk (or goat) in sheep s milk or cheese. ECLIPSE: A microbiological test for screening of inhibitors and antibiotics in milk. Eclipse is based on the inhibition of Bacillus stearothermophilus growth. It is indicated for cow, goat and sheep s milk. IC test: Immunochromatographic test for a rapid detection of cow s milk (or goat) in sheep s milk or cheese). Only 5 minutes! PROTEON: ELISA test for the detection of vegetable proteins in milk and dairy products. CONSULTA NUESTRA PAGINA WEB!!! / VISIT OUR WEB SITE!!! 12

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